本发明属于微藻培养方法，具体地涉及一种基于纸质培养装置的微藻培养方法。
背景技术
化石燃料替代能源的研发，是全世界范围内科学研究的一个重要领域。作为新型燃料中重要的一员，生物柴油无毒，具有良好的润滑性、安全性能和燃烧性能，并可生物降解，对环境友好。因此世界各国都在大力推进生物柴油和生物质能利用的研究。
微藻被认为是唯一可以完全替代化石燃料的生物柴油的原料。利用微藻获得生物柴油，包括微藻的筛选、培养和采收加工等三个重要步骤。虽然微藻的潜力巨大，但使用微藻作为生物能源，仍制约于其规模和成本。
微藻的筛选一般使用固体培养基，其培养条件和油脂积累条件的选择，则常在液体培养基中进行。大批量的培养条件选择实验需要耗费一定的资源。常见的微藻培养方法有开放式大池培养、密闭式光生物反应器、异养培养等，这些培养方法都需要占用较大空间和大量人力物力。同时，微藻个体微小，且在培养液中的浓度很低，采收难度非常大。微藻的采收方法有离心法、絮凝法、泡沫分离法、微滤法等。但其采收的成本仍占其养殖成成本的20％～30％。由于培养和采收微藻，产生的水体和环境污染，也需要进行进一步治理，增加培养成本。
而微藻的固定化生产，可以避免其生长密度小、体积大、采收困难等缺点，有非常良好的前景。但微藻的固定化技术仍不完善，有固定化材料造价高等缺点。因此亟需一种成本低廉，使用很少的实验空间和少量微藻，就可进行培养条件和油脂积累条件选择等实验。同时，培养出的微藻密度很高，无需后期采收，对环境不造成污染的微藻培养方法。
技术实现要素：
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种对环境友好，可减少实验研究和生产成本的基于纸质培养装置的微藻培养方法。
本发明的技术方案概述如下：
一种基于纸质培养装置的微藻培养方法，包括如下步骤：
1)设计培养装置图形，培养装置图形为中间有圆形(1)分布的矩形；
2)使用喷蜡打印机，按照步骤1)的设计，向滤纸上喷蜡打印，打印的蜡是位于矩形除圆形处以外的部分(2)；
3)将喷蜡打印后的滤纸放加热，使蜡穿透滤纸，得纸质培养装置，将滤纸的喷蜡打印的一面称为a面，另一面称为b面；
4)微藻的培养：将第一种琼脂水溶液滴在步骤3)获得的纸质培养装置b面的圆形处；将加入了微藻的第二种琼脂水溶液滴在步骤3)获得的纸质培养装置a面的圆形处，a和b面的琼脂凝结；
5)将步骤4)获得的装置b面浸于含有bg-11培养液的玻璃培养皿中，培养；
所述第一种琼脂水溶液用下述方法制成：取0.8-1.5g琼脂加水至100ml，混匀，加热溶解；
所述第二种琼脂水溶液用下述方法制成：取0.1-0.5g琼脂加水至100ml，混匀，加热溶解。
圆形的个数为6-96个，优选6、12、24、48或96个。
滤纸优选定性滤纸或定量滤纸。
步骤(4)培养的条件为：在20-35℃，光照4-8天。
本发明的优点：
1.利用纸质的培养装置对微藻进行培养，简化操作，减少所需空间，并降低成本。
2.使用少量微藻，即可进行培养条件和油脂积累条件的选择。
3.便于进行重复性实验。
4.微藻固定化培养，无需采收，单位面积产量大。
5.本发明所用技术可用于所有海洋微藻及淡水微藻等原料，只需根据不同微藻的大小，使用不同密度的凝胶进行固定。
6.本方法对环境不造成污染。
附图说明
图1为有24个圆形的培养装置图。
图2为纸质培养装置对微藻进行培养示意图。
图3为在纸质培养装置上进行微藻培养第0天和第5天的培养结果。
图4为单种盐对微藻生长的影响。
