马蔺重金属ATP酶转运蛋白IlHMA2及其编码基因与应用的制作方法

本发明涉及分子生物学和基因工程技术领域，具体地说，涉及马蔺重金属atp酶转运蛋白ilhma2及其编码基因与应用。

背景技术：

随着我国工农业的快速发展，土壤重金属污染问题日益加剧。其中，与其它重金属元素相比，镉(cd)更易溶于水，具有极强的生物毒性(guoetal.2013)。归其原因是土壤中cd²⁺极易被植物根系吸收，导致大量的cd²⁺积累在植物体内,造成产量和品质下降，更为严重的是通过食物链进入人体,对人类的健康构成严重威胁(clemens，2006；uenoetal.2010；takahashietal.2012)。因此，如何行之有效地控制和减轻镉对环境的污染和危害已成为一个亟待解决的问题。

植物修复技术是利用重金属超积累植物对重金属的吸收能力，将土壤中的重金属富集并转运至植株地上部，以达到降低土壤中重金属含量的目的(saltetal.1995；yangetal.2005；王欣，2010；hanikenneandnouet，2011)。与传统的物理、化学修复手段相比，植物修复手段具有成本低、对土壤扰动性小、不造成二次污染等优点，是一种能源节约型和环境友好型修复土壤重金属污染的最佳方法(guoetal.2014)。然而，大多数重金属超积累植物，往往体型较小或呈莲座型生长，而且生长缓慢、生物量低，这严重限制了植物修复效率及其应用。随着分子生物学技术的快速发展，应用基因工程技术将重金属超积累植物耐重金属基因转入到生物量大、生长速率快的植物中提高它们对重金属的耐受性与富集能力，从而提高植物修复效率与实用性。因此对耐重金属基因的研究成为当下热点。

研究表明，重金属atp酶(heavymetalp1b-atpase)转运蛋白hma广泛存在于细菌、人及高等植物中，主要负责重金属离子的转运及解毒过程，在维持植物体内重金属离子稳态中起主要作用(axelsenandpalmgren，1998；williamsandmills，2005)。其中，hma2/4在植物体内cd²⁺长距离运输及解毒中起关键性作用。马蔺又名马莲(irislacteapall.var.chinensis(fisch.)koidz.)是鸢尾科鸢尾属多年生宿根草本植物，广泛分布于我国北方地区，对镉表现出极强的耐受性和富集能力(guoetal.2017)。然而，目前有关ilhma2在马蔺体内cd²⁺长距离运输及解毒中的作用机制研究尚未见报道。鉴于此，我们从马蔺中克隆得到重金属atp酶转运蛋白基因ilhma2，并将其导入到至烟草中，显著增强了烟草对镉的耐受性与富集能力，为培育出高效富集镉特性的转基因植物提供了新思路，在土壤镉污染的修复方面具有广阔的应用前景和实践价值。

技术实现要素：

本发明的目的是提供马蔺重金属atp酶转运蛋白ilhma2及其编码基因与应用。

为了实现本发明目的，本发明马蔺重金属atp酶转运蛋白ilhma2，其氨基酸序列如seqidno:2所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。

编码上述蛋白的基因ilhma2，其核苷酸序列为：

i)seqidno:1所示的核苷酸序列；或

ii)seqidno:1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列；或

iii)在严格条件下与seqidno:1所示序列杂交且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列，所述严格条件为在含0.1％sds的0.1×sspe或含0.1％sds的0.1×ssc溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜；或

iv)与i)、ii)或iii)的核苷酸序列具有90％以上同源性且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列。

本发明还提供表达盒、表达载体或克隆载体，其包括包含所述基因ilhma2的核酸序列。

本发明还提供含有所述基因ilhma2、或者上述表达盒、表达载体或克隆载体的工程菌、转基因细胞系。

携带有所述目的基因的表达载体可通过使用ti质粒、植物病毒载体、直接dna转化、微注射、电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞中(weissbach，1998，methodforplantmolecularbiologyviii，academypress，newyork，第411-463页；geiserson和corey，1998，plantmolecularbiology，2^ndedition)。

