本发明涉及药物领域，特别涉及亚氨脲衍生物及其制备方法和用途。
背景技术：
吲哚胺2，3-双加氧酶，是一种含亚铁血红素的单体酶，能催化l-色氨酸的吲哚环氧化裂解生成犬尿氨酸(kynurenine)。吲哚胺2，3-双加氧酶的高表达导致细胞局部的色氨酸耗竭，诱导t细胞停滞于g1期，从而抑制了t细胞的增殖。另一方面，吲哚胺2，3-双加氧酶依赖性的色氨酸降解导致犬尿氨酸水平的提高，也诱导氧自由基介导的t细胞凋亡。第三，上调树突状细胞吲哚胺2，3-双加氧酶的表达通过降解局部色氨酸而加强局部调节性t细胞(treg)介导的免疫抑制，促使机体对肿瘤特异性抗原的外周免疫耐受。吲哚胺2，3-双加氧酶已经成为抗肿瘤免疫疗法最重要的小分子调控靶点。研究发现吲哚胺2，3-双加氧酶与人体的许多生理过程相关，1998年，munn等的研究揭示胎儿能够与其基因型不同的母体安全度过孕期而不被排斥是因为胎盘的合胞体滋养层细胞合成吲哚胺2，3-双加氧酶，后者通过血流抑制母体t细胞排斥胎儿的反应。他们进一步给妊娠小鼠皮下植人了含有吲哚胺2，3-双加氧酶抑制物1一甲基色氨酸的缓释胶囊后，胚胎遭排斥而流产(munndh，zhoum，attwoodjt，etal。preventionofallogeneicfetalrejectionbytryptophancatabolism。scienice，1998，281(5380):1191-3)。此外，一些由异常免疫应答所致的疾病如移植排斥反应、自身免疫性疾病也与吲哚胺2，3-双加氧酶息息相关。尽管近年来肿瘤的治疗手段已经取得了巨大的进步，但临床疗效依然无法令人满意。免疫逃逸是肿瘤发生与转移的主要生物学机制之一，已经成为影响肿瘤治疗效果的重要因素。吲哚胺2，3-双加氧酶作为一种免疫调节酶，可以有效地抑制t细胞功能、增强treg细胞功能以及诱导nk细胞功能紊乱，而肿瘤细胞可以利用这些机体固有的免疫调节机制来逃避免疫系统的识别与杀伤(贾云泷，王郁。中国肿瘤生物治疗杂志，2004，21(6)：693-7)。为了使肿瘤患者能够从治疗中获得最佳收益，针对肿瘤免疫逃逸来合理地调整治疗策略已经势在必行。本发明中的吲哚胺2，3-双加氧酶抑制剂可有效调节患者的免疫系统，阻断肿瘤细胞的免疫逃逸，对大部分的自发性肿瘤均具有良好的治疗效果。基于对免疫系统的调节作用，本发明中的吲哚胺2，3-双加氧酶抑制剂除了可对肿瘤进行治疗外，还可以对与免疫有关的其它疾病如慢性感染及艾滋病进行治疗。吲哚胺2，3-双加氧酶与神经系统疾病也密切相关，它能降低5-羟色胺的水平而导致抑郁、焦虑等精神疾病，也可造成脑中喹啉酸等具有神经毒性的代谢产物的累积，这与神经退行性疾病如阿尔茨海默病的发生密切相关。吲哚胺2，3-双加氧酶至少可通过两种机制影响脑的功能:1)在炎症反应时通过代谢色氨酸，降低了循环的色氨酸浓度，从而使5-羟色胺水平降低，导致抑郁；2)催化色氨酸循犬尿氨酸途径代谢使犬尿氨酸和神经毒性喹啉酸累积。(孔令雷，匡春香，杨青。中国药学化学杂志，2009，19(2)：147-154)。技术实现要素：本发明提供了式i化合物或其药学上可接受的盐：其中，r1选自以下取代基：h，氨基，砜基，硝基，羰基，脒基，c1-6烷基，被卤素、羟基、羧基、羰基、醛基、氰基、氨基、芳基、杂芳基、c3-12环烷基、c1-6烯基、c3-12环烯基取代的脒基或c1-6烷基或c1-6烷氧基或羰基；n取0-6的整数，如0，1，2…6。如式i所述的结构式，r1取h，得结构式ii如式i所述的结构式，r1取被r0取代的羰基，得结构式ii：其中r0选自h，c1-6烷基，被卤素、羟基、羧基、羰基、醛基、氰基、氨基、芳基、杂芳基、c3-12环烷基、c1-6烯基、c3-12环烯基取代c1-6烷基或c1-6烷氧基。