一种植物细胞原生质体纯化仪及纯化方法与流程

本发明属于植物细胞原生质体分离纯化技术领域，具体涉及一种植物细胞原生质体纯化仪及纯化方法。

背景技术：

植物细胞原生质体是指将植物细胞壁去除后的原生质团，在适宜的渗透液中保持球型的细胞。目前原生质体在植物细胞工程中占据很重要的位置，不但是植物细胞杂交的良好亲本，还是植物遗传工程的理想受体是细胞生物学研究的重要材料。植物细胞原生质体分离是达到这些目的的重要技术基础。

传统的原生质体纯化方法有自然沉降法、密度梯度离心法。自然沉降法将过滤和沉降相结合，酶解液滤网过滤后置于试管内，组织碎片、未去壁细胞、原生质体和叶绿体等细胞器在重力作用下下降速度不同，根据经验吸取原生质体较多的悬浮液以获得原生质的纯化；离心漂浮法是将酶解液置于离心管内，再将高渗溶液加至离心管底部(如25％蔗糖溶液)，在酶解液和高渗溶液之间形成一个界面，再通过一定速度的水平离心，组织碎片、未完全去壁的细胞破碎的细胞体沉于离心管底部，完好的原生质体集中在高渗上层和酶解液之间的界面上，细胞器如叶绿体则仍留在酶解液中，小心吸取原生质体液层以获得纯化。

然而传统的自然沉降法、密度梯度离心法等繁琐，损坏严重，得率低，且通过密度梯度离心的对原生质体的破坏较大，得率低。有必要开发一种步骤简化、得率高的原生质体纯化装置。

技术实现要素：

本发明提供的一种植物细胞原生质体纯化仪及纯化方法，解决了传统的自然沉降法、密度梯度离心法等繁琐，损坏严重，得率低，且通过密度梯度离心的对原生质体的破坏较大，得率低的问题。

本发明的目的是提供一种植物细胞原生质体纯化仪及纯化方法，包括电泳池，所述电泳池内从上到下依次划分为加样室、滴漏室和电泳室，所述滴漏室为漏斗形状，所述加样室与所述滴漏室连通、并且所述滴漏室上端与所述加样室通过滤膜隔开，所述电泳室的左侧设置有负电极，右侧设置有正电极，所述电泳室的底部从左至右分别连通有细胞碎片收集盘、原生质体收集盘和叶绿体收集盘，所述细胞碎片收集盘位于所述滴漏室的下方，所述叶绿体收集盘靠近所述正电极设置，所述电泳室内还纵向设置有滤网，所述滤网位于原生质体收集盘的右侧壁上方。

优选的，所述的植物细胞原生质体纯化仪中，所述滤膜的孔径φ为50-100微米。

优选的，所述的植物细胞原生质体纯化仪中，所述滤膜搁置在滴漏室上端端口处。

优选的，所述的植物细胞原生质体纯化仪中，所述滤网的孔径φ为10微米。

优选的，所述的植物细胞原生质体纯化仪中，所述电泳室的上端靠近所述正电极处开设有滤网插孔，并且电泳室的两个相对的侧壁上分别开设有滤网滑槽，所述滤网的宽度小于所述滤网插孔的长度，所述滤网的厚度小于所述滤网插孔的宽度，并且所述滤网的两侧与两个滤网滑槽一一对应滑动连接。

优选的，所述的植物细胞原生质体纯化仪中，所述电泳池的外部还设置有直流电泳仪，并且所述直流电泳仪的负极与所述负电极电连接，正极与所述正电极电连接。

优选的，所述的植物细胞原生质体纯化仪中，所述细胞碎片收集盘、所述原生质体收集盘和所述叶绿体收集盘均可拆卸的连接在所述电泳室的底部，具体结构为：所述电泳室的底部从左至右分别连通有细胞碎片流通管、原生质体收流通管和叶绿体流通管，所述细胞碎片收集盘的开口端与所述细胞碎片流通管底部螺接，所述原生质体收集盘的开口端与所述原生质体收流通管底部螺接，所述叶绿体收集盘的开口端与所述叶绿体流通管底部螺接。