本发明还提供所述基因ilhma2在提高植物对镉的耐受性与富集能力或提高植物体内镉的转运能力中的应用。

本发明所述植物包括单子叶植物或双子叶植物。优选地，所述单子叶植物为谷类作物、草本能源植物或草坪草。所述双子叶植物为烟草或拟南芥。

本发明进一步提供一种转基因植株的构建方法，采用农杆菌介导的方法，将含有所述基因ilhma2的重组表达载体转化目标植物，筛选转基因植株。

优选地，所述重组表达载体的出发载体为植物双元表达载体pcambi3301。

本发明首次克隆获得马蔺重金属atp酶转运蛋白ilhma2的编码基因，基因ilhma2可用于增强植物对镉的耐受性与富集能力或提高植物体内镉的转运能力，进而提高植物对土壤镉污染的修复效率。实验证明，ilhma2具有与cd²⁺转运相关的功能，将其转入到烟草中，能显著增强烟草对镉的耐受性与富集能力，从而提高植物的修复效率和实用性。利用基因工程技术制备得到具有耐镉性与富集能力强的转基因植物，使其可以在镉污染环境中生长，为培育高效镉富集转基因植物提供新的思路，在提高土壤镉污染修复效率与改善生态环境方面具有重要的应用前景，将为重金属污染土壤的修复提供新的途径和技术支撑。

附图说明

图1为本发明马蔺ilhma2与小麦tahma2、水稻oshma2以及拟南芥athma2氨基酸多重序列比较结果。

图2为本发明实施例3中马蔺ilhma2基因与其它植物hma基因的系统进化树分析结果；其中，ahhma2(鼠耳芥)、alhma2(琴叶拟南芥)、athma2/4(拟南芥)、bjhma4(芥菜)、brhma2(芜菁)、bnhma2/4(欧洲油菜)、cashma2/4(亚麻荠)、cchma2(克萊门柚)、cishma2(橙子)、crhma2(荠菜)、cshma2/4(黄瓜)、eshma2(山嵛菜属)、hvhma2(大麦)、ilhma2(马蔺)、mthma2(蒺藜苜蓿)、nchma4(天蓝遏蓝菜)、obhma2(短花药野生稻)、oshma2(水稻)、pehma2(胡杨)、rchma2(蓖麻)、sbhma2(高粱)、sthma2(马铃薯)、tahma2(小麦)、tchma3(可可树)、vvhma3(葡萄)、zmhma2(玉米)。

图3为本发明实施例4中不同浓度镉(cdcl2·2.5h2o)处理24h后马蔺地上部和根中ilhma2基因相对表达水平分析结果。图中每个点均代表平均值±标准误(n＝3)。

图4为本发明实施例5中构建的植物双元表达载体pcambi3301-ilhma2；其中，a为双元表达载体的结构示意图；b为双元表达载体构建酶切检测，m1：dnamarkerdl10000，1：双元表达载体质粒经bglii和bsteii酶切；c为双元表达载体构建pcr检测，m2：dnamarkerdl5000，2：以双元表达载体质粒为模板的pcr鉴定。

图5为本发明实施例6中转基因烟草植株分子鉴定示意图；其中，a为转基因烟草pcr扩增检测，m3：dnamarkerdl1500，p：阳性对照，wt：野生型，oe1-12：t2代各转基因烟草株系；b为半定量rt-pcr对转基因烟草相对表达水平的检测，wt：野生型，oe1-12：t2代各转基因烟草株系。

图6为本发明实施例7中镉胁迫14d后对野生型(wt)与转基因烟草株系(oe2、oe11)耐受性的影响；其中，a为0mg/l和50mg/lcdcl2·2.5h2o胁迫14d后对wt与oe2、oe11转基因烟草株系(a)生长状况、(b)地上部干重与(c)根中干重的影响。图中每个点均代表平均值±标准差(n＝8)，柱上不同字母分别表示野生型与转基因烟草株系间差异显著(p<0.05)。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如sambrook等分子克隆实验手册(sambrookj&russelldw,molecularcloning:alaboratorymanual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

实施例1马蔺重金属atp酶转运蛋白基因ilhma2的克隆

将水培培养至8周龄的马蔺幼苗在100mg/lcdcl2·2.5h2o的hoagland营养液中胁迫处理24h，剪取根部经无菌水冲洗后，置于消毒滤纸上吸干水分，称取其鲜根100mg，于液氮中充分研磨，按照takaraminibestplantrnaextractionkit试剂盒说明书提取总rna，利用quawell5000核酸蛋白仪测定浓度，并经1.2％的甲醛变性凝胶电泳检测其rna完整性，取1μg总rna，按照takaraprimescriptrtasecdna第一链合成试剂盒说明书进行反转录，合成cdna。

