一种用于冬虫夏草真伪鉴定的二重PCR检测方法与流程

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种用于冬虫夏草真伪鉴定的二重pcr检测方法。

背景技术：

冬虫夏草(ophiocordycepssinensissym.cordyceps)为麦角菌科真菌冬虫夏草菌寄生在鳞翅目蝙蝠蛾科昆虫蝙蝠蛾幼虫上的子座(子实体)及幼虫尸体的复合体。它是药食两用的名贵滋补药材，主要分布于青藏高原海拔3000m的雪线以上的地区，具有补肺益肾、平喘祛痰、镇静提神、强心壮血的功效，在增强免疫力、抗病毒、抗肿瘤、抗氧化炎症等方面均具有较好的药理作用，具有极高的药用和经济价值。由于其对生长地理环境的特殊要求，及其严格的寄生性，无法进行人工培植和规模化生产替代，自然资源十分稀少，市场供给极为短缺。加之近年来对野生虫草的过渡采挖极大地破坏了虫草生境，虫草资源逐年骤减，使其得显得十分珍贵，价格昂贵。在利益的驱使下，不法商贩采取掺假、造假的手段牟利，从而使市场上充斥着各种各样的伪品。常见的有亚香棒虫草、凉山虫草、新疆虫草、地蚕及模制仿品等，这些伪品外观与冬虫夏草相似，但药用价值和营养价值相差甚远，对虫草的用药安全造成极大的威胁。因此，冬虫夏草真伪鉴定对于肃清和纯净市场，维护消费者权益具有非常重要的意义。

近些年，随着中药鉴定学研究和中药标准化进程的不断发展，中药鉴定新技术、新方法不断应用，尤其分子生物学方法的引入，中药品种混乱的现象得到了极大的改观。冬虫夏草真伪鉴定可通过性状鉴定法、显微鉴定法、理化鉴定法等传统鉴定方法以及近年来发展的分子技术来实现。由于虫草性状及其中活性成分含量受到其生长条件、采收时间、贮藏等因素的影响而发生变化，采用传统方法容易受到干扰而影响鉴定结果的准确性。且传统的这几种方法对亲缘关系较近的物种难以区分，且需要长期经验积累，鉴定结果受主观判断力影响极大，或受专业领域的局限。以核酸和蛋白为基础的分子检测技术具有专一性强、灵敏度高、操作简单等优点，且不受个体形态、大小和完整性的影响，目前已广泛用于检测及鉴定工作中。但目前冬虫夏草真伪鉴定分子检测技术的报道很少，现有的相关研究主要集中于其无性型的分离和鉴定(杨静，2005；liangetal.，2008；zhongetal.，2010；leietal.，2013)。2015年陈士林报道了采用dna条形码技术对冬虫夏草真实性进行鉴定的方法，采用真菌通用its5f/4r引物得到its2序列，通过与数据库中冬虫夏草its2序列比对来鉴定受检样品的真实属性。冬虫夏草是一种复型真菌，根据其所处的不同阶段，分为有性型(子囊孢子阶段)和无性型(分生孢子阶段)。通常所指的冬虫夏草是它的有性型，换句话说，体现其商品性的是整个菌与虫复合体。同一种真菌寄生于不同寄主上，或不同种真菌寄生于同一寄主上，产生的外形相似的复合体就可能作为伪品与正品混淆，而这样的情况极大可能出现在冬虫夏草与其伪品之间。因此，仅针对其真菌(包括其无性型)进行鉴定来判断冬虫夏草真伪是不够的，应该同时结合对其寄主的鉴定。

因此同时针对冬虫夏草中虫草菌及其寄主蝙蝠蛾特异核酸片段，建立一种准确性高，简单适用，易于推广的冬虫夏草高特异性pcr检测方法，可以有效区别冬虫夏草与伪品，或探及含有冬虫夏草成分的产品，成为了本领域技术人员亟待解决的问题。

