本发明涉及植物病害生物防治领域，尤其涉及一株高效解淀粉芽孢杆菌及菌剂和应用。
背景技术：
由尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、辣椒疫霉菌(Phytophthora nicotianae)、青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)、根结线虫(Meloidogyne spp.)引起的作物枯萎病，青枯病，根腐病和根结线虫病等毁灭性土传病害，以及灰梨孢菌(Magnaporthe oryzae)、单丝壳白粉菌(Sphaerotheca fuliginea)、胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)、桑锈孢锈菌(Aecidium mori)引起的甜瓜白粉病、芒果炭疽病、水稻稻瘟病、桑树赤锈病等叶面病害给我国农业生产造成巨大损失。化药的使用在短期内能够起到明显的防治效果，但是其存在抗药性、农残等一系列问题，已经无法满足人们的要求，化药在农业生产中的应用越来越受到限制，生物防治是近年发展起来的前沿技术，具有安全，环保的优势，已成为研究热点。
芽孢杆菌(Bacillus sp.)具有耐热、抗紫外线、耐电磁辐射和对某些种类的化学物质引起的不良条件具有耐受性等特性，因此生防芽孢杆菌及其制剂在植物病害防控中具有广阔的应用前景，但由于目前单一菌株存在功能单一局限性，还不能满足生产需求，还需分离具有抗菌谱更广、与其他生防菌具有协同增效作用的菌株，应用此类菌株为多种病害的高效防控提供技术支撑。
技术实现要素：
本发明提供一株高效解淀粉芽孢杆菌，解决现有技术中的解淀粉芽孢杆菌功能单一的问题。
本发明采取的技术方案如下：
本发明提供一株高效解淀粉芽孢杆菌，其拉丁名为Bacillus amyloliquefaciens；菌株号为HW05；保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏机构简称：CGMCC；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏日期：2015年01月04日；保藏中心登记入册编号：CGMCC No.10273
本发明的解淀粉芽孢杆菌在生产菌体和/或代谢物中的应用。
本发明还提供一种菌剂，所述菌剂由本发明的解淀粉芽孢杆菌制备而得。
进一步的，所述菌剂包括本发明的解淀粉芽孢杆菌的菌体和代谢产物中的至少一种。
进一步的，所述菌剂用于防治由病原菌引起的植物病害，所述菌剂用于防治由病原物引起的植物病害，所述的病原物包括尖孢镰刀菌、辣椒疫霉菌、青枯雷尔氏菌、根结线虫、灰梨孢菌、单丝壳白粉菌、胶孢炭疽菌和桑锈孢锈菌，所述植物病害包括香蕉枯萎病、胡椒瘟病、番茄青枯病、香蕉根结线虫病、水稻稻瘟病、甜瓜白粉病、芒果炭疽病和桑树赤锈病。
更进一步的，所述菌剂用于防治由病原菌引起的植物叶面病害，所述病原菌包括灰梨孢菌、单丝壳白粉菌、胶孢炭疽菌和桑锈孢锈菌，所述植物叶面病害包括水稻稻瘟病、甜瓜白粉病、芒果炭疽病和桑树赤锈病。。
本发明还提供一种复合菌剂，所述复合菌剂由本发明的解淀粉芽孢杆菌和淡紫拟青霉E16制备而得。
进一步的，所述复合菌剂包括本发明的解淀粉芽孢杆菌的菌体和代谢物中的至少一种，还包括淡紫拟青霉E16的菌体和代谢物中的至少一种。
进一步的，所述复合菌剂用于防治由病原物引起的植物土传病害，所述的病原物包括尖孢镰刀菌和根结线虫，所述植物土传病害包括香蕉枯萎病和香蕉根结线虫病。
本发明还提供了所述解淀粉芽孢杆菌HW05的分离方法，包括以下步骤：
1)把土壤样本风干混匀，过筛后称取20g放入装有200mL无菌水和玻璃珠的三角瓶中，充分振荡，静置后，按梯度浓度法稀至1×10-2、1×10-3，各梯度稀释液于80℃水浴加热15-20min；
