本发明涉及合成生物学、光遗传学等多学科交叉领域，具体涉及一种包括远红光调控基因表达环路控制系统及构建方法应用。
背景技术
合成生物学是以工程学理论为指导，将基因连接成网络，设计和合成各种复杂生物功能模块，让细胞来完成设计人员设想的各种任务的一门综合学科。近年来合成生物学的研究发展很快，已经在多个领域取得重大进展。尤其是在哺乳动物细胞合成生物学领域，人们设计、构建了多种可控的基因遗传电路用于诊断和治疗代谢疾病、癌症、免疫系统疾病等。
在合成生物学与疾病治疗领域中，人工精确调控基因表达的分子开关在疾病治疗中已经成为一种不可或缺的手段。目前世界上已经有很多通过人工调控诱导基因表达的系统，通过化学诱导物或物理的方法来诱导调控基因表达系统。
近年来，通过化学物质来诱导调控基因表达系统也有了很大的发展。例如维生素[weber,w.等.,metabeng,2006,8(3):273-80]、氨基酸[hartenbach,s.等.,nucleicacidsres,2007,35(20):e136]、根皮素[gitzinger,m.等.,procnatlacadsciusa,2009,106(26):10638-43]和对羟基苯甲酸脂[wang,h.等.,nucleicacidsres,2015,43(14):e91]等诱导的调控基因表达系统。这些化学诱导物本身存在一些潜在的问题，例如毒性、多效性、非特异性以及组织渗透性差等。当在体内进行诱导表达时需要向体内注射这些化学诱导剂，会对人体正常的代谢过程产生影响。此外，化学物质在诱导调控基因表达时很难做到在时空上精确调控。
相比于化学物质调控系统，物理方法诱导的调控系统因便捷性、无需体内注射药物等优势越来越受到人们的关注，包括紫外线诱导调控的“囚笼(cage)”技术[keyeswm.等.,trendsinbiotechnology,2003,21(2):53-55]、远红外光控制热激效应诱导调控基因表达系统[kameiy.等.,naturemethods,2009,6(1):79-81]、无线电控制温度感应诱导调控基因表达系统[stanleysa.等.,science,2012,336(6081):604-608]等。这些通过物理的方法诱导基因表达的系统虽然也能诱导基因的表达，但是这些系统通常对细胞的毒性很大，可能会对细胞造成不可逆的伤害甚至使细胞死亡，并且涉及的一些设备装置较昂贵且操作复杂；另外这些系统在应用方面有很大的局限性，会对身体产生巨大的伤害。
光是一种理想的基因表达诱导物。它在自然界中普遍存在，容易获得，具有时空特异性，并且没有毒性。因此利用光作为诱导剂来调控基因表达进而治疗各种疾病的研究非常有应用价值。在我们的前期研究工作中，尝试利用合成生物学的方法设计、合成了蓝光调控转基因表达的基因环路，利用视黑素蓝光系统治疗ii型糖尿病[yeh.等.,science,2011,332(6037):1565-1568]。华东理工大学杨弋教授课题组报道了lighton蓝光调控基因表达开关，利用lov蓝光系统治疗i型糖尿病[wangx.等.,naturemethods,2012,9(3):266-269]。蓝光调控的转基因表达系统虽然不需要向细胞内加入小分子化学物质，但是蓝光用于调控体内基因表达有很大的局限性。蓝光的透皮效率低，不易透过皮肤或腹腔去激活靶基因，极大地限制了光调控系统的临床应用。瑞士苏黎世联邦理工大学生物系统工程系martinfussenegger教授开发了一种远红光调控的转基因表达控制系统[fusseneggerm.等.,naturecommunication,2014,5:5392.]，但是这个远红光控制系统未体现出较好的基因表达强度并且系统表达倍数低，只有十倍左右，限制了光调控系统的临床应用。本发明中远红光调控基因表达环路控制系统是在martinfussenegger教授的远红光系统的基础上优化出的更好的远红光系统版本，本发明优化了系统中处理器的量，本发明还优化了效应器中的启动子。本发明优化后的新型远红光调控基因表达环路控制系统的本底更低(seap的表达量只有1-8u/l)、表达倍数更高(50倍左右)、系统对远红光更加敏感，对以后光调控系统的深层次开发与临床应用更加有利。
糖尿病是当前威胁全球人类健康的慢性流行性疾病之一。随着人们生活水平的提高和生活方式的改变，糖尿病患者的比例逐年增加。糖尿病是一种影响人类健康的慢性终身性疾病，不能彻底治愈，只能控制。患者发病后主要以血糖升高等为主，并且随着病情的加重，将会累及身体各个重要脏器及全身组织，引发多种并发症。但是迄今为止，糖尿病尚无法根治且需终身给药。目前糖尿病的治疗方式主要包括注射胰岛素，服用药物和控制饮食等。糖尿病患者需每天口服降血糖药物或注射胰岛素来维持血糖稳定。但由于这些治疗方式存在一定的局限性，口服降血糖药物或注射胰岛素无法达到可控地释放胰岛素，极易造成低血糖的风险。现亟需寻求一些新的治疗模式来提高治疗效果，降低治疗风险，提高治疗的便捷性。
技术实现要素：