进一步的，r0选自c1-6烷基，被卤素、羟基、羧基、羰基、醛基、氰基、氨基、芳基、杂芳基、c3-12环烷基、c1-6烯基、c3-12环烯基取代c1-6烷基或c1-6烷氧基。本发明公开了上述的各通式化合物中的具体物质代表：本发明的通式以及通式合成方法中可以衍生出不限于这些具体物质，且在本发明的通式和通式合成方法的指导下，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可得到的具体化合物，均在本发明范围内。本发明提供上述化合物的合成方法，即通用合成方法一，步骤如下：1)1a氧化得到2a；2)1与2a在碱性条件下反应以得2；3)2与3a反应以得i，所述的氧化剂优选自但不限于二氧化锰，浓硫酸，浓硝酸，高锰酸钾，高氯酸钾，氯化铁，dmdo(二甲基过氧化铜),双氧水,臭氧或过氧乙酸中的至少一种；所述的碱选自但不限于碱金属或碱土金属的氢氧化物；优选为氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钡。本发明提供上述化合物的合成方法，即通用合成方法二，步骤如下：1)2＇与3a＇反应得iia；2)iia在酸性条件下脱保护，然后在碱性条件反应得ii，所述的碱选自但不限于碱金属或碱土金属的氢氧化物，优选为氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钡。本发明提供上述化合物的合成方法，即通用合成方法三，步骤如下：式iia在酸性条件下反应得到式ii＇。其中，n为0或1或2或3或4。本发明提供上述化合物的合成方法，即通用合成方法四，步骤如下：1)ii的盐与4a反应生成iiia，其中r3选自h，oh，cn，ch3-mxm，硝基，c1-9烷基，c1-9烷氧基，c3-9环烷氧基，c3-12环烷基，c1-6杂烷基，3-12元杂环烷基，芳基，杂芳基，被卤素、羟基、羧基、羰基、醛基、氰基、氨基、砜基、芳基、杂芳基、c3-12环烷基、c3-12环烯基取代c1-6烷基或c1-9烷氧基或芳基或杂芳基或羰基，m为1或2或3；优选m为2或3；2)iiia在践行条件下生成iii，具体的，所述r3选自h，oh，cn，ch3-mxm，硝基，c1-9烷基，c3-9环烷氧基，c3-12环烷基，c1-6杂烷基，3-12元杂环烷基，芳基，杂芳基，被卤素、羟基、羧基、羰基、醛基、氰基、氨基、砜基、芳基、杂芳基、c3-12环烷基、c3-12环烯基取代c1-6烷基或c1-9烷氧基或芳基或杂芳基。进一步地，所述r3选自h，oh，cn，cf3，chcl2，ch2cl，硝基，甲基，乙基，丙基，异丙基，丁基，异丁基，仲丁基，叔丁基，戊基，1-甲基丁基，2-甲基丁基，3-甲基丁基，1，1-二甲基丙基，2，2-二甲基丙基，1，2-二甲基丙基，1-乙基丙基，己基，戊基甲基，戊基乙基，戊基丙基，戊基丁基，己基甲基，己基乙基，己基丙基，环丙基，环丁基，环戊基，环己基，环丙甲基，环丙乙基，环丙基丙基，环丁甲基，环丁乙基，环丁丙基，环戊甲基，环戊乙基，环戊丙基，环己甲基，环己乙基，环己丙基，对甲氧基苄基(pmb)，苄基(bn)；或r3选自取代呋喃，吡咯，噻吩，吡唑，咪唑，噁唑，噻吩，异噁唑，异噻唑，吡啶，吡喃，噻喃，哒嗪，吡啶，吡嗪，哌嗪中的任一一种，与苯环成两位取代，即形成苯并呋喃，苯并吡咯，……苯并哌嗪；或所述式4a中的基团选自咔唑，吖啶，吩嗪或吩噻嗪。