本发明主要属于微流控芯片技术和细胞3d培养技术领域，具体涉及一种基于微流控芯片技术的快速制备不同三维细胞团块并使异种细胞团块之间1:1配对及其共培养的装置和方法。
背景技术
细胞培养是指从生物体中分离组织或细胞，并在模拟体内生理环境的体外条件下使之生存并生长的一种细胞生物学研究方法，也是分子生物学、遗传学、生理学、药物学等诸多学科研究中常用的一项技术。无论是一种或多种细胞的二维单层细胞培养模式均十分方便，细胞也具有良好的生存能力。但体内组织和器官是三维结构，由血液循环系统进行源源不断的灌注。因此，如何在体外条件下更好地模拟体内生理环境，对于细胞培养尤为重要。
三维细胞培养技术是指将具有三维结构不同材料的载体与各种不同种类的细胞在体外共同培养，利用各种方法及材料，使细胞在载体的三维立体空间结构中迁移、生长，构成三维的细胞—载体复合物。更接近于体内生长模式，形成类似体内组织的结构，发挥其功能。
三维培养体系与单层培养时细胞的均一性相比，更能模拟人类完整肿瘤状态，在细胞基因表达、基质分泌及细胞功能活动方面也与体内细胞更为相似。目前，三维细胞培养技术已成为研究肿瘤发生发展机制、肿瘤微环境、肿瘤的耐药性、肿瘤生物学行为，肿瘤血管生成[heissm,etal.thefasebjournal,2015,29,3076-3084.]等的重要平台。三维细胞培养技术在抗癌药物的筛选[mariachatzinikolaidou,drugdiscoverytoday,2016,21,1553-1560.]、组织形成、血管发育等发育生物学的分支领域得到了广泛的应用。
近年来，三维细胞培养作为一项新兴的细胞培养技术，其与二维细胞培养中细胞的平面生长相比，最大的优势在于提供了一个三维的立体微环境，细胞在这个微环境中完成增殖、分化、运动、凋亡等等一系列过程，很大程度模拟了人体微环境中的细胞状态，因而具有极大的可开发性。尤其是在抗肿瘤研究领域，模拟肿瘤微环境，关注肿瘤细胞外基质在肿瘤发生发展过程中的作用成为了一个热点话题。
三维细胞培养技术，恰恰为肿瘤细胞的生长提供了与人体相一致的微环境，因而在为抗肿瘤治疗寻找新靶点等方面具有不可替代的价值，值得进一步的开发和利用。比如，刘文明等利用集成型微流控芯片装置当中的气动微阀来进行3d细胞团块的培养和释放[cn104164360b]；takayama等利用高通量悬滴阵列系统高效获得具有均匀尺寸的类球体，并与各种可商购获得的高通量筛选（hts）系统相容，非常适合于商业化以便被更广泛地使用[cn102947710b]。另外，秦建华等利用集成型微流控芯片配合凹形的底面实现对细胞三维培养和指定管道中释放[cn105733943a]。但是这些技术主要集中在如何实现细胞的3d培养和如何形成一定细胞密度的团块，对于异种团块的研究仅停留在两种细胞悬液混合后形成团块[fennema,e.,etal.,trendsinbiotechnology,31,108-115.]，或者同种细胞团块形成后1:1配对[susienka,m.j.,etal.biofabrication,2016,8,045003.]，但是该方法每次仅能成功配对少量团块，效率不高。而且没有涉及到异种细胞团块形成后1:1配对再共培养并观测融合的动力学过程，从而不能够进一步对配对之后的不同细胞之间的相互作用，细胞行为和细胞分子生物学调控进行研究。
值得注意的是三维细胞团块的应用还处于探索阶段，很多研究集中在用三维细胞团块实现组织3d打印，而面对异种细胞团块的相互反应等方面的研究并不多见。
利用微井阵列微流控芯片装置制备异种三维细胞团块并使其1:1配对，研究异种团块相互融合的反应并将之应用在药物筛选上的发明还未见到报道。
技术实现要素：
针对上述问题，本申请提供了一种基于微井阵列微流控芯片的快速制备不同三维细胞团块并使异种细胞团块之间1:1配对及其共培养的装置及技术，并且该装置能够方便地与现有细胞生物技术相互兼容，如显微成像，细胞染色等。能够方便地实现培养不同三维细胞团块并使异种细胞团块之间1:1配对及其共培养，并能够对细胞进行显微成像分析和药物筛选，得到定量化的结果。为科研人员能够更快速方便地实现培养不同三维细胞团块并使异种细胞团块之间1:1配对及其共培养提供了装置和方法。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种基于微井阵列微流控芯片的装置，所述装置能够用于制备不同三维细胞团块，并能够实现异种细胞团块之间1:1配对及共培养；