2)制备含有香蕉枯萎病菌(即尖孢镰刀菌)的培养基：吸取500μL尖孢镰刀菌孢子悬浮液涂布至PDA固体培养基上，预培养8-12h；
3)制备含有生防菌淡紫拟青霉E16的培养基：吸取500μL淡紫拟青霉E16孢子悬浮液涂布至PDA固体培养基上，预培养16-24h；
4)初筛：取1mL各梯度土壤稀释液涂布于含有尖孢镰刀菌的培养基，并置于28℃的恒温培养箱下培养2-3天，挑取抑菌圈出现的单菌落纯化，转入LB或NA斜面培养基保存，作为待测菌株用于复筛；
5)复筛：取待测菌接种于LB培养液，置于摇床37℃，150r/min，培养12-24h，取发酵液以离心，取上清，经微孔滤膜过滤，取滤液；用打孔器分别在含有尖孢镰刀菌的培养基和含有淡紫拟青霉E16的培养基的PDA固体培养基上打孔，分别加入待测菌滤液，培养2-3d后，选择在尖孢镰刀菌的培养基上抑菌圈直径最大，同时在淡紫拟青霉E16的培养基上无明显抑菌圈的目标芽孢杆菌菌株，最终得到本发明解淀粉芽孢杆菌。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明解淀粉芽孢杆菌HW05对植物病原物尖孢镰刀菌、辣椒疫霉菌、青枯雷尔氏菌、根结线虫、灰梨孢菌和胶孢炭疽菌具有明显抑制作用，对生防菌淡紫拟青霉E16无明显抑制作用。HW05单独施用对叶面病害甜瓜白粉病、芒果炭疽病、桑树赤锈病具有高效抑制作用，与淡紫拟青霉E16配合后用于防控土传香蕉枯萎病和根结线虫病害具有良好的增效作用，具体表现为在土壤中能有效定殖，降低土壤中的尖孢镰刀菌和根结线虫数量，提高土壤呼吸速率和对植株的促生长。
附图说明
图1-A为本发明实施例一的解淀粉芽孢杆菌HW05的菌落形态；
图1-B为本发明实施例一的解淀粉芽孢杆菌HW05的芽孢形态；
图2-A为本发明实施例四加入清水处理的尖孢镰刀菌菌丝形态；
图2-B为本发明实施例四加入HW05菌剂处理的尖孢镰刀菌菌丝形态；
图2-C为本发明实施例四加入D34菌剂处理的尖孢镰刀菌菌丝形态；
图3-A为本发明实施例四加入清水处理的尖孢镰刀菌孢子形态；
图3-B为本发明实施例四加入HW05菌剂处理的尖孢镰刀菌孢子形态；
图3-C为本发明实施例四加入D34菌剂处理的尖孢镰刀菌孢子形态；
具体实施方式
下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。
本发明实施例所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
本发明实施例所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明实施例所用NA培养液：牛肉浸膏3g/L，酵母浸膏1g/L，蛋白胨5g/L，葡萄糖10g/L，用蒸馏水定容，其pH为7.0。
本发明实施例所用LB培养液：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L，用蒸馏水定容。
本发明实施例所用LB培养基是在上述LB培养液中加入琼脂得到的固体培养基。
本发明实施例所用PDA培养液：马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L。
本发明实施例所用PDA培养基：是在上述PDA培养液中加入琼脂(15g/L)得到的固体培养基。
本发明实施例中的镰刀菌选择性培养基：见文献(景晓辉,吴伦英,区小玲,朱利林,薛玉潇,吴琳,黄俊生.一种简便分离香蕉枯萎病菌的选择性培养基[J].热带作物学报,2009,30(11):1671-1673.)。
本发明实施例中的淡紫拟青霉选择性培养基：见文献(任文彬,蒋桂芳,张世清,黄俊生.发酵条件对拟青霉E7菌株产脱乙酰几丁质酶的影响.农业环境科学学报,2006.25(3),812-816.)