本发明所提供的合成方法仅为实现各合成目标化合物及其中间体的一种途径，其中所述的各步骤及编号，如1a、2a、3a、4a、1、2、3等均为独立的，不限于本发明的方法所制备而得。未经特别说明的，本发明上述或下述的各步反应所选用的溶剂为本领域常规溶剂，其选用原则是溶解反应物但不参与反应，萃取产物或使相应产物在其中结晶与杂质分离，如水、卤代烷烃、烷胺、脂肪烃类、酯类、醇类、芳香烃类、醚类、杂环类溶剂；具体选自，但不限于这些溶剂：甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、乙醚、乙酸乙酯、乙酸、环己烷、二氯甲烷、三氯甲烷、四氢呋喃、吡啶、二乙胺、三乙胺、二甲基甲酰胺、甲苯及其中至少两种的混合。未经特别说明的，本发明上述或下述的各反应中，当反应物有过量时，反应终止可采用加入可与过量反应物反应的物质进行淬灭反应。未经特别说明，本发明上述或下述的各反应中，各步反应中的产物的纯化方式选自萃取、结晶、除溶剂、柱层析；其操作均为本领域常规技术，本领域技术人员能够根据具体情况进行处理。本发明通式中所用各编号是为了叙述通式方便采用的编号，它们在具体实施例中可以将其变形为其它编号，如1，2，3等，均是为了方便叙述，为不影响其结构式及其反应方程式的实质属于通式及通式反应方程式的表达。通式i-iii所涵盖的化合物及其具体物质代表中的手性异构或顺反异构体及异构体间以任何比例的混合物亦涵盖在通式i-iii所涵盖的化合物及其具体物质代表范围内。本发明提供药物组合物，包含上述化合物，即通式i-iii所涵盖的化合物及其具体物质代表，或其药学上可接受的盐，和一种或多种药学上可接受的药用辅料。本发明所述的“药学上可接受的盐”是指药学上可接受的酸和碱加成盐和溶剂化物。这类药学上可接受的盐包括酸的盐。酸包括盐酸、硫酸、硝酸、磷酸、氢溴酸、氢碘酸、甲酸、乙酸、对甲苯磺酸、亚磺酸、甲磺酸、苯甲酸、富马酸、柠檬酸、酒石酸、马来酸、脂肪酸。无毒药物碱加成盐包括碱的盐，这些碱包括钠、钾、钙、镁、铝、铵。本发明提供上述化合物或其药学上可接受的盐，可抑制吲哚胺2,3-双加氧酶的活性，可用于制备治疗具有吲哚胺2,3-双加氧酶介导的色氨酸代谢途径的病理学特征疾病的药物；所述药物用于治疗癌症、感染性疾病、神经退行性病变、抑郁症、焦虑症或与年龄相关的白内障；其中所述癌症选自肺癌、肝癌、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、前列腺癌、脑癌、卵巢癌、宫颈癌、睾丸癌、肾癌、头颈癌、淋巴癌、黑色素瘤或白血病；所述的神经退行性疾病指阿尔茨海默病；所述的感染性疾病指由细菌、真菌、病毒或寄生虫引起的感染。活性测试结果显示，本发明所得化合物具有优异的酶抑制活性，并且抑制效果明显优于化合物incb024360。体内试验结果表明本发明中的化合物对肿瘤具有较高的抑制率，对肿瘤的治疗效果明显优于现有化疗药环磷酰胺及化合物incb024360，并且通过测定给药前后小鼠的体重发现本发明中吲哚胺2，3-双加氧酶抑制剂在用于肿瘤治疗时可明显降低药物副作用，显著提高小鼠的生存质量，表现在临床上不仅可提高患者的生存质量，并可大大提高患者的用药依从性及药物的有效性。本发明中的化合物可显著改善动物学习记忆损害，提高学习获得能力和空间记忆能力，对阿尔茨海默综合症等神经退行性疾病具有积极的治疗意义。通过t细胞增殖反应实验发现本发明中的化合物可以促进dc刺激t细胞增殖的作用，进而可用于肿瘤疾病、自身免疫性疾病、移植排斥反应以及感染性疾病的治疗。