技术实现要素：

本发明解决的技术问题是：提供一种用于冬虫夏草真伪鉴定的二重pcr检测方法，同时针对冬虫夏草中虫草菌及其寄主，并综合考虑遗传多样性及冬虫夏草菌寄主专一性但非唯一的特点，根据冬虫夏草中虫草菌its及其寄主蝙蝠蛾coi基因序列分别设计两对兼并引物，在同一pcr反应体系中实现对冬虫夏草高特异性检测，解决了现有技术中仅针对其真菌(包括其无性型)来建立冬虫夏草鉴定技术缺乏足够准确性的问题。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

本发明所述的一种用于冬虫夏草真伪鉴定的二重pcr检测方法，在同一个pcr反应体系中同时检测冬虫夏草中虫草菌的its和所述虫草菌寄主的coi基因核酸片段，用于鉴定所述coi基因核酸片段的扩增引物组为：

coi-f：ggaaatcchggatctttaatt

coi-r：gatgccccmgartgtgcaat；

用于鉴定所述its的扩增引物组为：

cits-f10’：gttgcctcggcgggac

cits-r10’-2：cmtttgcttgcttcttgactgag。

进一步地，该方法包括以下步骤：

步骤1：合成引物组：合成所述用于鉴定its基因的扩增引物组和用于鉴定coi核酸片段的扩增引物组；

步骤2：制备dna稀释液；

步骤3：配制pcr反应体系；

步骤4：pcr及电泳检测。

进一步地，步骤1合成的引物浓度均为10μmol/l。

进一步地，步骤2中dna稀释液的浓度为50ng/μl。

进一步地，步骤3中配制pcr反应体系，即将步骤2所得的dna稀释液加入到25μlpcr反应体系中，所述pcr反应体系包括以下组分：

进一步地，步骤4中pcr的反应条件为：95℃预变性5～10min，1个循环；95℃变性15s，56℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；然后延展72℃延伸5～7min。

进一步地，步骤4中的电泳检测为将pcr反应后所得的扩增产物用2.5％琼脂糖凝胶70v电泳40min后凝胶成像仪照相分析。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

(1)本发明方法简单，操作简便，针冬虫夏草的鉴别特异性强，准确度高，重复性好，适宜推广。

(2)本发明首次考虑到冬虫夏草严格的寄生性的特点以及菌与虫的复合体是冬虫夏草商品性存在的前提，同时针对冬虫夏草中虫草菌及其寄主蝙蝠蛾来设计其真伪鉴定的pcr引物。并将针对虫草菌its和其寄主的coi基因两个不同靶标序列的两对引物放在同一个pcr反应体系中，建立高特异性二重pcr检测技术体系，可以有效区别冬虫夏草与伪品，并探及含有冬虫夏草成分的产品。

(3)本发明充分考虑到冬虫夏草菌遗传多态性和寄主非唯一性的特点，采用了兼并引物，保证方法的准确性和有效性。根据genbank中77条冬虫夏草its序列及其古尼虫草、亚香棒虫草、新疆虫草的its序列，在冬虫夏草菌保守稳定但与其他几个伪品序列差异较大的序列区域，以及寄主钩蝠蛾属(thitarodes)、无钩蝠蛾属(ahamus)、蝠蛾属(hepialus)、拟蝠蛾属(parahepialus)coi基因保守稳定但与其他几个近似属差异较大的序列区域，分别设计两对引物，建立针对冬虫夏草的检测鉴定pcr方法。在保守序列段存在变异的碱基位置采用兼并碱基方法，也即设计兼并引物以保证所建立方法可以探及所有冬虫夏草菌及其可能的寄主，本发明方法可以精准有效地检测到所有冬虫夏草(原草)及含有冬虫夏草成分的产品。