土壤中枯萎病菌/淡紫拟青霉的检测方法采用稀释涂布平板法，参照文献(李阜棣，喻子牛，何绍江.农业微生物学实验技术[M].北京:中国农业出版社，1996:32-34，305-306.)。
实施例中涉及到的尖孢镰刀菌、辣椒疫霉菌、青枯雷尔氏菌、根结线虫、胶孢炭疽菌、灰梨孢菌、枯草芽孢杆菌BSA-6、解淀粉芽孢杆菌C10-1、解淀粉芽孢杆菌bwa7和解淀粉芽孢杆菌D34均由中国热带农业科学院环境与植物保护研究所提供，可由现有技术中的常规方法获得。
枯草芽孢杆菌BSA-6的公开文献：潘江禹.枯草芽胞杆菌BSA-6防控香蕉枯萎病初步研究[D].海南大学.2013，海南海口。
解淀粉芽孢杆菌C10-1的公开文献：曹红.香蕉枯萎病拮抗菌C10-1的鉴定及生防潜力评价[D].华中农业大学.2013，湖北武汉。
解淀粉芽孢杆菌bwa7的公开文献：薛玉箫.解淀粉芽孢杆菌bwa7在香蕉上的定殖及其生防机制的初步研究[D].海南大学.2012，海南海口。
尖孢镰刀菌和解淀粉芽孢杆菌D34的公开文献：曹智淳.构建香蕉枯萎病拮抗芽胞杆菌多重筛选体系及防效研究[D].海南大学,2016，海南海口。
淡紫拟青霉E16的公开文献：黄俊生，汪军，梁昌聪，邓国平，任文彬，郭立佳.一株淡紫拟青霉及其应用(ZL201210358765.3)。
实施例一、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)HW05的分离及鉴定
1、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)HW05的分离
从中国海南省文昌红树林淤泥土壤中，采集土样，把土壤样本风干混匀，过筛后称取20g放入装有200mL无菌水和玻璃珠的三角瓶中，充分振荡10min，静置5min后，按梯度浓度法稀至1×10-2、1×10-3，各梯度稀释液于80℃水浴加热15-20min。
制备含有香蕉枯萎病菌(即尖孢镰刀菌)的培养基：取尖孢镰刀菌孢子悬浮液(约1.6×105个/mL)，吸取500μL孢子悬浮液涂布至直径为15cm的培养皿中的PDA固体培养基上，预培养8-12h。
制备含有生防菌淡紫拟青霉E16的培养基：取淡紫拟青霉E16孢子悬浮液(约1.8×105个/mL)，吸取500μL孢子悬浮液涂布至直径为15cm的培养皿中的PDA固体培养基上，预培养16-24h。
1)初筛
取1mL各梯度土壤稀释液涂布于含有尖孢镰刀菌的培养基，并置于28℃的恒温培养箱下培养2-3天，挑取抑菌圈出现的单菌落纯化，转入LB或NA斜面培养基保存，作为待测菌株用于复筛。
2)复筛：取待测菌接种于LB培养液，置于摇床37℃，150r/min，培养12-24h，取2mL发酵液离心(12000r/min，离心15min)，取上清，经0.22μm微孔滤膜过滤，取滤液。用直径6mm的打孔器分别在含有尖孢镰刀菌的培养基和含有淡紫拟青霉E16的培养基的PDA固体培养基上打孔，分别加入待测菌滤液，培养2-3d后观察抑菌圈透明度，计算抑菌圈直径、重复3次，选择在含有尖孢镰刀菌的培养基上抑菌圈直径最大，同时在淡紫拟青霉E16的培养基上无明显抑菌圈的目标芽孢杆菌菌株，最终得到解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)HW05。
2、(Bacillus amyloliquefaciens)HW05CGMCC No.10273的鉴定
(1)形态学鉴定
将分离纯化到的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)HW05CGMCC No.10273菌株接种于LB培养基上，37℃培养8h，观察菌落形态。另取培养48h的菌落，适当稀释后于显微镜下观察。结果显示解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)HW05CGMCC No.10273菌株在LB培养基前期为圆形、乳白色、边缘平滑整齐，后期为近圆形、淡黄色、表面干燥形成皱褶、不透明、边缘略凸起，如图1-A。革兰氏染色阳性，菌体短杆状，产芽孢，芽孢卵圆形，如图1-B。
(2)分子鉴定
解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)HW05CGMCC No.10273的16S rDNA全序列如序列表中的序列1(SEQ ID NO:1)所示，全长为1457bp。
(3)具有合成拮抗作用的脂肽类功能基因
通过聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)方法检测发现解淀粉芽孢杆菌HW05具有合成拮抗作用的脂肽类功能基因，提取解淀粉芽孢杆菌HW05的DNA，参照文献报道的引物，以HW05 DNA为模板扩增脂肽类功能基因，发现HW05含有脂肽类抗生素sur3、ituA、ituB、ituC、ituD、fenB、fenE、bam的生物合成相关基因。
所用引物参照文献中的方法制备：程凯.防治土传棉花黄萎病微生物有机肥研制与生物效应研究[D].南京:南京农业大学,2010；李慧.解淀粉芽孢杆菌及其生物合成环脂肽抗生素条件研究[D].南京:南京大学,2012；Athukorala S N P,Fernando W G D,Rashid K Y.Identification of antifungal antibiotics of Bacillus species isolated from different microhabitats using polymerase chain reaction and MALDI-TOF mass spectrometry[J].Canadian journal of microbiology,2009,55(9):1021-1032.