根据ncbi数据库已公布的植物重金属atp酶转运蛋白基因hma核苷酸序列，通过dnaman8.0软件找出高度保守的区域，并遵循同源性高和简并性低的原则，利用primer5.0软件设计一对核心简并性引物p1和p2，利用rt-pcr方法获得马蔺hma基因核心片段，将该片段pcr扩增产物经回收、纯化、加a以及ta克隆测序，序列长度为265bp。

按照clontechsmarterrace试剂盒说明书合成5’-race和3’-race的方法，分别合成5’-cdna和3’-cdna；以马蔺hma基因核心序列为基础，利用dnaman8.0和primer5.0软件分别设计5’-race外侧引物p3、巢式引物p4和3’-race外侧引物p5、巢式引物p6；smarterrace试剂盒自带外侧引物为upm、自带内侧引物为nup；利用rt-pcr方法分别获得马蔺hma基因5’-race和3’-race片段，将这些片段pcr扩增产物经回收、纯化、加a以及ta克隆测序，5’-race片段序列长度为897bp，3’-race片段序列长度为2898bp；最后将以上三个片段拼接得到马蔺hma基因全长cdna，序列长度为3538bp(seqidno:1)，包含2829bp的开放阅读框(orf)，29bp的5’非翻译区(utr)和680bp的3’-utr，编码942个氨基酸(seqidno:2)。通过computepi/mw程序(http://web.expasy.org/compute_pi/)预测其等电点为8.12，蛋白质分子量为101.5kda。blast分析表明，其克隆到的hma基因与已知植物hma2基因的同源性达到60％以上，故将其命名为ilhma2。

引物序列如下：

p1:5’-tcvctkgtytgggctggnac-3’

p2:5’-gtataasaagkgccaawttcat-3’

p3:5’-atcacagccacaccagctgctatga-3’

p4:5’-ccattctagccacagcagaatcct-3’

p5:5’-ggcggtctctgttggtttgtatcc-3’

p6:5’-gggacgggtcaagttgtggat-3’

upm:

long(0.4μm):

5’-ctaatacgactcactatagggcaagcagtggtatcaacgcagagt-3’

short(2μm):5’-ctaatacgactcactatagggc-3’

nup:5’-aagcagtggtatcaacgcagagt-3’

实施例2马蔺重金属atp酶转运蛋白ilhma2结构特征的预测分析

运用tmpred程序(http://www.ch.embnet.org/software/tmpred_form.html)对马蔺ilhma2的跨膜区进行预测，ilhma2具有8个跨膜区(tm1-tm8)。通过ncbi网站blast比对ilhma2与小麦、水稻和拟南芥植物的hma2蛋白同源性分别为68％、66％和55％，并对其ilhma2蛋白进行功能预测，结果显示含有重金属p1b-atp酶特有的giccpse、cpc、dktgt、hp以及gdgmndapal基序(图1)。其中，n端含的有金属结合域的基序为giccpse，属于金属相关调节的功能域；cpc位点负责金属离子传导、dktgt是磷酸化结合位点起到酶的磷酸化作用；hp位点涉及金属离子的易位；gdgmndapal是atp结合域，负责能量转导。进一步利用dnaman8.0软件对ilhma2与小麦tahma2、水稻oshma2和拟南芥athma2的氨基酸序列多重比较，发现马蔺hma2蛋白功能的结构域与这些植物高度保守(图1)。因此，马蔺ilhma2属于重金属atp酶转运蛋白。