优选的，所述的植物细胞原生质体纯化仪中，所述细胞碎片收集盘与所述细胞碎片流通管之间、所述原生质体收集盘与所述原生质体收流通管之间，所述叶绿体收集盘与所述叶绿体流通管之间均设置有密封圈。

本发明还提供了一种所述的植物细胞原生质体纯化仪的纯化方法，包括以下步骤：

s1，电泳室(3)内装满0.5mol/l的甘露醇缓冲液，将直流电泳仪(7)的电场强度调节在1.5-5v/cm，进行电泳；

s2，电泳开始后，将制备好的原生质体混合物悬浮液按照6-12滴/分钟的速度滴加入加样室(1)内直至滴加完毕，然后继续电泳30min；

s3，关闭电源，收集原生质体收集盘(5)内的原生质体。

与现有技术相比，本实用发明提供的一种植物细胞原生质体纯化仪及纯化方法，具有以下有益效果：

1、本发明的植物细胞原生质体纯化仪利用植物原生质体带电不同通过电泳的方式分离原生质体的方法，整个过程只需要一种缓冲液，简化了步骤，降低了原生质体的损坏和污染率，可以批量筛分。解决了现有技术中自然沉降法、密度梯度离心法等步骤复杂，得率低，且通过密度梯度离心的对原生质体的破坏较大，得率低的问题。

2、本发明的纯化方法通过一种高渗溶液将不同组分分离开来，减少试剂的使用，在缓冲液中条件温和，减少了操作步骤及其传统离心步骤对原生质体的破坏，提高了得率。

附图说明

图1为本发明植物细胞原生质体纯化仪的结构示意图；

图2为本发明植物细胞原生质体纯化仪的工作原理图。

附图标记说明：1.加样室，11.滤膜，2.滴漏室，3.电泳室，31.负电极，32.正电极，4.细胞碎片收集盘，5.原生质体收集盘，6.叶绿体收集盘，33.滤网，331.滤网滑槽，7.直流电泳仪。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明，但不应理解为本发明的限制。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件操作。当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。

本发明提供一种植物细胞原生质体纯化仪，具体如图1所示，包括由绝缘材料制备而成的电泳池，所述电泳池内从上到下依次划分为加样室1、滴漏室2和电泳室3，所述滴漏室2为漏斗形状，加样室1与滴漏室2连通、并且所述滴漏室2上端端口与所述加样室1通过滤膜11隔开，所述滤膜11的孔径φ为50-100微米，所述电泳室3的左侧设置有负电极31，右侧设置有正电极32，所述电泳室3的底部从左至右分别连通有细胞碎片收集盘4、原生质体收集盘5和叶绿体收集盘6，细胞碎片收集盘4、原生质体收集盘5和叶绿体收集盘6之间的间距为2-5cm，所述细胞碎片收集盘4位于所述滴漏室2的正下方，并且细胞碎片收集盘4和滴漏室2的宽度、长度相等，宽度、长度均为2-8cm，所述原生质体收集盘5的宽度、长度为2-8cm，原生质体收集盘5位于所述细胞碎片收集盘4的右侧，所述叶绿体收集盘6位于原生质体收集盘5的右侧、并且靠近所述正电极32设置，所述叶绿体收集盘6与所述正电极32之间的距离为0-1cm，所述电泳室3内还纵向设置有可拆卸的滤网33，所述滤网33的孔径φ为10微米，所述滤网33位于原生质体收集盘5的右侧壁上方。

需要说明的是，所述电泳池的外部还设置有直流电泳仪7(够自六一仪器厂)，并且所述直流电泳仪7的负极与所述负电极31电连接，正极与所述正电极32电连接，以实现电泳池的电泳功能。