实施例二、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)HW05 CGMCC No.10273具有抗硫酸链霉素和氨苄青霉素的活性
通过抗生素标记实验可诱导HW05同时具有抗硫酸链霉素和氨苄青霉素抗性，在同时含有硫酸链霉素300μg/mL和氨苄青霉素100μg/mL的LB培养基上能稳定生长和保持拮抗尖孢镰刀菌等病原物的活性。由于其具有硫酸链霉素和氨苄青霉素抗性特性，可以与抗生素共同使用，以便起到抗自然界中的细菌污染的作用，有利于规模化发酵生产HW05菌株和HW05菌剂，使其在作为菌剂应用中能抗细菌的污染，同时有利于检测HW05在田间的存活能力。这也是本发明解淀粉芽孢杆菌HW05优于现有防控病害用的生防芽孢杆菌等菌株的特性。
实施例三：由解淀粉芽孢杆菌HW05 CGMCC No.10273制备菌剂的方法：
解淀粉芽孢杆菌HW05CGMCC No.10273制备菌剂的方法：取斜面LB培养基保存的解淀粉芽孢杆菌HW05，划线至LB培养基平板，置于37℃，培养8h，待长出单菌落后，用接种环挑取HW05接种至装有20mL LB培养液的三角瓶(50mL)内，置于摇床上，在37℃条件下，以160rpm恒温振荡培养2-3h；然后在无菌条件下按照体积百分含量为1％的接种量接入装有500mL LB培养液的三角瓶(500mL)内；接种后的摇瓶在37℃条件下，以160rpm的转速振荡培养14h，获得解淀粉芽孢杆菌HW05发酵液，即菌剂。本实施例的菌剂含有解淀粉芽孢杆菌HW05菌体和代谢产物，在另外一个实施例中，菌剂为解淀粉芽孢杆菌HW05的单一代谢产物或单一菌体，也可以起到本发明的菌剂选择性拮抗病原物的发明效果，菌剂的制备方法不限定本发明菌剂的保护范围。
实施例四、实施例三制备的菌剂对多种病原菌的具有拮抗作用
解淀粉芽孢杆菌D34菌剂的制备方法参考实施例三。
参照实施例一，分别制备含有尖孢镰刀菌、辣椒疫霉、灰梨孢菌、胶孢炭疽菌的PDA培养基，含有青枯雷尔氏菌的LB培养基，在28℃预培养1d后，在距离中央2cm处利用打孔器打孔，分别用移液枪加入20μL实施例三制备的HW05菌剂、D34菌剂，添加等体积清水作为对照，在28℃培养箱培养3d，观察抑菌圈，每实验重复3次。测量其抑菌圈直径(结果见表1)，发现HW05对上述病多种原菌菌均有拮抗活性，可以应用于土传和叶面病害的防治。
同时挑取拮抗圈周围的尖孢镰刀菌丝和孢子置于激光共聚焦显微镜观察发现：
加入清水处理后的尖孢镰刀菌菌丝饱满平滑(图2-A)，加入HW05菌剂处理后的菌丝顶端膨大，顶端宽度减小，有明显致畸作用，(图2-B)，表明HW05菌剂能明显抑制尖孢镰刀菌菌丝的生长，而D34菌剂处理的尖孢镰刀菌菌丝抑制作用不明显(图2-C)。
加入清水处理的尖孢镰刀菌孢子正常萌发(图3-A)；加入HW05菌剂处理后的尖孢镰刀菌孢子两端膨大，内容物被降解，形成微孔(图3-B)；加入D34菌剂处理主要表现为抑制尖孢镰刀孢子萌发，对孢子无降解作用(图2-C)。
表1
实施例五：实施例三制备的菌剂对香蕉根结线虫的抑制作用
取1mL浓度为120个/mL的根结线虫卵悬浮液，分装至2mL离心管中，再往离心管加入100μL实施例三制备的HW05菌剂。
其中香蕉根结线虫虫卵悬浮液由南方根结线虫(Meloidogyne incongnita)和爪哇根结线虫(Meloidogyne javanica)按照1：1组成。
对照组则分别加入等量无菌水和实施例三制备的D34菌剂。每个实验重复3次，统计卵孵化率，结果见表2。
卵孵化率(％)＝[孵化幼虫数/(孵化幼虫数+未孵化卵粒数)]×100
卵孵化抑制率(％)＝[(对照卵孵化率一处理卵孵化率)/对照卵孵化率]×100
表2
结果表明，到第8d时对照的卵孵化率达92.34％，HW05菌剂处理的卵孵化抑制率达61.21％，优于D34菌剂处理的卵孵化抑制率。