所述装置包括带有微井阵列的微流控芯片及围堰，每个微流控芯片的周边配有一个围堰，二者紧密封接在一起；将所述带有微井阵列的微流控芯片及围堰均设置在细胞培养器具上；
不同的微流控芯片中微井的尺寸不同，在所述装置中至少包括两种具有不同微井尺寸的微流控芯片。
进一步地，当所述装置中仅包括两种微井尺寸时，将所述装置划分为第一尺寸装置和第二尺寸装置；第一尺寸装置中，微井直径为70-100μm，深度为70-120μm；第二尺寸装置中，微井直径为120-170μm，深度为180-220μm。通过两种直径微井上分别培养不同的细胞形成三维细胞团块之后，小尺寸微井中培养形成的细胞将形成合适大小的细胞团，从而有利于转移之后高效地形成异种团块之间1:1的配对。
进一步地，所述带有微井阵列的微流控芯片和所述围堰可拆卸地相互匹配，所述带有微井阵列的微流控芯片和所述围堰相互匹配时，所述带有微井阵列的微流控芯片全部在所述围堰内，所述微流控芯片外周长小于所述围堰的内周长。
进一步地，通过将围堰和带有微井阵列的微流控芯片组合，利用分子间作用力（范德华力）能实现可逆转的封接。
进一步地，所述微流控芯片采用光刻技术制备，制作所述微流控芯片的原材料质为聚二甲基硅氧烷（pdms）、聚苯乙烯（ps）、玻璃、琼脂糖、环烯烃共聚物（coc）或聚甲基丙烯酸甲酯（pmma）等高分子材料，具有良好的细胞相容性和环境友好性。
基于微井阵列微流控芯片装置的制备方法，用于制备所述基于微井阵列微流控芯片的装置，利用光刻技术制备微柱阵列，再用具有良好细胞相容性和环境友好性的高分子材料浇筑，做成微井阵列芯片；
制备至少两种具有不同微井尺寸的微井阵列芯片，将所有微井阵列芯片设置在细胞培养器具上；
每个微流控芯片的周边配有一个围堰，组装微井阵列芯片和围堰，将所述带有微井阵列的微流控芯片全部设置在所述围堰内。
一种异种细胞团块之间1:1配对及其共培养的方法，采用所述装置，所述方法采用所述基于微井阵列微流控芯片的装置制备不同的三维细胞团块，并使异种细胞团块之间1:1配对及共培养，所述方法包括以下步骤：
添加细胞的悬浮溶液：将第一种细胞悬浮溶液注入所述第一尺寸装置的围堰中，将第二种细胞悬浮溶液注入所述第二尺寸装置的围堰中；
形成团块：离心力使细胞悬浮溶液中的细胞进入微井中，细胞进入微井中后在微井中形成团块，加上新鲜的培养基继续培养；
使异种团块之间进行1:1配对：将所述第一尺寸装置的微井阵列中的团块冲出来形成团块悬液，吸出所述团块悬液注入所述第二尺寸装置中，离心使所述团块悬液中的团块落入所述第二尺寸装置微井中，使两种团块实现1:1配对，加上新鲜的培养基共培养，观察两种团块的融合情况。
进一步地，在添加细胞的悬浮溶液的步骤之前，在第一尺寸装置及第二尺寸装置的微井阵列上均孵育一层阻止细胞贴壁的物质。
进一步地，添加细胞的悬浮溶液步骤中，所述第一种细胞悬浮溶液为成纤维细胞的悬浮液，所述第二种细胞悬浮溶液为人乳腺癌细胞的悬浮液，细胞浓度均105~106个/毫升。
进一步地，形成团块的步骤中，离心的最佳转数是700~1200转/分钟，离心时间为1分钟；
加上新鲜的培养基继续培养的条件为；细胞培养箱的温度为37℃、二氧化碳体积浓度为0~10%，培养时间为24-96小时。
本发明的有益技术效果：
本发明所述装置基于简单的微井阵列微流控芯片，能够快速制备不同三维细胞团块，只需将细胞悬液加入到围堰内，通过离心，大部分细胞会自动落入微井中，聚集在井底。经过一段时间的培养后，细胞会抱成一团。只需用实验室通用的移液枪将第一个装置的微井中的团块冲出来形成团块悬液，吸出来加入到第二个装置中，经过离心后悬液中的团块会落入第二个装置的微井中并与微井中原来的团块形成1:1配对。这种1:1配对不需要复杂的技术，只需用移液枪把团块从一个装置中移到另一个装置中，没有复杂的技术要求，设备要求，避免时间和金钱的浪费。提高了工作效率的同时，也能到达实验目的，利用本发明能够直观的观察到异种三维细胞团块的相互融合过程及相互作用。
附图说明
图1是微井阵列微流控芯片实物图；
图2是乳腺癌细胞三维团块在直径100μm，深度100μm的微井中的荧光图；
图3是乳腺癌细胞三维团块在直径100μm，深度100μm的微井中的明场图；
图4是成纤维细胞三维团块在直径150μm，深度200μm的微井中的荧光图；
图5是成纤维细胞三维团块在直径150μm，深度200μm的微井中的明场图；
图6是第一种细胞三维团块被加入到第二种细胞三维团块所在的微井中的示意图;