为克服现有技术存在的问题，本发明首次提出了一种新的远红光调控基因表达环路控制系统。本发明中，远红光的光子能量要比蓝光光子能量低很多，对细胞产生的毒副作用要远远小于蓝光。远红光的穿透性远远大于蓝光，可透过皮肤、肌肉组织7-8厘米，可以实现无痕迹地调控移植在腹腔内的靶细胞表达目的基因，甚至可调控体内特定组织器官表达靶基因。并且，本发明远红光控制系统不需要额外添加任何光敏色素就可被远红光直接激活。本发明通过调节所述系统中处理器的量和效应器中的启动子种类，提出了一种新型远红光调控基因表达环路控制系统，其本底更低(seap的表达量只有1-8u/l)，对细胞的毒性更小，系统表达倍数更高(有50倍左右)，系统对远红光更加敏感，对以后光调控系统的深层次开发与临床应用更加有利。本发明所述远红光调控基因表达环路控制系统可以设计不同的目的蛋白表达，用于治疗糖尿病等各种疾病，具有极大的潜在应用价值，可广泛推广于临床应用。
本发明中所述的各核苷酸序列或氨基酸序列均可采用人工合成的方法制备。
本发明提出了一种人工设计、合成的基于远红光调控转基因表达的基因环路控制系统。本发明提供了远红光调控基因表达环路控制系统的真核表达载体、工程化细胞或工程化细胞移植载体。本发明还提供了上述远红光调控基因表达环路控制系统各组分的试剂盒。本发明还提供了一种基于远红光调控的新型糖尿病疗法。本发明可以快速调控基因表达，并且可以调控基因表达量，具有调控表达倍数高、高度时空特异性、强组织穿透力、以及无毒副作用等特点。现有的sting远红光调控基因表达环路控制系统的表达倍数只有10倍左右，而本发明提出的远红光调控基因表达环路控制系统的表达倍数高达50倍，并且表达本底低(seap的表达量只有1-8u/l)，具有极大的潜在应用价值。
本发明提出的远红光调控基因表达环路控制系统，其包括：感受远红光光源的光感受器；处理所述光感受器所传递信号的处理器；应答所述处理器所传递信号的效应器。
本发明光感受器包括表达所述光感受器的启动子；细菌光敏二鸟苷酸环化酶bphs，其编码基因序列如seqidno.1所示；及c-di-gmp的降解酶yhjh，其编码基因序列genebank登录号：ank04038。
本发明中，所述光感受器还可以包括光敏色素合成酶bpho，其编码基因序列如seqidno.2所示。所述光敏二鸟苷酸环化酶bphs，其在远红光条件下将gtp转变为c-di-gmp，所述光敏二鸟苷酸环化酶bphs为最关键蛋白之一，作为光感受器的核心部件。所述光感受器光敏二鸟苷酸环化酶bphs是由bphg蛋白的第1-511位氨基酸和slr1143蛋白的第175-343位氨基酸融合，并且将融合蛋白的587位精氨酸突变为丙氨酸(r587a)制备得到，其编码基因的核苷酸序列如seqidno.1所示；其中，所述bphg蛋白可以来自于类球红细菌(rhodobactersphaeroides)，也可以人工合成，本发明所采用的bphg蛋白由人工合成；所述slr1143蛋白可以来自于集胞藻(synechocystissp.)，也可以人工合成，本发明所采用的slr1143蛋白由人工合成。
其中，所述c-di-gmp的降解酶yhjh来自于大肠杆菌(e.coli.)，也可以人工合成，其编码基因的核苷酸序列genebank登录号：ank04038。所述yhjh具有将c-di-gmp降解为pgpg的功能[ryumh.等.,acssyntheticbiology,2014,3(11):802-810]。其中，所述光敏色素合成酶bpho是存在于类球红细菌(rhodobactersphaeroides)中的血红氧化酶，bpho也可以人工合成，其编码基因的核苷酸序列如seqidno.2所示。其具有合成光敏色素胆绿素(biliverdin)的功能，为bphs合成c-di-gmp提供光敏色素[ryumh.等.,acssyntheticbiology,2014,3(11):802-810]。其中，所述bphs、bpho的氨基酸序列分别如seqidno.18、seqidno.19所示，所述yhjh的氨基酸序列genebank登录号：np_417982。
其中，所述表达光感受器的启动子可以是能够使得光感受器在哺乳细胞中表达的任意启动子，包括但不限于：a)猿猴空泡病毒启动子sv40，其核苷酸序列如seqidno.4所示；b)ef1α(可以是人源的ef1α(hef1α))启动子，其核苷酸序列genebank登录号：ay043301；c)pgk(可以是鼠源的pgk(mpgk))启动子，其核苷酸序列genebank登录号：hz040569；d)巨细胞病毒早期增强子与鸡β-肌动蛋白启动子组合启动子(cag)，其核苷酸序列genebank登录号：hq456319；e)巨细胞病毒启动子cmv，其核苷酸序列genebank登录号：ky199427。
其中，所述处理器包括启动子cmv(巨细胞病毒启动子)，其核苷酸序列genebank登录号：ky199427；以及免疫信号传导分子，所述启动子cmv驱动免疫信号传导分子的表达，所述免疫信号传导分子能与c-di-gmp结合形成二元复合物并使免疫信号传导分子自身活化，所述免疫信号传导分子包括：天然免疫信号传导分子sting，其核苷酸序列genebank登录号：nm_198282，该sting来源可以为人源或鼠源，其含有2个功能区，即n端是具有5次跨膜结构的功能区和球状羧基末端(即c端)功能区ctd。当哺乳类动物细胞内表达sting时，c-di-gmp能与sting的功能区ctd结合形成二元复合物并使其活化，活化的sting通过c端结构域招募tbk1使其激活，激活后的tbk1磷酸化irf3，随后irf3发生二聚化进入核内。本发明通过调节所述系统中处理器的sting量，可以使远红光调控基因表达环路控制系统的本底更低(seap的表达量只有5-8u/l)、对细胞的毒性更小，处理器与光感受器、效应器的质量比为(0.5-2)：(0.5-40)：(0.5-40)；优选地，为1：(1-20)：(1-20)；进一步优选地，为1：10：10；可根据需求不同进行调整。