实施例六：实施例三制备的菌剂对淡紫拟青霉E16无明显抑制作用
枯草芽孢杆菌BSA-6菌剂、解淀粉芽孢杆菌C10-1菌剂、解淀粉芽孢杆菌bwa7菌剂、解淀粉芽孢杆菌D34菌剂的制备方法参考实施例三。枯草芽孢杆菌BSA-6菌剂、解淀粉芽孢杆菌C10-1菌剂、解淀粉芽孢杆菌bwa7菌剂、解淀粉芽孢杆菌D34菌剂为实施例三制备的HW05菌剂的对比菌剂，采用平板拮抗法，分别制备含有香蕉枯萎病菌(即尖孢镰刀菌)和淡紫拟青霉E16的PDA培养基，在28℃预培养10-24h后，用打孔器依次等距离各打5个孔，分别在3个孔中各加入20μL实施例三方法制备的菌剂，在其余2个孔中各自加入等量无菌水、无菌LB培养液作为对照，置于28℃培养箱中培养72h，统计其抑菌带宽度。结果如表3所示。
其中，-代表无抑制；+代表弱拮抗，抑菌带宽度1-5mm；++代表较强拮抗，抑菌圈直径5-10mm；+++代表强拮抗，抑菌带宽度>10mm。
表3
结果表明，HW05菌剂对香蕉枯萎病菌有强拮抗作用，对E16菌剂无明显抑制作用；对比菌剂BSA-6菌剂、C10-1菌剂、bwa7菌剂和D34菌剂对香蕉枯萎病菌有强拮抗作用，对E16也有较强抗作用。综上，说明HW05与根结线虫和枯萎病生防菌淡紫拟青霉E16具有兼容性，有利于制备复合菌剂用于对枯萎病和根结线虫病等多种土传病害的高效防控。
实施例七、实施例三制备解淀粉芽孢杆菌HW05菌剂对甜瓜白粉病的的防治作用
对比菌剂D34菌剂制备参照实施例三。
在海南三亚温室大棚微型小区进行，选择发病初期的甜瓜植株，每小区面积1m*12m，分3个处理，(1)清水对照：喷施清水；(2)D34对照：取100mLD34菌剂稀释100倍，喷施；(3)HW05菌剂：取100mL HW05菌剂稀释100倍，喷施。每个处理20株，重复3次。置于温室大棚，常规水肥管理，7d后调查病情指数、防病效果、株高、糖度，结果见表4。
将甜瓜白粉病发病程度统计分为以下5个标准
0级：无病；
1级：病斑面积占整个叶片面积的20％以下；
2级：病斑面积占整个叶片面积的20-50％；
3级：病斑面积占整个叶片面积的50％-70％；
4级：病斑面积占整个叶片面积的70％以上。
病情指数＝100×∑(各级发病株数×该级代表数)/(调查总株数×最高级代表值)
防治效果＝(对照病情指数-实验病情指数)/对照病情指数×100％
表4
结果表明，施用HW05菌剂7d后甜瓜白粉病病斑基本消失，复发较少，说明解淀粉芽孢杆菌HW05对甜瓜白粉病具有很好的防病效果，并且提高了株高和糖度含量。
实施例八：实施例三制备解淀粉芽孢杆菌HW05菌剂对芒果炭疽病的防控作用
对比菌剂D34菌剂制备参照实施例三。
取胶孢炭疽菌孢子悬浮液喷施于芒果离体叶片表面，置于28℃保湿培养，待出现零星病斑，喷施药剂，分三个处理，(1)清水对照：喷施清水；(2)D34菌剂：取100mL D34菌剂稀释100倍，喷施；(3)HW05菌剂：取100mL HW05菌剂稀释100倍，喷施。每个处理20片离体叶片，重复3次。以上处理3d后调查病情指数，计算防治效果，结果见表5。病情指数和防治效果统计参照实施例七。
表5
结果显示，施用HW05 3d后芒果炭疽病的病斑基本消失，复发较少，说明解淀粉芽孢杆菌HW05对芒果炭疽病具有很好的防病效果，达到86.08％，显著优于对比菌株D34。
实施例九、实施例三制备解淀粉芽孢杆菌HW05菌剂对桑树赤锈病的防治作用
对比菌剂D34菌剂制备参照实施例三。
在海南琼中的桑树种植地选择桑树赤锈病发病初期的桑树，分三个处理，(1)清水对照：喷施清水；(2)D34菌剂：取100mL D34菌剂稀释100倍，喷施；(3)HW05菌剂：取100mL HW05菌剂稀释100倍，喷施。每个处理20株，重复3次。以上处理3d后调查病情指数，计算防治效果，采集叶片显微镜观察病斑，结果见表6。病情指数和防治效果统计参照实施例七。
