一种基于近场光学技术的单分子DNA无损检测芯片的制作方法

本发明属于生物分子检测技术领域，具体涉及一种基于近场光学技术的单分子dna无损检测芯片。

背景技术：

dna测序技术，作为最重要的生物医学研究手段之一,对基因组学及其相关学科的发展起着至关重要的作用。而单分子无损测序技术是目前dna测序技术的最新发展方向，在高速测序、长序列产出和低成本方面具有巨大的潜力。目前存在的dna单分子测序技术大都基于纳米孔方法，即通过碱基与纳米孔摩擦产生的生物电以确定碱基顺序。然而生物电识别方式的特异性不高，抗干扰性差，造成单碱基识别错误率高。除此之外，现有的单分子dna测序技术还存在以下几个缺点：(1)读长较小；(2)dna碎片拼接错误率高；(3)速度较慢。因此，亟需一种新型高效的单分子dna测序技术。

技术实现要素：

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种高特异性、高读长、高准确率、高速测序的基于近场光学技术的单分子dna无损检测芯片。

本发明的技术方案概述如下：

一种基于近场光学技术的单分子dna无损检测芯片，包括氮化硅基板6，在氮化硅基板上表面设置有凹槽，凹槽从左到右依次由矩形的dna分子样品池1、渐窄坑道2、窄坑道3、渐宽坑道4和矩形的废液池5连接组成，在窄坑道3之上搭载有氧化石墨烯膜7(跨桥结构)，在氧化石墨烯膜7的左右两端分别设置有第一金纳米粒子单层膜8和第二金纳米粒子单层膜9(天窗结构)，电极a设置在矩形的dna分子样品池1内，电极b设置在矩形的废液池5内，电极a和电极b分别通过导线与电源相连接。

优选地，矩形的dna分子样品池的宽度为100nm，窄坑道的宽度为10nm，废液池的宽度为100nm。

第一金纳米粒子单层膜和第二金纳米粒子单层膜之间的缝隙10的尺寸为0.45-0.65nm。本发明的优点：

(1)本发明利用氧化石墨烯膜，可以有效借助分子间的π-π作用而对dna分子的单碱基进行精细捕获，限制其热力学及动力学的随机性，确保针尖增强拉曼光谱系统以近100％捕获效率采集到单个碱基信息，极大提高检测系统的响应速度和精度。

(2)本发明可以高效地控制dna的运动流向及精确输入检测区域。

(3)氧化石墨烯与单碱基形成的局域场π-π作用，可有效地提高单碱基拉曼散射截面，从而增强拉曼信号；在此基础上，通过π-π电子作用可极大增强局域场内的电子云密度，能够在等离子域空间内形成更强的ters效应。

(4)采用氧化石墨烯为光透导体，上面覆盖金纳米粒子单层膜，可在有效屏蔽针尖对单碱基的电场影响的同时，不影响近场光谱的采集。

(5)由于目前针尖增强拉曼光谱系统普遍的分辨率为20nm，本发明使用具有跨桥结构的石墨烯捕获带(即氧化石墨烯膜7横跨窄坑道3搭载在氮化硅基板上，)以进一步提升针尖增强拉曼光谱系统的空间分辨率；该捕获带采用金纳米粒子单层膜覆盖氧化石墨烯膜，以原子力显微镜操纵的方式留出0.45nm-0.65nm的天窗(第一金纳米粒子单层膜和第二金纳米粒子单层膜之间的缝隙)以匹配单碱基的空间距离，进而将针尖增强拉曼光谱的分辨率提升为0.55nm左右，从而可以识别单碱基。

附图说明

图1为本发明一种基于近场光学技术的单分子dna无损检测芯片的主视示意图。

图2为本发明一种基于近场光学技术的单分子dna无损检测芯片的俯视示意图。

具体实施方式

下面通过附图对本发明作进一步的说明。

一种基于近场光学技术的单分子dna无损检测芯片(见图1，图2)，包括氮化硅基板6，在氮化硅基板上表面设置有凹槽，凹槽从左到右依次由矩形的dna分子样品池1、渐窄坑道2、窄坑道3、渐宽坑道4和矩形的废液池5连接组成，在窄坑道3之上搭载有氧化石墨烯膜7，在氧化石墨烯膜7的左右两端分别设置有第一金纳米粒子单层膜8和第二金纳米粒子单层膜9，电极a设置在矩形的dna分子样品池1内，电极b设置在矩形的废液池5内，电极a和电极b分别通过导线与电源相连接。