其中，所述效应器包括启动子pfrl和目的基因reporter，表示为pfrl-reporter。
其中，所述启动子pfrl包含二聚化的ifr3识别并结合的dna序列和启动基因表达的弱启动子序列。所述二聚化的ifr3识别并结合的dna序列，其为ifr3多肽特异性识别并结合的dna序列，为hifn-re-isre启动子区域的部分序列。其中，所述hifn-re-isre由如seqidno.7所示的合成人体干扰素反应元件hifn-re和如seqidno.8所示的干扰素刺激反应元件isre的核苷酸序列组成。所述hifn-re-isre启动子区域的部分序列，其为1-10拷贝。
其中，所述启动基因表达的弱启动子可以是任意的弱启动子，如核苷酸序列如seqidno.5所示的tatabox、如核苷酸序列如seqidno.6所示的巨细胞病毒最小启动子cmvmin，及其突变体cmvmin3g等，其在上游处理器不存在时，不表达或几乎不表达下游目的基因(待转录的核苷酸序列)。本发明优化了效应器中的ifr3识别并结合的dna序列和弱启动子，所述ifr3识别并结合的dna序列和弱启动子可选自核苷酸序列如seqidno.9所示的pfrl1(5×isre-h_cmvmin)、如seqidno.10所示的pfrl2(hifn-re-h_cmvmin)、如seqidno.11所示的pfrl3((hifn-re)-3×isre-h_cmvmin)、如seqidno.12所示的pfrl4((hifn-re)-3×isre-h_min)、如seqidno.13所示的pfrl5((hifn-re)-3×isre-(hifn-re)-3×isre-h_min)、如seqidno.14所示的pfrl6((hifn-re)-3×isre-h_min-40bp)、如seqidno.15所示的pfrl7((hifn-re)-h_min)核苷酸序列、如seqidno.16所示的pfrl8((hifn-re)-3×isre-(hifn-re)-h_min)、如seqidno.17所示的pfrl9(3×isre-(hifn-re)-h_min)，可以使得所述系统表达倍数更高。本发明还优化了启动基因表达的弱启动子与基因起始密码子atg之间的间隔序列为40bp时，基因表达倍数较高(有50倍左右)，并且系统本底较低(seap的表达量只有5-8u/l)，使系统对远红光更加敏感，对以后光调控系统的深层次开发与临床应用更加有利。
其中，所述目的基因reporter(待转录的核苷酸序列)编码的蛋白可以为一切有意义的蛋白，包括作为报告基因的蛋白和/或作为治疗疾病的药物蛋白或小肽；其中，所述作为报告基因的蛋白包括分泌型碱性磷酸酶(seap)、增强型绿色荧光蛋白(egfp)、荧光素酶(luciferase)；作为治疗疾病的药物蛋白或小肽包括胰岛素(insulin)、胰高血糖素样肽(glp-1)。其中，编码所述seap的核苷酸序列genebank登录号：ax036887，编码所述egfp的核苷酸序列genebank登录号：ky002200，编码所述luciferase的核苷酸序列genebank登录号：kj561464，编码所述glp-1-fc的核苷酸序列核苷酸序列genebank登录号：ay311599。即，通过调整目的基因的种类，即可实现多种疾病的治疗或目的蛋白的表达。
其中，所述一切有意义的蛋白为两个或多个时，可通过自剪切肽2a连接在一个表达载体上同时表达，如seap-2a-insulin、egfp-2a-insulin等；其中，所述自剪切肽2a的核苷酸序列为seqidno.3(所述自剪切肽2a的氨基酸序列如seqidno.20所示)。其中所用2a序列可以被内部核糖体进入位点序列ires替代。
本发明中，可根据治疗的疾病种类调整所述系统中目的基因的种类，以制备相应的产品，如用于治疗糖尿病时，效应器的目的基因为编码胰岛素和/或胰高血糖素样肽的基因。
本发明的作用机理为，当在光照条件下产生c-di-gmp时，c-di-gmp与sting结合，介导sting-tbk1-ifr3信号通路活化，二聚化的ifr3进入核内，识别效应器中的特异性序列并结合，开始转录表达下游基因。当光照停止不能产生c-di-gmp时，已合成的c-di-gmp被降解，sting不能被激活，则无法开启基因的转录表达，进而实现了基因开关的关闭。
可通过基因工程技术将本发明提供的远红光调控基因表达环路控制系统的三个部件构建在真核表达载体中，进而实现调控目的基因的转录和表达。本发明提供的远红光调控基因表达环路控制系统，可利用几乎不会损伤细胞或机体的远红光照射，在时间和空间上调节目的基因在真核宿主细胞中的表达，所述宿主细胞可以是任意类型的哺乳动物细胞，如hmsc-tert，hana3a，hek-293a，hek-293t等。
其中，所述远红光的光照强度为0-5mw/cm2；照射时间为0-72h；照射方法包括脉冲式照射、连续照射、直接照射或用镂空刻画的投影卡片在空间上控制不同位置的细胞的基因表达水平的照射。通过控制远红光光源产生不同的光照时间，从而实现调控基因的不同表达量。所述远红光光源能产生600-900nm波长远红光的装置，可以为600-900nmled、红外线治疗器、激光灯等。