表6
结果表明，施用HW05菌剂3d后桑树赤锈病的病斑基本消失，复发较少，说明解淀粉芽孢杆菌HW05对桑树赤锈病具有很好的防病效果，达到84.07％，显著优于对照菌株D34。
实施例十：解淀粉芽孢杆菌HW05菌剂、淡紫拟青霉E16菌剂及其复合菌剂的制备方法
解淀粉芽孢杆菌HW05菌剂的制备：取斜面NA培养基保存的解淀粉芽孢杆菌HW05，划线至LB培养基平板，置于37℃，培养8h，待长出单菌落后，用无菌牙签挑取HW05接种至装有20mL LB培养液的三角瓶(50mL)内，置可控温摇床上，温度为37℃，160rpm速度，振荡培养2-3h；然后在无菌条件下按照体积比1％的接种量接入装有200mL LB培养液的三角瓶内(500mL)；接种后的摇瓶在37℃条件下，以160rpm的转速振荡培养12-24h，即制得HW05菌剂。
淡紫拟青霉E16菌剂的制备：取斜面PDA培养基保存的淡紫拟青霉E16，划线至PDA培养基平板，置于28℃，培养48h，待长出单菌落后，用无菌牙签挑取E16接种至装有20mL PDA培养液的三角瓶(50mL)内，置可控温摇床上，温度为28℃，150rpm，振荡培养12h；然后在无菌条件下按照体积比为1％的接种量接入装有200mL PDA培养液的三角瓶内(500mL)；接种后的摇瓶在28℃条件下，以160rpm的转速振荡培养48-72h，即制得E16菌剂。。
复合菌剂：取等体积的HW05菌剂和E16菌剂混匀配制而成。
实施例十一：解淀粉芽孢杆菌HW05菌剂和淡紫拟青霉E16菌剂复合协同防治香蕉枯萎病
本实施例选用的HW05菌剂、E16菌剂和复合菌剂分别由实施例十的方法制备而得。
在海南儋州香蕉基地大棚，准备五个各装入无香蕉枯萎病土壤的塑料花盆，进行5个实验组。实验1为空白对照实验，不施用香蕉枯萎病菌(即尖孢镰刀菌)孢子悬浮液，不施用HW05菌剂和E16菌剂，施用200mL清水；实验2为香蕉枯萎病菌对照，施用100mL香蕉枯萎病菌孢子悬浮液，不施用菌剂，施用100mL清水；实验3为HW05菌剂实验，施用100mL香蕉枯萎病菌孢子悬浮液，取100mL HW05菌剂，按105cfu/g土的菌量接入土壤；实验4为E16菌剂实验，施用100mL香蕉枯萎病菌孢子悬浮液，取100mL E16菌剂，按105cfu/g土的菌量土接入土壤；实验5为复合菌剂实验，施入100mL香蕉枯萎病菌孢子悬浮液，取50mL HW05菌剂和50mL E16菌剂混匀后，按105cfu/g土的菌量接入土壤。以上实验土壤处理5d，取各处理土样采用稀释平板计数法，经枯萎病菌选择性培养基检测，待菌剂处理土壤中的香蕉枯萎病菌数量比对照土壤中的香蕉枯萎病菌数量下降至少2个数量级后，移栽5片叶巴西蕉，每个实验组50株，重复3次。
以上实验植物置于温室大棚，常规水肥管理，待对照出现发病症状后，经枯萎病菌选择性培养基检测尖孢镰刀菌数量，拟青霉培养基检测淡紫拟青霉E16数量，经含有硫酸链霉素和氨苄青霉素的LB培养基检测HW05数量，并统计地上、地下部生长指标、土壤呼吸作用、病情指数和防效。
将香蕉枯萎病发病程度统计分为以下5个标准：
0级：植株无枯黄症状。
1级：植株下部叶片出现轻微的枯黄症状，嫩叶完好，少部分根系轻微褐变，茎部出现水渍状褐变。
2级：植株下部叶片出现明显的枯黄症状，但嫩叶完好，根系出现褐变，茎部和假茎部出现水渍状褐变。
3级：整株出现枯黄症状，根系褐变腐烂，茎部和假茎部褐变连片，少数叶柄出现红褐。
4级：整株出现枯萎死亡症状，根系严重褐变腐烂。
病情指数＝100×∑(各级发病株数×该级代表数)/(调查总株数×最高级代表值)
防治效果＝(对照病情指数-实验病情指数)/对照病情指数×100％
解淀粉芽孢杆菌HW05和淡紫拟青霉E16复合协同防治香蕉枯萎病效果如表7、8所示，病情指数越低，防治效果越高。