具体实施方式
为了使本发明的技术方案及特点更加清晰，以下结合附图和具体实施方式，对本发明作进一步说明。此处描述的具体实施例仅用于解释本发明，但并不限定本发明的保护范围。
本发明对喷蜡打印机不进行限定，所使用的喷蜡打印机包括：xeroxcolorqube8580，xeroxcolorqube8700，xeroxcolorqube8880或xeroxcolorqube8900。本发明各实施例使用的是xeroxcolorqube8700。
微藻desmodesmusbrasiliensis，2015年10购于中科院水生所藻种库。
本发明以desmodesmusbrasiliensis作为微藻的例子，但这一微藻并不对本发明进行限定，实验证明，使用其它的微藻也可以用本发明的装置进行培养。
实施例1
一种基于纸质培养装置的微藻培养方法，见图1，图2，包括如下步骤：
1)在电脑上设计培养装置图形，培养装置图形为中间有24个圆形1分布的矩形，圆形的直径为5.0mm；
2)使用喷蜡打印机，按照步骤1)的设计，向定性滤纸上喷蜡打印，打印的蜡是位于矩形除圆形处以外的部分2；
3)将喷蜡打印后的滤纸放在加热盘中，在140℃加热3分钟，使蜡穿透滤纸为疏水区域，圆形处为亲水区域，得纸质培养装置，将滤纸的喷蜡打印的一面称为a面，另一面称为b面；
4)微藻(desmodesmusbrasiliensis)的培养：将第一种琼脂水溶液20μl滴在步骤3)获得的纸质培养装置b面的圆形处；将加入了微藻的第二种琼脂水溶液(在bg-11培养液中培育的微藻液(od4.2)与第二种琼脂水溶液按体积比1：4的比例混合)取10μl滴在步骤3)获得的纸质培养装置a面的圆形处；
5)将步骤4)获得的装置b面浸于含有10mlbg-11培养液的90mm玻璃培养皿中，在25℃，光照强度2000lx，光照5天培养，对微藻进行采收(取出24个圆形的纸质培养装置进行干燥)，得到的od大于8.0，见图3。
第一种琼脂水溶液用下述方法制成：取1.0g琼脂加水至100ml，混匀，加热溶解；
第二种琼脂水溶液用下述方法制成：取0.3g琼脂加水至100ml，混匀，加热溶解。
该微藻密度很高，均附着在琼脂凝胶中，无需离心或絮凝等方式进行微藻采收。在节省采收成本的同时，防止使用絮凝剂对水体造成的污染。同时，由于微藻只存在于凝胶中，因此该培养液可重复使用。
培养装置图形中的每一个圆形相当于传统锥形瓶培养的一个锥形瓶；一个24个圆形的纸质培养装置，就相当于24个锥形瓶。因此本发明的方法可以大大节省培养空间和材料消耗。
实施例2
一种基于纸质培养装置的微藻培养方法，包括如下步骤：
1)在电脑上设计培养装置图形，培养装置图形为中间有6个圆形分布的矩形；圆形的直径为7.8mm；
2)使用喷蜡打印机，按照步骤1)的设计，向定性滤纸上喷蜡打印，打印的蜡是位于矩形除圆形处以外的部分；
3)将喷蜡打印后的滤纸放在加热盘中，在120℃加热5分钟，使蜡穿透滤纸为疏水区域，圆形处为亲水区域，得纸质培养装置，将滤纸的喷蜡打印的一面称为a面，另一面称为b面；
4)微藻(desmodesmusbrasiliensis)的培养：将第一种琼脂水溶液15μl滴在步骤3)获得的纸质培养装置b面的圆形处；将加入了微藻的第二种琼脂水溶液(在bg-11培养液中培育的微藻液(od4.2)与第二种琼脂水溶液按体积比1：4的比例混合)取15μl滴在步骤3)获得的纸质培养装置a面的圆形处；