本发明中的吲哚胺2，3-双加氧酶抑制剂在用于制备治疗具有吲哚胺2，3-双加氧酶介导的色氨酸代谢途径的病理学特征疾病的药物时具有如下技术优势：(1)抗肿瘤作用显著，本发明中的化合物具有明显的吲哚胺2，3-双加氧酶抑制活性，并且体内试验显示本发明中化合物的抑瘤率明显高于阳性对照药环磷酰胺及化合物incb024360。(2)副作用降低，本发明的化合物为吲哚胺2，3-双加氧酶抑制剂，通过抑制吲哚胺2，3-双加氧酶的活性逆转t细胞的增殖抑制调节机体的免疫功能，从而完成人体免疫系统对肿瘤细胞的监视及杀伤作用。基于这种特殊的作用机制，此种化合物在抑制肿瘤细胞生长的同时对人体正常细胞的生长无不良影响，因此明显减少了药物副作用。并且对与t细胞增殖相关的自身免疫性疾病、移植排斥反应以及感染性疾病有显著的治疗效果。(3)治疗阿尔茨海默等神经退行性疾病时效果显著，可明显改善动物学习记忆损害，显著提高学习获得能力和空间记忆能力。具体实施方式：下面结合具体的实施方式对本发明做进一步描述，但本发明并不受其限制。且在本发明的通式、通式合成方法及具体的实施方式的指导下，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可得到的具体化合物，均在本发明范围内。实施例13047的合成反应1将化合物1a(682mg，2mmol)溶解在三氟乙酸(13ml)，然后室温下滴加30％h2o2，反应在50℃过夜，反应液由浑浊状变为澄清黄色溶液，反应完毕后用饱和亚硫酸钠溶液淬灭，ki淀粉试纸显示无色后，用乙酸乙酯(50ml*2)萃取，有机相用无水硫酸钠干燥，浓缩后柱层析(石油醚→石油醚：乙酸乙酯＝1醚：乙：1)得到淡黄色固体2a(500mg，收率67％)。反应2将乙二胺1(30mg，0.5mmol)加入到化合物2a(170mg，0.5mmol)的四氢呋喃(10ml)溶液中，然后加入1nnaoh(0.4ml)，反应液室温搅拌0.5h，反应液直接制备得到化合物2(120mg)。反应3化合物2(120mg，0.33mmol)和化合物3a(100mg，0.33mmol)的甲醇(10ml)溶液在室温搅拌过夜，反应液浓缩后柱层析(石油醚→石油醚：乙酸乙酯＝1醚：乙：1)得到化合物3(42mg，23％)反应4将三氟乙酸(0.6ml)加入化合物3(31mg，0.05mmol)的二氯甲烷(3ml)溶液中，室温搅拌过夜，反应液浓缩后pre-hplc制备得到xsd3-047(9mg，收率68％)。目标化合物的1h-nmr(400mhz，dmso-d6):δ(ppm):11.4(s，1h)，8.88(s，1h)，7.22-7.11(m，2h)，6.71-6.5(m，3h)，6.38-6.21(m，2h)，3.37(m，3h)，3.01(m，2h)。ms:m/z401.2[m+1]。实施例23048的合成反应1将丙二胺(35mg，0.5mmol)加入到化合物1(170mg，0.5mmol，合成方法详见xsd3-047finalreport中化合物2a的合成)的四氢呋喃(10ml)溶液中，反应液室温搅拌0.5h，反应液直接制备得到目标产物130mg。反应2化合物2(130mg，0.33mmol)和化合物1a(100mg，0.33mmol)的甲醇(10ml)溶液在室温搅拌过夜，反应液浓缩后柱层析(石油醚→石油醚：乙酸乙酯＝1醚：乙：1)得到目标产物3(78mg，45％)。反应3将三氟乙酸(0.6ml)加入化合物3(31mg，0.05mmol)的二氯甲烷(3ml)溶液中，室温搅拌过夜，再用1nnaoh溶液调至ph＝12，继续搅拌20min，lcms监测反应，反应完毕后用0.5nhcl将反应液调至中性，反应液浓缩后pre-hplc制备得到目标产物(9mg，收率68％)。