本发明还提出了所述远红光调控基因表达环路控制系统的构建方法。(1)本发明优化了在启动子cmv表达下sting与光感受器和处理器质量之间的关系，发现sting与光感受器和处理器质量之间的比例为1:10:10时，效果最优。(3)本发明优化了效应器，效应器包括启动子pfrl和目的基因reporter，表示为pfrl-reporter。其中，所述启动子pfrl包含二聚化的ifr3识别并结合的dna序列和启动基因表达的弱启动子序列。所述启动基因表达的弱启动子可以是任意的弱启动子，如核苷酸序列如seqidno.5所示的tatabox、如核苷酸序列如seqidno.6所示的巨细胞病毒最小启动子cmvmin，及其突变体cmvmin3g等。(4)本发明优化了多个版本的效应器中的ifr3识别并结合的dna序列和启动子，所述ifr3识别并结合的dna序列和启动子可选自核苷酸序列如seqidno.9所示的pfrl1(5×isre-h_cmvmin)、如seqidno.10所示的pfrl2(hifn-re-h_cmvmin)、如seqidno.11所示的pfrl3((hifn-re)-3×isre-h_cmvmin)、如seqidno.12所示的pfrl4((hifn-re)-3×isre-h_min)、如seqidno.13所示的pfrl5((hifn-re)-3×isre-(hifn-re)-3×isre-h_min)、如seqidno.14所示的pfrl6((hifn-re)-3×isre-h_min-40bp)、如seqidno.15所示的pfrl7((hifn-re)-h_min)核苷酸序列、如seqidno.16所示的pfrl8((hifn-re)-3×isre-(hifn-re)-h_min)、如seqidno.17所示的pfrl9(3×isre-(hifn-re)-h_min)，可以使得所述系统表达倍数更高。(5)本发明还优化了弱启动子与基因起始密码子atg之间的间隔序列为40bp时基因表达倍数较高(有50倍左右)，并且系统本底较低(seap的表达量只有5-8u/l)，使系统对远红光更加敏感，对以后光调控系统的深层次开发与临床应用更加有利。
本发明还提出了含有所述远红光调控基因表达环路控制系统的真核表达载体、工程化细胞或工程化细胞移植载体；其中，所述工程化细胞移植载体包括中空纤维膜移植管、海藻酸钠胶块等。
本发明还提出了一种试剂盒，其含有所述远红光调控基因表达环路控制系统。本发明还提出了一种试剂盒，其装有含有所述远红光调控基因表达环路控制系统的真核表达载体和/或转染了所述真核表达载体的宿主细胞和/或工程化细胞移植载体及相应的说明书。
本发明中，所述试剂盒包括调控所述远红光调控基因表达环路控制系统各组分质粒试剂盒、含有调控所述远红光调控基因表达环路控制系统的哺乳类动物细胞试剂盒以及相应的说明书。
本发明还提出了制备含有所述远红光调控基因表达环路控制系统的真核表达载体、工程化细胞或工程化细胞移植载体的方法。所述真核表达载体包括含有所述远红光调控基因表达环路控制系统的哺乳类动物细胞表达载体。所述表达载体可以是单独含有远红光光感受器编码基因的载体或单独含有处理器编码基因的载体或单独含有效应器编码基因的载体，所述的效应器含有远红光响应的启动子，但不含有待转录核酸序列。或者，所述表达载体包括远红光光感受器编码基因的载体、处理器编码基因的载体、效应器编码基因的载体中的两种或三种。前述所有的哺乳类动物细胞表达载体的构建方式详见表1。
本发明还提出了含有所述远红光调控基因表达环路控制系统的真核表达载体在制备治疗糖尿病药物/产品中的应用，所述糖尿病包括i型糖尿病和/或ii型糖尿病。
本发明还提出了利用所述远红光调控基因表达环路控制系统在宿主细胞中调控基因表达的方法。所述方法包括以下步骤：
a)将所述远红光调控基因表达环路控制系统构建在真核质粒表达载体中；
b)经转染导入宿主细胞中
其中，所述处理器与光感受器、效应器之间的质量比例为0.1:10:10。c)通过调控红光照射条件来诱导调控所述宿主细胞，实现所述效应器编码基因表达。其中，所述宿主细胞来源于哺乳动物细胞。
本发明中质粒构建方法参照材料方法以及表1。将质粒导入哺乳动物细胞中的方法包括：磷酸钙转染、pei转染、脂质体转染、电穿孔转染、病毒感染等。
本发明还提出了利用所述远红光调控基因表达环路控制系统在移植载体中调控转基因表达的方法，所述方法包括步骤：
a)制备含有所述远红光调控基因表达环路控制系统的真核质粒表达载体；
b)制备含有所述远红光调控基因表达环路控制系统的工程化细胞；
c)制备含有所述远红光调控基因表达环路控制系统的工程化细胞移植载体；
d)通过调控远红光光源对含有工程化细胞的移植载体进行诱导表达，使所述移植载体中的效应器pfrl-reporter编码基因(如seap、egfp、luciferase、insulin、glp-1-fc等)表达；e)分别在24h、48h、72h三个时间点检测目的基因的表达情况。
本发明还提出了将所述远红光调控基因表达环路控制系统移植载体植入小鼠体内的方法，以及所述远红光调控基因表达环路控制系统在小鼠体内进行转基因调控表达的方法，包括以下步骤：