(4)本发明直接以基因组dna为模板进行pcr反应，流程少、操作简单，稳定，检测成本低，易推广至普通检测机构中运用，具有更强的适用性。

(5)本发明为虫草真伪鉴定技术标准化奠定基础，对于有效打击制假、售假的不法行为，保障消费大众食药用安全，具有重要意义。

附图说明

图1为本发明流程图

图2为本发明特异性检测冬虫夏草的结果示意图。

图3为本发明对冬虫夏草真实性检测稳定性验证结果示意图。

其中附图1中对应的标记名称为：m-2000marker(天根)，1-虫草阳性对照(标准物质)，2-空白对照，3-冬虫夏草，4-蝙蝠蛾幼虫，5-虫草菌丝，6-亚香棒虫草，7-凉山虫草，8-新疆虫草，9-虫草花(北虫草)，10-淀粉模制伪品，11-玉米，12-水稻，13-大豆，14-油菜，15-鸡，16-猪。

附图2中对应的标记名称为：m-2000marker(天根)，1-冬虫夏草阳性对照品(标准物质)，2-空白对照，3～9-来自西藏七个地区的冬虫夏草样品，10～15-来自青海的六个冬虫夏草样品，16-来自四川的冬虫夏草样品。

具体实施方式

下面结合附图说明和实施例对本发明作进一步说明，本发明的方式包括但不仅限于以下实施例。

如图1所示，一种用于冬虫夏草真伪鉴定的二重pcr检测方法，在同一个pcr反应体系中同时检测虫草菌的its和虫草菌寄主的coi基因核酸片段，用于鉴定所述coi基因核酸片段的扩增引物组为：

coi-f：ggaaatcchggatctttaatt

coi-r：gatgccccmgartgtgcaat；

用于鉴定所述its的扩增引物组为：

cits-f10’：gttgcctcggcgggac

cits-r10’-2：cmtttgcttgcttcttgactgag。

该方法包括以下步骤：

步骤1：合成引物组：合成用于鉴定its的扩增引物组和用于鉴定coi基因核酸片段的扩增引物组；

步骤2：制备dna稀释液；

步骤3：配制pcr反应体系；

步骤4：pcr及电泳检测。

步骤1合成的引物浓度均为10μmol/l。

步骤2中dna稀释液的浓度为50ng/μl。

步骤3中配制pcr反应体系，即将步骤2所得的dna稀释液加入到25μlpcr反应体系中，pcr反应体系包括以下组分：

步骤4中pcr的反应条件为：95℃预变性5～10min，1个循环；95℃变性15s，56℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；然后延展72℃延伸5～7min。

步骤4中的电泳检测为将pcr反应后所得的扩增产物用2.5％琼脂糖凝胶70v电泳40min后凝胶成像仪照相分析。

实施例1

冬虫夏草二重pcr鉴别方法，在同一个pcr反应体系中同时检测虫草菌的its和虫草菌寄主的coi基因核酸片段，步骤如下：

步骤1：合成用于鉴定its的扩增引物组，该扩增引物组为：

cits-f10’：gttgcctcggcgggac

cits-r10’-2：cmtttgcttgcttcttgactgag。

合成用于鉴定coi基因核酸片段的扩增引物组，该扩增引物组为：

coi-f：ggaaatcchggatctttaatt

coi-r：gatgccccmgartgtgcaat。

两组引物的浓度均为10μmol/l。

步骤2：制备dna稀释液；

待测样品dna稀释液：从待测样品中提取dna，并稀释为50ng/μl的dna稀释液；

阳性对照品dna稀释液：从从冬虫夏草阳性对照品(标准物质，购于中国食品药品检定研究院)提取dna，并稀释为50ng/μl的dna稀释液溶液；

空白对照：灭菌纯水(h2o)作为空白对照。

步骤3：配制pcr反应体系；

将步骤2制备好的dna稀释液加入25μl反应体系中即可。

以上25μl反应体系包括以下组分：

本实施例中采用的pcr试剂为taqpcrmastermix(abi，canada)。也可采用quickhsdyemix(toyoboco.，ltd.，osaka，japan)或multiplexpcrkit(qiagengroup，sample&assaytechnologies，japan)。可根据不同试剂采用相应pcr反应体系。