表7
表8
结果表明：解淀粉芽孢杆菌HW05和淡紫拟青霉E16复合菌剂对香蕉枯萎病具有很好的防病效果和促生作用，HW05和E16在土壤中能有效定殖，并且具有抑制香蕉枯萎病菌数量和提高土壤呼吸速率的作用，采用复合菌剂后的各项指标均优于单一施用HW05或淡紫拟青霉E16，说明解淀粉芽孢杆菌HW05和淡紫拟青霉E16对香蕉枯萎病的防治具有协同增效作用。
实施例十二：解淀粉芽孢杆菌HW05菌剂和淡紫拟青霉E16菌剂复合协同防治香蕉根结线虫
本实施例选用的HW05菌剂、E16菌剂和复合菌剂分别由实施例十的方法制备而得。
在海南儋州铺仔香蕉基地，准备五个各装入无香蕉根结线虫病土壤的塑料花盆，进行5个实验组。实验1为空白对照实验，不接入香蕉根结线虫，不施用HW05菌剂和E16菌剂，施用100mL清水；实验2为香蕉根结线虫对照，接入500条香蕉根结线虫二龄幼虫，不施用菌剂，施用100mL清水；实验3为HW05菌剂实验，接入500条香蕉根结线虫二龄幼虫，取100mL HW05菌剂，按105cfu/g土的菌量接入土壤；实验4为E16菌剂实验，接入500条香蕉根结线虫二龄幼虫，取100mL E16菌剂，按105cfu/g土的菌量土接入土壤；实验5为复合菌剂实验，接入500条香蕉根结线虫二龄幼虫，取50mL HW05菌剂和50mL E16菌剂混匀后，按105cfu/g土的菌量接入土壤。以上实验土壤处理5d，移栽5片叶巴西蕉，每个实验组50株，重复3次。
其中每盆接入的香蕉根结线虫二龄幼虫由南方根结线虫(Meloidogyne incongnita)和爪哇根结线虫(Meloidogyne javanica)按照1：1组成。
以上实验植物置于温室大棚，常规水肥管理，待对照出现发病症状后，检测土壤中根结线虫数量、淡紫拟青霉E16数量(采用拟青霉培养基检测)、HW05数量(经含有硫酸链霉素和氨苄青霉素的LB培养基检测)、地上部和下部生长指标、土壤呼吸作用，统计病情指数和防效。
将香蕉根结线虫发病程度统计分为以下5个标准：
0级：没有根结或卵囊
1级：1-10个根结或卵囊/株
2级：10-20个根结或卵囊/株
3级：20-40个根结或卵囊/株
4级：40个以上根结或卵囊/株
病情指数＝100×∑(各级发病株数×该级代表数)/(调查总株数×最高级代表值)
防治效果＝(对照病情指数-实验病情指数)/对照病情指数×100％
解淀粉芽孢杆菌HW05和淡紫拟青霉E16复合协同防治香蕉根结线虫效果如表9和表10所示，病情指数越低，防治效果越高。
表9
表10
结果表明，解淀粉芽孢杆菌HW05和淡紫拟青霉E16复合菌剂对香蕉根结线虫具有很好的防病效果和促生作用，HW05和E16在土壤中能有效定殖，具有抑制土壤根结线虫数量和提高土壤呼吸速率的作用，采用复合菌剂后的各项指标均优于单一施用HW05或淡紫拟青霉E16，说明解淀粉芽孢杆菌HW05和淡紫拟青霉E16对香蕉根结线虫的防治具有协同增效作用。
实施例十三：解淀粉芽孢杆菌D34菌剂和淡紫拟青霉E16菌剂复合协同防治香蕉枯萎病
使用解淀粉芽孢杆菌D34取代解淀粉芽孢杆菌HW05，参照实施例十制备解淀粉芽孢杆菌D34菌剂、E16菌剂和复合菌剂1，参照实施例十一，分别使用解淀粉芽孢杆菌D34菌剂、E16菌剂和复合菌剂1进行防治香蕉枯萎病实验，实验结果如表11所示，病情指数越低，防治效果越高。
表11
单一施用解淀粉芽孢杆菌D34菌剂或E16菌剂有较好的防病效果，优于混合施用复合菌剂1(D34菌剂与E16菌剂)的防病效果，说明解淀粉芽孢杆菌D34和淡紫拟青霉E16不具有防治香蕉枯萎病的协同增效作用。
实施例十四：解淀粉芽孢杆菌D34菌剂和淡紫拟青霉E16菌剂复合协同防治香蕉根结线虫