目标化合物的1h-nmr(400mhz，dmso-d6):δ(ppm):11.4(s，0.6h)，8.88(s，1h)，7.6(s，1h)，7.4-6.7(m，6h)，6.7(s，1h)，6.24(s，1h)，3.19-3.14(m，4h)，1.75(m，2h)。ms:m/z415.2[m+1]实施例33049的合成反应1将化合物1(384mg，1mmol，制备方法详见xsd3-047的finalreport)和化合物1(100mg，1.1mmol)的四氢呋喃(10ml)溶液室温下搅拌48h，反应液直接制备得到目标产物2(89mg，收率20％)。反应2将化合物(89mg，0.2mmol)溶解到thf(10ml)中，再用1nnaoh溶液调至ph＝12，继续搅拌20min，lcms监测反应，反应完毕后用0.5nhcl将反应液调至中性，反应液浓缩后pre-hplc制备得到目标产物(13mg，收率15％)。目标化合物的1h-nmr(400mhz，dmso-d6):δ(ppm):11.47(s，0.6h)，8.92(s，1h)，7.50-7.09(m，5h)，6.70(s，1h)，6.28(s，1h)，2.72-2.50(m，4h)，2.50(m，3h)。ms:m/z416.2[m+1]。实施例43051的合成反应1将化合物1(102mg，0.016mmol，合成方法见xsd3-047finalreport)溶解在thf(10ml)中，然后室温下加入1nnaoh溶液(0.1ml)，室温搅拌0.2h，lcms监测反应，反应完毕后用0.5nhcl溶液调ph至中性，制备的到目标化合物52mg。目标化合物的1h-nmr(400mhz，dmso-d6):δ(ppm):11.45(s，1h)，8.89(s，1h)，8.24(m，1h)，7.76-7.77(m，2h)，7.14-7.20(m，2h)，7.18(s，1h)，6.31(s，1h)，3.33-3.67(m，4h)，1.44-1.48(m，18h)。ms:m/z601.2[m+1]。实施例53053的合成将化合物1(52mg，0.1mmol，合成方法参见xsd3-048finalreport)溶解在thf(10ml)，然后室温下加入tfa(0.5ml)，室温搅拌12h，lcms检测反应，pre-hplc得到目标化合物15mg。目标化合物的1h-nmr(400mhz，dmso-d6):δ(ppm):11.44(s，1h)，10.85(s，1h)，8.91(s，1h)，8.49(s，1h)，7.18-7.09(m，3h)，6.78-6.75(m，1h)，6.28-6.25(m，1h)，3.33-3.19(m，4h)，1.85-1.78(m，2h)，1.5(s，3h)。lc-ms表征结果:m/z515[m+1]。实施例6吲哚胺2，3-双加氧酶抑制活性检测和ic50的测定含人吲哚胺2，3-双加氧酶基因的质粒的构建、在大肠杆菌中的表达、提取及纯化均按littlejohn等报道的方法进行(takikawao，kuroiwat，yamazakif，etal.j.biol.chem.1988，263，2041-2048)。在96孔板中将50mm磷酸钾缓冲液(ph6.5)，20mm抗坏血酸盐，20μm亚甲基蓝和纯化的人吲哚胺2，3-双加氧酶蛋白混合，向混合物中加入200μml-色氨酸和抑制剂。