a)制备含有所述远红光调控基因表达环路控制系统的移植载体；
b)将含有所述远红光调控基因表达环路控制系统的移植载体植入小鼠体内；
c)通过调控远红光光源对含有工程化细胞的移植载体进行诱导表达，使所述移植载体中的效应器pfrl-reporter编码基因(如seap、egfp、luciferase、insulin、glp-1-fc等)表达；d)分别在24h、48h、72h三个时间点检测目的基因的表达情况。
其中，所述移植载体包括海藻酸钠胶块皮、中空纤维膜移植管等；移植方法可以为皮下移植。
本发明还提出利用所述远红光调控基因表达环路控制系统在制备糖尿病治疗药物中的应用，所述糖尿病包括i型糖尿病和/或ii型糖尿病。本发明提供了一种安全、可靠、在时空上可精确调控释放胰岛素和胰高血糖素样肽治疗糖尿病的新策略。本发明提供了治疗糖尿病的新方法、新策略。所述系统可调控胰岛素和/或胰高血糖素样肽glp-1的表达。所述胰岛素的表达构建包括seap-2a-insulin、egfp-2a-insulin、egfp-2a-seap-2a-insulin。所述胰高血糖素样肽glp-1的表达包括glp-1-fc等。
附图说明
图1为本发明远红光调控基因表达环路控制系统在哺乳类动物细胞中的原理图示意图。
图2为本发明远红光调控基因表达环路控制系统不同启动子表达的光感受器的实验结果图。
图3为本发明远红光调控基因表达环路控制系统不同量的处理器的实验结果图。
图4为本发明远红光调控基因表达环路控制系统不同构建的效应器的实验结果图。
图5为本发明远红光调控基因表达环路控制系统在不同的哺乳类动物细胞中表达的实验结果图。
图6为本发明不同的光照时间调控远红光调控基因表达环路控制系统不同的表达量的实验结果图。
图7为本发明不同光照强度对远红光调控基因表达环路控制目的蛋白表达量的影响。
图8为本发明不同光照时间对远红光调控基因表达环路控制系统表达目的蛋白fluc活性的表达量的影响。
图9为本发明不同光照时间对远红光调控基因表达环路控制系统表达目的蛋白有活性glp-1表达量的影响。
图10为本发明远红光调控基因表达环路控制系统可以同时表达两个或多个一切有意义蛋白中的绿色荧光实验结果图。
图11为本发明远红光调控基因表达环路控制系统可以同时表达两个或多个一切有意义蛋白中的胰岛素实验结果图。
图12为本发明制备含有远红光调控基因表达环路控制系统工程化细胞的中空纤维膜移植管移植载体的实验结果图。
图13为本发明远红光毒性实验结果图。
图14为本发明远红光调控基因表达环路控制系统的本底测定结果。
图15为本发明远红光调控基因表达环路控制系统在小鼠体内受远红光调控表达的情况的实验结果图。
图16为本发明远红光调控基因表达环路控制系统在i型糖尿模型鼠内精确调控胰岛素表达治疗ⅰ型糖尿病的空腹血糖值。
图17为本发明远红光调控基因表达环路控制系统在i型糖尿模型鼠内精确调控胰岛素表达治疗ⅰ型糖尿病的糖耐受实验结果。
图18为本发明远红光调控基因表达环路控制系统在ⅱ型糖尿模型鼠内精确调控glp-1-fc表达治疗ⅱ型糖尿病的空腹血糖值。
图19为本发明远红光调控基因表达环路控制系统在ⅱ型糖尿模型鼠内精确调控glp-1-fc表达治疗ⅱ型糖尿病的糖耐受实验结果。
图20为本发明远红光调控基因表达环路控制系统在ⅱ型糖尿模型鼠内精确调控glp-1-fc表达治疗ⅱ型糖尿病的胰岛素耐受实验结果。
图21为本发明远红光调控基因表达环路控制系统在ⅱ型糖尿模型鼠内精确调控glp-1-fc表达治疗ⅱ型糖尿病所表达胰高血糖素的量。
具体实施方式
结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明。实施本发明的过程、条件、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。本发明的实施过程、条件、试剂、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公认常识，本发明没有特别限制内容。
材料与方法：
所有用于pcr的引物均由金唯智生物科技有限公司合成。本发明实施例中的表达质粒都是按照常规的分子克隆流程进行的，构建的表达质粒都经过序列测定，序列测定由金唯智生物科技有限公司完成。本发明实施例中所用的dna聚合酶、核酸内切酶、t4dna连接酶都购自南京诺唯赞生物科技有限公司。使用的双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自美国biotool公司。实验所用的中空纤维膜移植管(
实施例1，远红光调控转基因表达的基因环路调控系统元件的构建
本实施例中包含了远红光调控转基因表达的基因环路远程调控系统中具有代表性元件的构建方法，但不对本发明保护范围有限制。详细设计方案及步骤见表1。
实施例2，远红光调控转基因表达的远红光调控基因表达环路控制系统不同启动子表达的光感受器