5)将步骤4)获得的装置b面浸于含有10mlbg-11培养液的90mm玻璃培养皿中，在20℃，光照强度2000lx，光照8天培养，对微藻进行采收(取出6个圆形的纸质培养装置进行干燥)，得到的od大于8.0。
第一种琼脂水溶液用下述方法制成：取0.8g琼脂加水至100ml，混匀，加热溶解；
第二种琼脂水溶液用下述方法制成：取0.1g琼脂加水至100ml，混匀，加热溶解。
实施例3
一种基于纸质培养装置的微藻培养方法，包括如下步骤：
1)在电脑上设计培养装置图形，培养装置图形为中间有96个圆形分布的矩形；圆形的直径为5.0mm；
2)使用喷蜡打印机，按照步骤1)的设计，向定量滤纸上喷蜡打印，打印的蜡是位于矩形除圆形处以外的部分；
3)将喷蜡打印后的滤纸放在加热盘中，在150℃加热0.5分钟，使蜡穿透滤纸为疏水区域，圆形处为亲水区域，得纸质培养装置，将滤纸的喷蜡打印的一面称为a面，另一面称为b面；
4)微藻(desmodesmusbrasiliensis)的培养：将第一种琼脂水溶液15μl滴在步骤3)获得的纸质培养装置b面的圆形处；将加入了微藻的第二种琼脂水溶液(在bg-11培养液中培育的微藻液(od4.2)与第二种琼脂水溶液按体积比1：4的比例混合)取15μl滴在步骤3)获得的纸质培养装置a面的圆形处；
5)将步骤4)获得的装置b面浸于含有10mlbg-11培养液的90mm玻璃培养皿中，在35℃，光照强度2000lx，光照4天培养，对微藻进行采收(取出96个圆形的纸质培养装置进行干燥)，得到的od大于8.0。
第一种琼脂水溶液用下述方法制成：取1.5g琼脂加水至100ml，混匀，加热溶解；
第二种琼脂水溶液用下述方法制成：取0.5g琼脂加水至100ml，混匀，加热溶解。
实施例4
单盐浓度实验
1)、2)、3)同实施例1步骤1)、2)、3)；
4)微藻(desmodesmusbrasiliensis)的培养：将第一种琼脂水溶液20μl滴在步骤3)获得的纸质培养装置b面的圆形处；将在bg-11培养液中培育的微藻液进行离心，除去培养液，将微藻重悬在超纯水中，得到od4.0微藻液，将所述微藻液和第二种琼脂水溶液按体积比1：4的比例混合，取10μl滴在步骤3)获得的纸质培养装置a面的圆形处，随后在已凝结的微藻胶体上分别滴加一种盐水溶液，滴加的体积均为4μl，
盐溶液：
阳性对照：上述5种盐，各自浓度同上。
阴性对照：水。
5)将步骤4)获得的装置b面浸于含有10mlbg-11超纯水的90mm玻璃培养皿中，在25℃，光照强度2000lx，光照5天培养；对微藻进行采收(取出纸质培养装置进行干燥)，得到的od大于8.0。
第一种琼脂水溶液用下述方法制成：取1.0g琼脂加水至100ml，混匀，加热溶解；
第二种琼脂水溶液用下述方法制成：取0.3g琼脂加水至100ml，混匀，加热溶解。
微藻培养结果如图4所示，三个主要营养物质，p源、n源和c源对比，加入nano3的微藻生长最快，因此n源是该微藻生长的必须营养；加入na2co3的微藻在前期生长较快，后期减慢，可能由于c源的消耗较快；单一的p源加入对微藻的生长没有促进作用。两种微量元素ca和mg对比，加入cacl2的微藻，其生长速度慢于阴性对照，可能由于单一ca离子过多对该种微藻的生长有所抑制，或促进油脂积累；加入mgso4·7h2o的微藻的生长速度也慢于阴性对照，可能由于mg的加入导致叶绿素的累积，从而抑制了微藻的生长。阳性对照加入了5种盐，生长速度最快。
实验证明，各实施例微藻和第二种琼脂水溶液的体积比也可以是选1：5、1：6或1：7等等。