反应在37℃下进行60分钟，通过添加30％三氯乙酸来停止反应，并于65℃温育15分钟以使n-甲酰基犬尿氨酸水解为犬尿氨酸，于3400g离心5min以去除沉淀的蛋白，上清液转移到新的96孔板内，加入2％(w/v)的对-二甲氨基苯甲醛的乙酸溶液中反应，反应于25℃温育10分钟，并于480nm在分光光度计上读数。没有吲哚胺2，3-双加氧酶抑制剂或没有吲哚胺2，3-双加氧酶的作为对照孔，用以测定每种化合物的ic50所必须的非线性回归的参数。非线性回归和ic50值的测定使用graphpadprism4软件进行。ic50小于10μm的化合物在该检验中被认为是有效抑制剂。表1各化合物的ic50结构式编号ic50(nm)304737304820304922305123305316incb024360102实施例7吲哚胺2，3-双加氧酶抑制剂的体内抗肿瘤活性测试1.动物分组及试验方法取对数生长期的llc细胞，台盼蓝染色法检测细胞活力，调节活细胞浓度为1×107个/ml，按0.2ml/只，皮下注射到同源c57bl6小鼠体内。一旦肿瘤建立，将小鼠按瘤重和体重随机分成模型组、环磷酰胺(ctx)组、化合物incb024360组、化合物组3047组，每组10只，ctx组按150mg·kg-1腹腔注射给药，化合物incb024360组、化合物3047组灌胃给药，模型组同一时间给予同体积的生理盐水，各组给药频次均为每天一次。给药21天后结束试验。末次给药24h后称重处死动物，取瘤称重，计算平均抑瘤率(inhibitionrate，i)，公式如下：i＝(1-给药组平均瘤重/模型组平均瘤重)×100％2.数据统计及处理方法实验数据采用spss16.0，单因素方差onewayanova分析，p<0.05为差异有统计学意义。3.试验结果及讨论表2化合物对小鼠体内llc肿瘤的抑制结果与模型组相比，##p＜0.01；与ctx组及incb024360组相比，※p＜0.05；从表2可以看出，各给药组瘤重与模型组相比均具有显著性差异(p＜0.01)；化合物3047组与环磷酰胺组及incb024360组相比具有显著性差异(p＜0.05)。此结果表明本发明中的化合物对肿瘤的治疗效果明显优于现有化疗药环磷酰胺及化合物incb024360对肿瘤的治疗效果。表3化合物对小鼠体重的影响与环磷酰胺组比较，##p＜0.01从表3可看出，化合物3047组与模型组相比小鼠体重无明显差别，与ctx组比较有显著性差别，此结果说明本发明中的化合物在控制肿瘤生长的同时可增加小鼠的体重，减少了药物副作用，显著提高小鼠的生存质量。临床上可提高患者的生存质量并大大提高患者的用药依从性及药物的有效性。此外，我们还用小鼠结肠癌colon26、小鼠肝癌hepa1-6、小鼠乳腺癌4t1等细胞株进行了试验，结果显示本发明中的化合物对这些肿瘤均具有显著的抑制作用。实施例8morris水迷宫检测阿尔茨海默小鼠的行为学变化1.动物分组及试验方法本发明选用9月龄小鼠根据richardson等在大鼠双侧海马ca3区单次注射聚集态aβ1-42的方法制作ad模型，将其随即分为模型组，化合物incb024360组，化合物3047组，每组10只，雌雄各半。利用morris水迷宫进行小鼠行为学分析(荷兰noldus公司ethovisionxt监测分析软件，morris水迷宫系统)。水迷宫试验过程分为连续5d的隐藏平台获得试验和第6天的空间探索试验两部分，每次试验前按试验分组和设计剂量给药。每天训练4次，每次使小鼠在不同区域下水，水迷宫按东南西北分为1、2、3、4区域，平台即第5区域，位于第4区域内。每次游泳时间60s，每次训练间隔1h左右，小鼠没有找到平台按60s计算潜伏期。