第一步，质粒构建。本实施例中的质粒构建详见表1。第二步，接种细胞。第三步，转染。在接种细胞16到24h内，将2块24孔板分为黑暗组和光照组，每组均分为1-5个小组。在接种细胞16到24h内，其中黑暗组和光照组的第1小组中将0.1μgpws50(由启动子sv40表达)，第2小组中将0.1μgpws189(由启动子cmv表达)，第3小组中将0.1μgpws51(由启动子hef1α表达)，第4小组中将0.1μgpws55(由启动子mpgk表达)、第5小组中将0.1μgpws59(由启动子cag表达)分别和0.01μg的处理器psting、0.1μg效应器pws67、pei转染试剂与无血清的dmem混匀，室温静置15min后均匀滴加到24孔培养板中。第四步，光照，换液14-18h后，将其光照组置于波长为720nm，光照强度为1mw/cm2的led下照射4h。第五步，检测报告基因。
结果如图2所示，远红光调控转基因表达的基因环路控制系统中，用不同启动子表达的光感受器，在远红光诱导下都可以在哺乳类动物细胞中正常工作。但是在相同远红光诱导下不同启动子表达的光感受器使效应器的反应强度有所不同，从实验结果看由启动子cmv表达的光感受器诱导倍数最高。
实施例3，远红光调控转基因表达的基因环路控制系统不同量的处理器
第一步，质粒构建。本实例中的质粒构建详见表1。第二步，接种细胞。第三步，转染。在接种细胞16到24h内，将2块24孔板分为黑暗组和光照组，每组均分为1-8个小组。在接种细胞16到24h内，其中黑暗组和光照组的第1小组中将0ngpsting、第2小组中将5ngpsting，第3小组中将10ngpsting，第4小组中将20ngpsting，第5小组中将40ngpsting、第6小组中将60ngpsting、第7小组中将80ngpsting、第8小组中将100ngpsting分别和100ng的远红光感受器pws189、100μg效应器pws67、pei转染试剂与无血清的dmem混匀，室温静置15min后均匀滴加到24孔培养板中。第四步，光照(具体步骤同实施例2)。第五步，检测报告基因。
结果如图3所示，远红光调控转基因表达的基因环路控制系统中，在相同远红光诱导下，不同量的处理器使效应器的反应强度有所不同。处理器为10ng、光感受器为100ng、效应器为100ng时的表达倍数最高，并且本底较低(seap的表达量只有5-8u/l)，处理器在40ng、光感受器为100ng、效应器为100ng时的表达量最高但是由于本底较高所以没有处理器在10ng时的表达倍数高；可根据实验需要选择最优的处理器的量。
实施例4，远红光调控转基因表达的基因环路控制系统不同构建的效应器
第一步，质粒构建。本实例中的质粒构建详见表1。第二步，接种细胞。第三步，转染。在接种细胞16到24h内，将2块24孔板分为黑暗组和光照组，每组均分为1-9个小组。在接种细胞16到24h内，其中黑暗组和光照组的第1小组中将0.1μgpws32，第2小组中将0.1μgpws33，第3小组中将0.1μgpws35，第4小组中将0.1μgpws54、第5小组中将0.1μgpws58、第6小组中将0.1μgpws67、第7小组中将0.1μgpyw25、第8小组中将0.1μgpyw28、第9小组中将0.1μgpyw29、分别和0.1μg的远红光感受器pws189、0.01μg处理器psting、pei转染试剂与无血清的dmem混匀，室温静置15min后均匀滴加到24孔培养板中。第四步，光照(具体步骤同实施例2)。第五步，检测报告基因。
结果如图4所示，远红光调控转基因表达的基因环路控制系统中，pws32(pfrl1(5×isre-h_cmvmin))、pws33(pfrl2(hifn-re-h_cmvmin))、pws35(pfrl3((hifn-re)-3×isre-h_cmvmin))、pws54(pfrl4((hifn-re)-3×isre-h_min))、pws58(pfrl5((hifn-re)-3×isre-(hifn-re)-3×isre-h_min))、pws67(pfrl6((hifn-re)-3×isre-h_min-40bp))、pyw25(pfrl7((hifn-re)-h_min))、pyw28(pfrl8((hifn-re)-3×isre-(hifn-re)-h_min))、pyw29(pfrl9(3×isre-(hifn-re)-h_min))，不同的处理器识别位点及识别位点的不同重复数以及不同种类的弱启动子的效应器在远红光诱导下都可以在哺乳类动物细胞中正常工作。但是，在相同远红光诱导下，包含不同的处理器识别位点及识别位点不同重复数的效应器的反应强度有所不同，根据实验结果发现pws67作为效应器的表达倍数最高，而pws35作为效应器的表达量最高，可根据实验需要选择不同的效应器。
实施例5，远红光调控转基因的基因环路控制系统在不同的哺乳类动物细胞中表达
第一步，质粒构建。本实施例中的质粒构建详见表1。第二步，接种细胞。第三步，转染。在接种细胞16到24h内，将0.1μgpws189、0.01μgpsting、0.1μgpws67、pei转染试剂与无血清的dmem混匀，室温静置15min后均匀滴加到24孔培养板中。第四步，光照(具体步骤同实施例2)。第五步，检测报告基因。
结果如图5所示，本发明中的远红光调控转基因表达的基因环路控制系统可以在不同的哺乳类动物细胞(如hmsc-tert，hana3a，hek-293a，hek-293t)中受远红光诱导表达。因此本发明中的远红光调控转基因的基因环路控制系统可在多种哺乳类动物细胞种类中表达，可适用于多种哺乳类动物细胞。
实施例6，控制不同的光照时间调控远红光调控转基因表达的基因环路控制系统不同的表达量