使用解淀粉芽孢杆菌D34取代解淀粉芽孢杆菌HW05，参照实施例十制备解淀粉芽孢杆菌D34菌剂和复合菌剂1，参照实施例十二，分别使用解淀粉芽孢杆菌D34菌剂、E16菌剂和复合菌剂1进行防治香蕉根结线虫实验，实验结果如表12所示，病情指数越低，防治效果越高。
表12
结果表明，单一施用解淀粉芽孢杆菌D34菌剂或E16菌剂有较好的防病效果，优于混合施用复合菌剂1(D34菌剂与E16菌剂)的防病效果，说明解淀粉芽孢杆菌D34和淡紫拟青霉E16不具有防治香蕉根结线虫的协同增效作用。
以上内容是结合具体的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换。
序列表
<110> 中国热带农业科学院环境与植物保护研究所
<120> 一株高效解淀粉芽孢杆菌及其菌剂和应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1457
<212> DNA
<213> 解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)
<400> 1
acccatctgt ccaccttcgg cggctggctc cataaaggtt acctcaccga cttcgggtgt 60
tacaaactct cgtggtgtga cgggcggtgt gtacaaggcc cgggaacgta ttcaccgcgg 120
catgctgatc cgcgattact agcgattcca gcttcacgca gtcgagttgc agactgcgat 180
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cactcatcgt ttacggcgtg gactaccagg gtatctaatc ctgttcgctc cccacgcttt 720
cgctcctcag cgtcagttac agaccagaga gtcgccttcg ccactggtgt tcctccacat 780
ctctacgcat ttcaccgcta cacgtggaat tccactctcc tcttctgcac tcaagttccc 840
cagtttccaa tgaccctccc cggttgagcc gggggctttc acatcagact taagaaaccg 900
cctgcgagcc ctttacgccc aataattccg gacaacgctt gccacctacg tattaccgcg 960
gctgctggca cgtagttagc cgtggctttc tggttaggta ccgtcaaggt gccgccctat 1020
ttgaacggca cttgttcttc cctaacaaca gagctttacg atccgaaaac cttcatcact 1080
cacgcggcgt tgctccgtca gactttcgtc cattgcggaa gattccctac tgctgcctcc 1140
cgtaggagtc tgggccgtgt ctcagtccca gtgtggccga tcaccctctc aggtcggcta 1200
cgcatcgtcg ccttggtgag ccgttacctc accaactagc taatgcgccg cgggtccatc 1260
tgtaagtggt agccgaagcc accttttatg tctgaaccat gcggttcaaa caaccatccg 1320
gtattagccc cggtttcccg gagttatccc agtcttacag gcaggttacc cacgtgttac 1380
tcacccgtcc gccgctaaca tcagggagca agctcccatc tgtccgctcg acttgcatta 1440
taggcacgcc gcccctt 1457