图7是乳腺癌细胞三维团块和成纤维细胞三维团块在微井阵列微流控芯片中1:1配对的荧光图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细描述。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用于解释本发明，并不用于限定本发明。
相反，本发明涵盖任何由权利要求定义的在本发明的精髓和范围上做的替代、修改、等效方法以及方案。进一步，为了使公众对本发明有更好的了解，在下文对本发明的细节描述中，详尽描述了一些特定的细节部分。对本领域技术人员来说没有这些细节部分的描述也可以完全理解本发明。
实施例1
如图1所示，本实施例提供了一种快速制备不同三维细胞团块并使异种细胞团块之间1:1配对及其共培养的装置，包括：微井阵列芯片装置及细胞培养皿或培养板基底；通过光刻技术于硅片上制作微柱阵列，在阵列上方浇筑聚二甲基硅氧烷并加热使其固化，从硅片上揭掉聚二甲基硅氧烷后，聚二甲基硅氧烷上会形成微井阵列。微井阵列聚二甲基硅氧烷芯片和围堰组装之后，设置在细胞培养皿上，在围堰内的微井阵列上孵育一层表面活性剂如pluronicf127(环氧乙烷-环氧丙烷-环氧乙烷嵌段共聚物)等阻止细胞贴壁的物质，进而促使细胞在微井中抱成团。
图1是微井阵列芯片装置实物图，其主要由两部分构成，包括上部分和下部分，下部分包括带有微井阵列的微流控芯片；上部分包括一个适当围堰，芯片和围堰相连并可拆卸的相互匹配，上部与下部配合时使得微井阵列全部在围堰内。
本实施例中微井的俯视图为圆形，但本发明不限于圆形，界面也可以是方形、棱形或其他不规则形状。
图6是第一种细胞三维团块被加入到第二种细胞三维团块所在的微井中的示意图。
这种1:1配对不需要复杂的技术，只需用移液枪把团块从一个装置中移到另一个装置中，没有复杂的技术要求，设备要求，避免时间和金钱的浪费。提高了工作效率的同时，也能到达实验目的，利用本发明能够直观的观察到异种三维细胞团块的相互融合过程及相互作用。
在本实施例中，微井阵列芯片材质为聚二甲基硅氧烷，具有良好的细胞相容性和环境友好性。
为实现上述目的，本发明还提供了一种快速制备不同三维细胞团块并使异种细胞团块之间1:1配对及其共培养的方法，采用上述装置，具体包括以下步骤：
步骤一、制备所述微井阵列芯片装置，其主要由两部分构成，包括上部分和下部分，下部分包括带有微井阵列的微流控芯片，微井有两种不同尺寸，第一种微井直径是100μm，深度100μm，第二种微井直径是150μm，深度200μm；上部分包括一个适当围堰，芯片和围堰相连并可拆卸的相互匹配，上部与下部配合时使得微井阵列全部在围堰内。
步骤二、在去离子水中配成浓度为2%的表面活性剂普兰尼克，滴加所述表面活性剂于所述微井阵列，使整个装置抽真空以保证每个微井中都填满表面活性剂。将其放于超净台中灭菌2小时或以上，保证芯片无菌并使微井表面孵育表面活性剂，阻止细胞贴壁进而形成团块。
步骤三、制备细胞的悬浮溶液并注入孵育一层表面活性剂的微井阵列上方，成纤维细胞的悬浮液注入第一种装置中，乳腺癌细胞的悬浮液注入第二种装置中。离心使悬液中的细胞进入微井中并聚集在微井的底部，离心的最佳转数是800转/分钟，时间为1分钟。将整个装置放入细胞培养箱中培养，细胞培养箱的温度为37℃、二氧化碳体积浓度为5%，培养时间为24-96小时。
步骤四、经过约24小时细胞抱团后，将第一种尺寸装置（如图2和图3所示）中的团块移到第二种尺寸装置（如图4和图5所示）中，离心使第一种团块进入到第二种团块所在的微井中，形成异种细胞团块1:1配对。图6是将第一种团块移到第二种团块所在微井中的过程的示意图。
这种1:1配对不需要复杂的技术，只需用移液枪把团块从一个装置中移到另一个装置中，没有复杂的技术要求，设备要求，避免时间和金钱的浪费。提高了工作效率的同时，也能到达实验目的，利用本发明能够直观的观察到异种三维细胞团块的相互融合过程及相互作用。图7是形成异种细胞团块1:1配对荧光图，上方颜色较亮的细胞团块是乳腺癌细胞，下方颜色较暗的细胞团块是成纤维细胞。
可根据实际研究需要向两种不同尺寸的微阵列芯片装置中注入不同的细胞溶液，本实施例注入的是乳腺癌细胞及成纤维细胞，但不限于此。
其还可用于研究不同药物在异种三维细胞团块相互作用下的作用和功能。
实施例2
本实施例与实施例1基本相同，区别在于，第二个装置中微井的直径为200μm，深度为200μm。