第一步，质粒构建。本实施例中的质粒构建详见表1。第二步，接种细胞。第三步，转染。在接种细胞16到24h内，将0.1μg光感受器pws189、0.01μgpsting、0.1μgpws67、pei转染试剂与无血清的dmem混匀，室温静置15min后均匀滴加到24孔培养板中。第四步，控制不同的光照时间进行光照。换液14-18h后，将其分成13组，置于波长为720nm，光照强度为1mw/cm2的led下。不同的光照时间分别为0、0.01、0.1、0.25、0.5、1、2、4、6、12、24、48、72h(其中光照0h的组一直置于黑暗处培养)。第五步，检测报告基因。分别在培养72h后取各组的细胞培养液上清测定seap的表达量。
实验结果如图6所示，通过控制不同光照时间可以诱导远红光调控转基因的基因环路控制系统调控目的基因的不同表达量，且光照诱导时间越长，其表达量越高，在0-72h内呈现光照时间依赖性表达。
实施例7，通过控制不同的光照强度调控远红光调控转基因表达的基因环路控制系统不同的表达量
第一步，质粒构建。本实施例中的质粒构建详见表1。第二步，接种细胞。第三步，转染(具体步骤同实施例6)。第四步，控制不同光照强度。换液14-18h后，将其分成11组，分别置于波长为720nm，光照强度分别为0、25、50、75、100、250、500、750、1000、1500、2000μw/cm2的led下。其光照时间为4h(其中光照强度为0的组一直置于黑暗处培养)。第五步，检测报告基因。分别在培养72h后取各组的细胞培养液上清测定seap的表达量。
实验结果如图7所示，控制不同光照强度可以诱导远红光调控转基因表达的基因环路控制系统调控目的基因的不同表达量，且光照强度越强，其表达量越高，0-72h内呈现光照强度依赖性表达。
实施例8，调控转基因的基因环路控制系统可以表达一切有意义的蛋白
第一步，质粒构建。本实例中的质粒构建详见表1。第二步，接种细胞。第三步，转染。在接种细胞16到24h内，0.1μgpws189、0.01μgpsting、0.1μgpgy45(表达luciferase)；0.1μgpws189、0.01μgpsting、0.1μgpws152(表达glp-1-fc)分别和pei转染试剂与无血清的dmem混匀，室温静置15min后均匀滴加到24孔培养板中。第四步，光照(具体步骤同实施例2)，光照4h后测定荧光素酶(luciferase)的表达量；分别光照0、0.1、0.25、0.5、1、2小时后立刻统一测定glp-1在不同光照时间下的表达量。而黑暗组则一直置于黑暗处培养。第五步，检测报告基因。在24h、48h用elisa试剂盒测定荧光素酶(luciferase)的表达量(目的蛋白fluc活性)(图8)；在48h用elisa试剂盒测定glp-1在不同光照时间下的表达量(图9)。
结果如图8、9所示，本发明调控转基因表达的基因环路控制系统可以很好地诱导表达不同的蛋白，如luciferase、glp-1-fc等，对于蛋白的种类没有特别的限制。因此本发明的调控转基因的基因环路控制系统适用于表达一切有意义的蛋白。
同时，由图10、11可知，调控转基因表达的基因环路控制系统可以精确调控egfp、胰岛素的表达，且其表达量与光照时间成正相关。
实施例9，调控转基因的基因环路控制系统可以同时表达两个或多个一切有意义的蛋白
第一步，质粒构建。本实施例中的质粒构建详见表1。第二步，接种细胞。第三步，转染。在接种细胞16到24h内，将0.1μgpws189、0.01μgpsting、0.1μgpws174、pei转染试剂与无血清的dmem混匀，室温静置15min后均匀滴加到24孔培养板中。第四步，光照。换液14-18h后，将光照组置于波长为720nm，设定的光照强度为1mw/cm2的led下光照0、0.1、0.25、0.5、1、2小时后立刻统一测定。第五步，检测报告基因。
结果如图10、11所示，本发明的调控转基因表达的基因环路控制系统可以很好的同时表达两个不同的蛋白(用2a连接)，并且同时表达的这两个不同的蛋白都具有时间依赖性。因此本发明中的调控转基因的基因环路控制系统可以用于同时表达两个或多个有意义的蛋白。
同时，由图11可知，调控转基因表达的基因环路控制系统可以在体外精确调控胰岛素表达，且其表达量与光照时间成正相关。
实施例10：制备含有调控转基因表达的基因环路控制系统工程化细胞的中空纤维膜移植管移植载体
第一步，质粒构建。本实施例中的质粒构建详见表1。第二步，接种细胞.第三步，转染：在接种细胞16到24h内，将0.1μgpws189、0.01μgpsting、0.1μgpws67、pei转染试剂与无血清的dmem混匀，室温静置15min后均匀滴加到24孔细胞培养板中。转染6h后换入10ml含10％fbs的dmem培养基进行培养。第四步，调控转基因表达的基因环路控制系统工程化细胞的中空纤维膜移植管制备。换液14-18h后，胰酶消化，离心收集细胞。按照制作方法制作中空纤维膜移植管。
实验结果详见图12，制备好的中空纤维膜移植管，细胞生长所需的营养物质以及工程化细胞所分泌的小分子目的蛋白可以自由通过该膜系统。但是细胞及其他大分子蛋白则无法通过该膜系统。因此由中空纤维膜移植管包裹的细胞可以移植到小鼠体内正常生长。
实施例11，远红光对细胞的毒性试验
第一步，质粒构建。本实施例中的质粒构建详见表1。第二步，接种细胞。