步骤4：pcr扩增和电泳检测分析：

pcr的反应条件为：95℃预变性5～10min，1个循环；95℃变性15s，56℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；然后延展72℃延伸5～7min。

本实施例中采用的是abi公司生产的pcr仪(abiappliedbiosystemsveriti96wellthermalcycler仪器)或eppendorf公司生产的pcr仪(eppendorfmastercycler)。

电泳检测分析：扩增完毕后，对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，并根据是否扩增出两条目标条带而判定样品中是否存在冬虫夏草成分。

该步骤中，对扩增产物用2.5％琼脂糖凝胶电泳分析。

本实施例中的引物组是基于冬虫夏草中冬虫夏草菌its及其寄主蝙蝠蛾coi基因特定位点设计，通过该设计分别扩增113bp和302bp大小的目标片段，可以精准有效地检测到所有冬虫夏草(原草)及含有冬虫夏草成分的产品。

扩增结果分析：若阳性对照和待检测样品均扩增出二条目标条带，而空白对照未出现条带，则可判定检测的样品中含有冬虫夏草成分；若阳性对照扩增出条带，空白对照未出现条带，待检测对照未扩增出条带，则可判定检测的样品中不含有冬虫夏草成分。若待测样品中仅在302bp位置有一条带，表明该样品为蝙蝠蛾，若待测样品中仅在113bp位置有一条带，表明该样品含虫草菌。

实施例2

特异性实验。该实验方法步骤如下：

步骤1：同实施例1

步骤2：制备dna稀释液；

待测样品dna稀释液：从待测样品中提取dna，皆稀释为50ng/μl的dna稀释液；待测样品为冬虫夏草、蝙蝠蛾幼虫、虫草菌菌丝、凉山虫草、亚香棒虫草、新疆虫草、虫草花(北虫草)、淀粉模制伪品、玉米、水稻、大豆、油菜、鸡、猪。

阳性对照品dna稀释液及空白对照同实施例1。

步骤3、步骤4同实施例1。

扩增结果如附图2所示。只有冬虫夏草阳性对照品、冬虫夏草样品中扩增出两条目标条带(泳道1、3)，空白对照、虫草伪品及玉米、水稻、大豆、油菜籽、鸡、猪等其他物种的dna中未能扩增出条带(泳道6～16)，这说明两个引物对coi-f/r和cits-f10’/cits-r10’-2对冬虫夏草特异性非常高。而在蝙蝠蛾幼虫和虫草菌丝中dna分别扩增到302bp(泳道4)、113bp(泳道5)特异条带，证明针对蝙蝠蛾的coi基因的引物对coi-f/r、针对虫草菌的its的引物对cits-f10’/cits-r10’-2的正确性。

实施例3

重复性实验。

采用实施例1的方法对冬虫夏草阳性对照样品(购于中国食品药品检定研究院的冬虫夏草标准物质)和青海、西藏、四川等地搜集到的冬虫夏草样品进行检测。结果如附图3所示。所有冬虫夏草检测样品均可扩增出两条(113bp和302bp)目标条带(泳道1、3～16)，空白对照(泳道2)则未扩增出条带。且该结果可多次重复再现，具有可重复性。因此，本发明对冬虫夏草的真伪鉴别稳定可靠。

按照上述实施例，便可很好地实现本发明。由以上检测结果可得知，本发明的扩增效率高、准确度高、重复性好，结果稳定可靠。

上述实施例仅为本发明的优选实施方式之一，不应当用于限制本发明的保护范围，但凡在本发明的主体设计思想和精神上作出的毫无实质意义的改动或润色，其所解决的技术问题仍然与本发明一致的，均应当包含在本发明的保护范围之内。