需要说明的是，为了方便装置的拆卸和清洗，细胞碎片收集盘4、原生质体收集盘5和叶绿体收集盘6均可拆卸的连接在所述电泳室3的底部，具体结构为：所述电泳室3的底部分别连通有细胞碎片流通管、原生质体收流通管和叶绿体流通管，所述细胞碎片收集盘4的开口端与所述细胞碎片流通管底部螺接，所述原生质体收集盘5的开口端与所述原生质体收流通管底部螺接，所述叶绿体收集盘6的开口端与所述叶绿体流通管底部螺接。

所述细胞碎片收集盘4与所述细胞碎片流通管之间、所述原生质体收集盘5与所述原生质体收流通管之间，所述叶绿体收集盘6与所述叶绿体流通管之间均设置有密封圈，用于防止漏液。

需要说明的是，所述滤膜11搁置在滴漏室2上端端口处，以实现滤膜11可拆卸的连接在滴漏室2上，便于更换滤膜11。

需要说明的是，所述电泳室3的上端靠近所述正电极32处开设有滤网插孔，滤网插孔与叶绿体收集盘6的距离为0-0.5cm，并且电泳室3的两个相对的侧壁上分别开设有滤网滑槽331，所述滤网33的宽度小于所述滤网插孔的长度，所述滤网33的厚度小于所述滤网插孔的宽度，并且所述滤网33的两侧与两个滤网滑槽331一一对应滑动连接，使滤网33能穿过所述滤网插孔、并且沿两个滤网滑槽331滑滑出，便于更换滤网33。

本发明的植物细胞原生质体纯化仪使用原理如图2所示，为：原生质体表面带有负电荷(-10-30mv)，利用原生质体、叶绿体、组织碎片和未完全去壁细胞在有电场的悬浮溶液中电荷不同、形状不同、重力大小不同形成的侧向漂移速度不同实现分离纯化之目的。

电泳室3放入电泳液，所述直流电泳仪7的负极与所述负电极31电连接，正极与所述正电极32电连接，将酶解等方法制备好的原生质体混合物悬浮液按一定速度滴加在加样室1内，原生质体混合物悬浮液经过滤膜11进入滴漏室2，然后经滴漏室2逐渐滴入电泳室3内，电泳室3内的植物原生质体向正电极32方向移动，停滞于正电极32前的滤网33上，电泳停止后原生质体沉降落入原生质体收集盘5，把原生质体收集盘5取出即获得纯化的原生质体，而细胞碎片和未破壁的细胞则因重力作用掉落入细胞碎片收集盘4；叶绿体则透过滤网33落入叶绿体收集盘6内。

这种植物细胞原生质体纯化仪，克服现了有技术存在的一系列问题，利用植物原生质体带电不同通过电泳的方式分离原生质体的方法，整个过程只需要一种缓冲液，简化了步骤，降低了原生质体的损坏和污染率，可以批量筛分。

本发明还提供了一种上述植物细胞原生质体纯化仪的纯化方法，包括以下实施例：

实施例1

一种上述植物细胞原生质体纯化仪的纯化方法，包括以下步骤：

s1，电泳室3内装满0.5mol/l的甘露醇溶液，作为缓冲液，开启电源，调节直流电泳仪，使直流电泳仪的电场强度调节在1.5-5v/cm，进行电泳；

s2，电泳开始后，将制备好的10ml菠菜原生质体混合物悬浮液按照6-12滴/分钟的速度滴加入加样室1内直至滴加完毕，然后继续电泳30min；

s3，关闭电源，收集原生质体收集盘5内的原生质体；

制片观察收集到的原生质体的纯度和受损程度，原生质体基本没有损坏，原生质体得率≥70％，获得的原生质体纯度≥95％，纯化率比较高。

此外，我们对生菜、洋葱、空心菜等的原生质体进行分离，原生质体得率≥70％，获得的原生质体纯度≥95％，纯化率比较高。

尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。