第三步，转染。在接种细胞16到24h内，将0.1μg的pseap2control和pei转染试剂与无血清的dmem混匀，室温静置15min后均匀滴加到24孔培养板中。转染6h后换入500μl含10％fbs的dmem培养基进行培养。第四步，光照。换液14-18h后，将其分成10组，分别置于波长为720nm，设定的光照强度为1mw/cm2的led下光照0、0.1、0.5、1、2、6、12、24、48、72小时后立刻统一测定。第五步，检测报告基因。
实验结果如图13所示，光照72h后seap的表达量与黑暗基本没有区别，说明远红光对细胞并没有毒性。
实施例12，本发明远红光调控基因表达环路控制系统的本底测定
第一步，质粒构建。本实施例中的质粒构建详见表1。第二步，接种细胞。第三步，转染。在接种细胞16到24h内，将0.1μgpws189、0.01μgpsting、0.1μgpws67；0.1μgpws189、0.1μgpgy32、0.1μgpxy34分别于pei转染试剂与无血清的dmem混匀，室温静置15min后均匀滴加到24孔培养板中。第四步，转染6h后换入500μl含10％fbs的dmem培养基，并用锡箔纸包裹放进培养箱进行培养。第五步，检测报告基因。在培养48h后取各组的细胞培养液上清测定seap的表达量。
实验结果如图14所示，培养72h后两组seap的表达量可以看出本发明远红光调控基因表达环路控制系统的本底低，seap的表达量只有5-8u/l，而相同条件下，2016年提交的申请号为201610136462.5，题目为“一种远红光基因环路表达控制系统及其真核表达载体”中的远红光基因环路表达控制系统中的本底为16-19u/l，与之相比，本发明的远红光调控基因表达环路控制系统的本底更低，对以后光调控系统的深层次开发与临床应用更加有利。
实施例13，调控转基因表达的基因环路控制系统在小鼠体内受远红光调控表达的情况
第一步，制备中空纤维膜移植管(具体方式参照实施例10)。第二步，将中空纤维膜移植管植入小鼠背部。第三步，光照。控制红外线治疗器(10mw/cm2)分别在移植后2h、8h、26h、32h光照2h。第四步，检测报告基因。分别在移植后24h和48h眼眶取血检测报告基因的量。
实验结果如图15所示，说明本发明的基因环路控制系统在小鼠体内也受远红光的控制，并且有时间依赖性。
实施例14，调控转基因表达的基因环路控制系统在i型糖尿模型鼠内精确调控胰岛素表达治疗i型糖尿病
第一步，i型糖尿病小鼠模型的构建。我们采用多次低剂量链脲霉素(streptozocin，stz，购自sigma公司s0130，18883-6，6-4)给药法诱导模型。c57bl/6j小鼠25只(来自中国科学院)，8周龄，雄性，连续5天腹腔(注射前禁食12-16h)注射溶解有stz(剂量为40-50mg/kg)的柠檬酸钠缓冲液。第二步，调控转基因表达的基因环路控制系统工程化细胞的制备过程，具体参照实施例10。第三步，调控转基因表达的基因环路控制系统工程化细胞的中空纤维膜移植管的制备，具体参照实施例10。第四步，调控转基因表达的基因环路控制系统工程化细胞的移植管植入小鼠背部。第五步，光照，具体参照实施例13第三步。第六步，测定i型糖尿病小鼠空腹血糖值。移植8h后，将小鼠禁食(供水)16h后，经尾部取血，测定空腹血糖值。实验数据表明表达的胰岛素具有很好的降血糖效果(图16)。第七步，糖耐受实验。移植24h后，进行糖耐受实验。实验表明，糖尿病鼠的糖耐量具有很好的改善(图17)。
实施例15，调控转基因表达的基因环路控制系统在ii型糖尿病模型鼠内精确调控glp-1表达治疗ii型糖尿病
第一步，质粒构建。本实施例中的质粒构建详见表1。第二步，ii型糖尿病模型鼠db/db小鼠20只(来自中国科学院)，8周龄，雌性，分成四组。分别为不移植不光照组、不移植光照组、移植不光照组、移植光照组。第三步，远红光工程化细胞的制备，具体参照实施例10。第四步，调控转基因表达的基因环路控制系统工程化细胞的移植管的制备，具体参照实施例10。第五步，调控转基因表达的基因环路控制系统工程化细胞的移植管至小鼠背部，具体参照实施例14第二步。第六步，光照，具体参照实施例14第三步。第七步，测定ii型糖尿病小鼠空腹血糖值。移植8h后，将小鼠禁食(供水)16h后，经尾部取血，测定空腹血糖值。实验结果如图18所示，数据表明表达的胰高血糖素具有很好的降血糖效果。第八步，进行糖耐受实验。移植24h后，进行糖耐受实验。具体参照实施例18。实验结果如图19所示，糖尿病鼠的糖耐量具有很好的改善。第九步，进行胰岛素耐受实验。移植24h后，进行胰岛素耐受实验。实验结果如图20所示，糖尿病鼠的胰岛素耐受具有很好的改善。第十步，测定调控转基因表达的基因环路控制系统在ii型糖尿病小鼠中glp-1的表达。移植后48h通过眼球内眦取血，用glp-1(7-36)activieelisa试剂盒，检测血清中glp-1(activie)含量。实验结果如图21所示，调控转基因表达的基因环路控制系统可以在体内精确调控胰高血糖素的表达。
表1.质粒构建表
引物:酶切位点以及无缝克隆片段用下划线标出。
<110>苏州欣赛生物科技有限公司
<120>一种远红光调控基因表达环路控制系统及构建方法和应用
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