实施例3马蔺重金属atp酶转运蛋白基因ilhma2的系统进化树分析

为了分析马蔺ilhma2基因与其它植物hma基因的亲缘关系，利用mega6.0软件对其他植物(鼠耳芥ahhma2、琴叶拟南芥alhma2、拟南芥athma2/4、芥菜bjhma4、芜菁brhma2、欧洲油菜bnhma2/4、亚麻荠cashma2/4、克萊门柚cchma2、橙子cishma2、荠菜crhma2、黄瓜cshma2/4、山嵛菜属eshma2、大麦hvhma2、马蔺ilhma2、蒺藜苜蓿mthma2、天蓝遏蓝菜nchma4、短花药野生稻obhma2、水稻oshma2、胡杨pehma2、蓖麻rchma2、高粱sbhma2、马铃薯sthma2、小麦tahma2、可可树tchma3、葡萄vvhma3、玉米zmhma2)的hma基因进行系统进化树分析。结果表明，ilhma2与小麦tahma2基因、水稻oshma2基因、及大麦hvhma2基因等单子叶植物的亲缘关系较近，其而与双子叶植物，如拟南芥athma2、欧洲油菜bnhma4的亲缘关系相对较远(图2)。这预示着，马蔺ilhma2基因是重金属atp酶转运蛋白一类的表明基因。实施例4不同浓度镉处理对马蔺重金属atp酶转运蛋白基因ilhma2表达水平的影响

通过实时荧光定量rt-pcr方法对不同镉浓度(0、5、25、50、100和150mg/lcdcl2·2.5h2o)处理24h后的马蔺幼苗地上部和根中ilhma2基因表达水平进行分析。按照takaraminibestplantrnaextractionkit试剂盒说明书的方法提取总rna，利用quawell5000核酸蛋白仪测定浓度，并经1.2％的甲醛变性凝胶电泳检测其rna完整性，取1μg总rna，按照takaraprimescripttmrtreagentkitwithgdnaeraser试剂盒说明书的方法进行反转录合成cdna。利用primer5.0软件设计马蔺ilhma2基因实时荧光定量rt-pcr上游引物p7和下游引物p8，长度为273bp；马蔺内参actin基因实时荧光定量rt-pcr上游引物a1和下游引物a2，pcr产物长度为129bp。根据takarapremixextaqii试剂盒说明书的方法在steponeplus仪器上进行实时荧光定量rt-pcr反应。最后，采用2-^△△ct方法对马蔺ilhma2基因的表达数据进行的相对定量计算，所有实验均为3次生物学重复。结果表明，随着镉处理浓度的增加(0-150mg/lcdcl2·2.5h2o)其根中的ilhma2基因表达水平呈递增趋势，而地上部中的ilhma表达水平呈递减趋势，特别是根中的ilhma2基因表达水平显著高于地上部(图3)。由此表明，基因ilhma2的表达受镉胁迫的诱导和调节。

引物序列如下：

p7:5’-gggcggatgctatcgtcaaa-3’

p8:5’-cttactgctggctctggactc-3’

a1:5’-tgaggttctcttccagccatcc-3’

a2:5’-ccactgagcacaatgttgccata-3’

实施例5植物双元表达载体pcambi3301-35s-ilhma2-nos的构建

首先经bglii/bsteii对植物双元表达载体pcambia3301载体上限制性酶切位点进行双酶切，切胶回收大片段，命名为pcambia3301-h；利用primer5.0软件并结合ilhma2基因序列和pcambia3301载体序列设计带有bglii酶切位点的正向引物p9和带有bsteii酶切位点的反向引物p10，经pcr扩增、切胶回收得到ilhma2-g；再按照clontechinfusion无缝连接技术相应技术体系(1μlpcambia3301-h，3μlilhma2-g，2μl5×in-fusionhdenzymepremix，加水补至10μl，瞬时离心后置于50℃孵育15min)，即可将目的基因ilhma2插入到线性化植物双元表达载体中得到重组质粒pcambia3301-ilhma2(图4a)；最后取5μlinfusion反应液，转化到感受态大肠杆菌dh5α中，用含有50mg/lkan(卡那霉素)的lb固体培养基进行筛选，转化细菌并提取质粒，再经bglii/bsteii双酶切得到与目的基因ilhma2大小的特异条带(图4b)，其大小与pcr鉴定结果相符(图4c)，送至上海生工测序。

引物序列如下：

p9:5’-catggtagatctatggaattcttccaagtacta-3’

p10:5’-attcgagctggtcaccttattcgcttccactcccatg-3’