使用聚焦离子束(fib)纳米加工技术，将氮化硅(si3n4)基板，加工出宽度为100nm的矩形的dna分子样品池1，渐窄坑道2，宽度为10nm的窄坑道3，渐宽坑道4和宽度为100nm的矩形废液池5，电极a设置在dna分子样品池1内，电极b设置在废液池5内，电极a和电极b分别通过导线与电源相连接，在窄坑道上搭载氧化石墨烯膜7，使其在窄坑道上形成跨桥结构的捕获带，在氧化石墨烯膜7左右两端分别设置有不透明第一金纳米粒子单层膜8第二金纳米粒子单层膜9，这两个膜之间的缝隙的尺寸为0.55nm，也可以是0.45nm或0.65nm，以有效匹配dna碱基空间距离，进而形成跨桥天窗式的复合结构以利于后续的针尖增强拉曼光谱检测。

本发明的一种基于近场光学技术的单分子dna无损检测芯片使用针尖增强拉曼光谱系统进行检测。

一种基于近场光学技术的单分子dna无损检测芯片的使用：

将浓度1mol/l,ph值为8.0的nacl水溶液输入凹槽中铺满，然后将已分离为单链的dna分子放入矩形的dna分子样品池1中，再将本发明的芯片放置在针尖增强拉曼光谱系统的样品台上，并将针尖增强拉曼光谱系统的探针放在第一金纳米粒子单层膜8和第二金纳米粒子单层膜9之间的氧化石墨烯膜7的上方；

给电极通电，通过电极给所述芯片以电场力，由于氧化石墨烯与单链dna分子的π-π堆积和电场力的共同作用，带负电的dna分子会保持单链状态，通过渐窄坑道2，进入窄坑道3。

当dna分子经过针尖增强拉曼光谱系统探针的位置时，系统物镜将激发光束聚焦在探针针尖顶端，产生的局域增强场则会激发针尖下方氮化硅基板(6)上的dna样品碱基的拉曼信号。通过针尖增强拉曼光谱系统的物镜收集局部域的拉曼信号，并将信号引入针尖增强拉曼光谱系统进行信号处理。针尖增强拉曼光谱系统会自动记录此时单碱基的拉曼信号。之后dna分子会在电场力的驱动下，进入废液区，进而完成单个dna分子的无损检测。

实验：检测dna中的四种碱基

实验材料：人工合成的核苷酸片段agctagct。

仪器设置：针尖增强拉曼光谱系统，激光强度设定为100mw，激光波长为532nm，收集时间为0.1毫秒。本发明的一种基于近场光学技术的单分子dna无损检测芯片，第一金纳米粒子单层膜和第二金纳米粒子单层膜之间的缝隙(10)为0.55nm。

操作过程：将浓度为1mol/l、ph值为8.0的nacl水溶液输入凹槽中铺满，将此人工合成的核苷酸片段agctagct注入矩形的dna分子样品池1中，再将本发明的芯片放置在针尖增强拉曼光谱系统的样品台上，借助原子力显微镜找到第一金纳米粒子单层膜8和第二金纳米粒子单层膜9之间的氧化石墨烯膜7的中心位置。给电极通电，通过电极给所述芯片以电场力，带负电的dna分子会保持单链状态，通过渐窄坑道2，进入窄坑道3。当电极开始通电之后，即开始进行针尖增强拉曼光谱信号采集，以顺序获得单个碱基光谱信号，当所有核苷酸进入废液池后，停止信号采集。

结果：表1是使用针尖增强拉曼光谱系统检测此人工合成的片段四种不同碱基后得到的碱基种类所对应的拉曼光谱谱峰。可以看到，不同碱基的拉曼特征谱峰具有唯一性且不与其它碱基特征重叠，可作为单个碱基识别的依据，具有极高的准确性。

表1四个碱基对应的针尖增强拉曼谱峰位置