隐藏平台获得试验检测小鼠学习获得能力；空间探索试验检测小鼠空间记忆能力。2.数据统计及处理方法利用spss16.0软件统计分析，隐藏平台获得试验中的逃避潜伏期采用多重测量的方差分析学习试验是否有效；空间搜索试验中的各象限的游泳时间和穿越目标次数采用单因素方差分析。数据采用均数±标准差，差异显著水平设为双侧p＝0.05。3.试验结果及讨论表4各组动物隐藏平台试验中搜索平台潜伏期(s)与模型组比较，#p＜0.05，##p＜0.01，与incb024360组比较，※p＜0.05，※※p＜0.01。表5各组动物平台区域停留时间及次数与模型组比较，#p＜0.05，##p＜0.01，与incb024360组比较，※p＜0.05。从表4和表5可以看出，化合物3047可显著改善动物学习记忆损害，显著提高学习获得能力和空间记忆能力，并且效果优于化合物incb024360，此结果表明，本发明中的化合物在对阿尔茨海默综合症的治疗方面具有巨大的开发价值。实施例9药物处理后dc刺激的t细胞增殖反应树突状细胞(dendriticcell，dc)是功能最强的抗原递呈细胞(apc)，能有效地激活初始t细胞(naivetcell)进行增殖，是dc与其他apc最主要的区别。dc是免疫应答的启动者，由于其在cd4+，cd8+t细胞免疫应答反应中所起的关键作用，dc已成为当今免疫学研究热点之一，目前主要集中研究dc在肿瘤疾病、自身免疫性疾病、移植排斥反应以及抗感染中的防治作用。1.人外周血树突状细胞的分离培养取人外周血白细胞层，用0.01mol/lpbs等倍稀释。用淋巴细胞分层液常规分离pbmc，以完全rpmi1640培养液调整细胞浓度至3×106ml-1，加入6孔板中，3mlp孔，5％co2，37℃培养箱中培养2小时，以pbs洗去非粘附细胞，共3次，加入含il-4(100u/ml)、gm-csf(150ng/ml)和tnf-α(500u/ml)的培养液常规培养，隔日半量换液，培养8天后供鉴定和实验用。2.t细胞的制备用步骤1中的方法分离人pbmc层，贴壁法除巨噬细胞，用尼龙毛柱法除去b细胞，获得的t细胞调整细胞浓度至1×106个/ml。3.dc的制备将纯度为99％的成熟dc离心，加入rpmi1640调整细胞浓度为1×105，4×104，2×104个/ml，加入96孔板中，每个浓度设置两孔，100μl/孔。分别加入化合物incb024360和化合物3047，共同培养2天。4.t细胞增殖实验(mlr)在上述各加药组dc中加入t细胞，100μl/孔。5％co2，37℃培养箱中培养72小时，培养结束前6小时每孔轻轻吸出100μl培养液，加入mtt(5mg/ml)10μl，放入培养箱中继续培养6小时后，加入0.01mol/lhcl-10％sds100μl，放37℃过夜，用酶标仪测a570nm值示t细胞增殖水平。5.实验结果及分析表6化合物3047对dc刺激t细胞增殖作用的影响与对照组比较，#p＜0.05，##p＜0.01，与incb024360组比较，※p＜0.05。由表6可以看出，与对照组相比，化合物3047组及incb024360组t细胞数量明显增加，具有显著性差异(#p＜0.05，##p＜0.01)，且化合物3047组与化合物incb024360组相比对t细胞的增殖效果更加明显，具有显著性差异(※p＜0.05)。这表明本发明中的化合物具有显著的促进dc刺激t细胞增殖的作用，且效果明显优于化合物incb024360，进而可用于肿瘤疾病、自身免疫性疾病、移植排斥反应以及感染性疾病的治疗。当前第1页12