实施例6转基因烟草植株的分子鉴定

采用冻融法将构建好的植物双元表达载体(pcambia3301-35s-ilhma2-nos)转化到农杆菌eha105感受态中，将转化的菌液均匀涂布于yeb固体培养基上[含50mg/lkan和50mg/lrif(利福平)]，28℃避光倒置培养，2-3d后长出单菌落，用接种针挑取单菌落，接种于50mlyeb液体培养基中(含50mg/lkan和50mg/lrif)，200rpm、28℃振荡培养至od600为0.4-0.6，而后提取质粒并经pcr鉴定确认阳性克隆。然后，按照烟草叶盘侵染的相应技术方法：(1)将预先培养好的无菌烟草苗叶片切成2-3cm²大小，浸泡在含有pcambia3301-35s-ilhma2-nos的农杆菌eha105菌液中侵染10min，取出叶片用无菌滤纸吸干，平铺在垫有一层无菌滤纸的烟草共培养培养基[ms粉+30g/l蔗糖+8g/l琼脂+2mg/l6-ba(6-苄氨基腺嘌呤)+0.2mg/l萘乙酸(naa)，ph值5.8]上黑暗培养3d；(2)共培养结束后，将叶片转移到抑菌培养基[ms粉+30g/l蔗糖+8g/l琼脂+2mg/l6-ba+0.2mg/lnaa+500mg/lcef(头孢霉素)，ph值5.8]上培养7d至外植体边缘膨大；(3)将外植体转移到分化筛选培养基[ms粉+30g/l蔗糖+8g/l琼脂+2mg/l6-ba+0.2mg/lnaa+8mg/lbsata(草铵膦)+500mg/lcef，ph值5.8]上，诱导不定芽的生成；(4)当不定芽长出3-4片叶子时，切下小芽转入生根培养基[1/2ms粉+30g/l蔗糖+8g/l琼脂+0.05mg/liba(吲哚丁酸)+8mg/lbsata+250mg/lcef，ph值5.8]中诱导生根；(5)待根长伸长至3-5cm时移栽到蛭石：营养土＝1：1的花盆中，即获得t0代转基因烟草植株。

将收获的t0代转基因烟草种子先用5％次氯酸钠消毒，再放置于含有8mg/lbsata的1/2ms培养基中，待7d后将发芽的转基因烟草转至到蛭石：营养土＝1：1的花盆中，获得t1代转基因烟草植株，收获t1代转基因烟草种子；按照上述方法获得t2代转基因烟草植株。然后，按照takaraminibestuniversalgenomicdnaextractionkit试剂盒说明书提取wt和t2代转基因植株叶片的dna，利用quawell5000核酸蛋白仪测定浓度，并经电泳检测其dna完整性，用上游引物p11和下游引物p12扩增得到480bp片段的仅有12株(图5a)。随后，将上述获得的t2代转基因植株扩繁，并按照实施案例1中的方法提取它们的叶片总rna并合成cdna；通过半定量rt-pcr的方法检测转基因烟草植株的表达丰度(ilhma2基因半定量rt-pcr上游引物p11和下游引物p12；烟草内参actin基因半定量rt-pcr上游引物a2和下游引物a4，长度为564bp)。如图5b所示，各转基因烟草株系的表达丰度均有所不同，其中oe1和oe2转基因烟草株系表达丰度最高、而oe10和oe11号转基因株系的表达丰度最低。因此，随机选取oe2和oe11转基因烟草株系进行各组织中cd²⁺含量及其生理生化的分析。

引物序列如下：

p11:5’-tcgtcttctcggtggtaactaa-3’

p12:5’-aacaagatgactcgcaggattt-3’

a3:5’-tatgctagtggtcgtacaactg-3’

a4:5’-aacaaccttaatcttcatgctg-3’

实施例7镉处理对野生型与转基因烟草镉的耐受性、转运与富集能力的影响

通过温室盆栽将8周龄野生型(wt)和转基因烟草株系(oe2、oe11)在0mg/l和50mg/lcdcl2·2.5h2o处理14d，测定wt和oe2、oe11植株的地上部与根部的干重；参照guoetal(2017)的方法，利用原子吸收分光光度计(aa-6300c,shimadza,kyoto,japan)测试wt和oe2、oe11植株的地上部与根中的cd²⁺含量及其耐镉性。结果表明：

(1)正常条件下(0mg/lcdcl2·2.5h2o)，wt和oe2、oe15转基因烟草植株在形态上及其地上部和根部干重没有显著的差异；但在50mg/lcdcl2·2.5h2o胁迫14d后，野生型植株生长受到严重抑制，出现了萎蔫的症状，反之oe2、oe15转基因烟草植株正常生长(图6a)；

(2)如图6b所示，50mg/lcdcl2·2.5h2o胁迫14d后，oe2和oe11地上部的干重分别是wt的1.52倍和1.41倍，oe2和oe11根部的干重分别是wt的1.87倍和1.79倍，说明转基因烟草比野生型具有较强的耐镉性；

(3)表1为镉(50mg/lcdcl2·2.5h2o)胁迫14d后对野生型(wt)与转基因烟草株系(oe2、oe11)的cd²⁺含量、转运及其富集能力的影响。表1中每个值均代表平均值±标准差(n＝8)，不同字母分别表示野生型与转基因株系间差异显著(p<0.05)。由表1可知，50mg/lcdcl2·2.5h2o胁迫14d后，与wt相比，oe2和oe11地上部cd²⁺含量分别增加了22.84％和17.89％，而oe2和oe11根中cd²⁺含量分别降低了11.78％和6.15％；相应的oe2和oe11的转运与富集系数也显著高于wt。

表1

以上结果表明，马蔺ilhma2介导的cd²⁺长距离运输将根系cd²⁺转运至地上部，减轻了cd²⁺对根系的毒害，从而提高了植物对cd²⁺的耐受性与富集能力。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110>北京市农林科学院

<120>马蔺重金属atp酶转运蛋白ilhma2及其编码基因与应用

<130>khp171112523.3

<160>2

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>3538

<212>dna

<213>马蔺

<400>1

ttccccctgtggttccaccttccacccacatggaattcttccaagtactatacaccagca60

cccagaggagttattttgatgtccttggcatctgctgcccctctgaagtccctctcatag120

agaaaatcctgctcccattggatggtgttcacaaggttaatgttgttgtcacctcaagga180

ccgtcatcgttgtccatgacaccaacctcatcactcagcaggatatcgttaatacgttaa240

atcaagcaaggcttgaagccacggttcgagcatatggggcggatgctatcgtcaaaaaat300

ggcctaacccctacgttttggcctgtggggttttccttatattatcattgtttcataggt360

tcttccgaccgctacgatggctggccttaatggcggtctctgttggtttgtatcccatta420

tattgaggagcattgcttctgttcgtagatgcaatttggatatcaacattcttatgctga480

tagcagtggccggtgctgtcgcactgagggactactcagaagcaggattcatcgttttcc540

tctttacacttgctgaatggttggagtccagagccagcagtaaggccacagccgggatgt600

cagccctgatgagcatggctcctcaaaaagccattatagccgggacgggtcaagttgtgg660

atgcacgagaaatacaggtgaataccatccttgcagtcaaggctggagaagtcataccaa720

ttgacggagttgtgatcgagggaagaagcgaagtcaatgagcaaagcctaactggggagt780

ccttccctgttgccaagcaagctcagtcccttgtttgggctggtacccttaacatagatg840

gttatatcagtgtgaaaacaactgctttggctgaggattctgctgtggctagaatggcaa900

agctggtggaggaagcacagcacaacaggtccaagacacagagatatatagactatacat960

ccttgaactttagaggagctgtggtggtcatagcagctggtgtggctgtgattcctgtca1020

tattaaggtcccacaacaccaggttctggatgaaattggcacttgttatactggtaagcg1080

catgcccatgtgctctagtgctatccacacccgtggcaaccttctgtgcattattgacag1140

cggcaaaaacagggcttcttgtgaaaggaggagatgtccttgaaacccttgcaagaacta1200

gaatcgtggcttttgacaagactggaaccattacaaaaggggagttcacagtccatgagc1260

tctgtcctattggctgccaagtaaccctggatactcttctttactgggtttcaagtatag1320

agagtaaatcaagtcacccaatggcttctgcactcgttaaccatgctcggtcaaatttca1380

tcaagccaaaaccagagatcgtaaatgagtttgagatttatcctggcgagggagtatgtg1440

gaattatagatggaaagaagatttatattggaaacaaaagaattgcaacaagggctgggt1500

gtcagacagttccaagcatgggaagcatgaaggaaggtgttactcacggatatgtgttct1560

tagaaaaagaaccaattggaatgttcacccttaatgacacctgtcgtactggagtagcta1620

aagcaatcagagagttgaaatctttaggagtgaagagtattatgcttactggagatagca1680

ctgcagcagctatgcatgcccagagtcagctgggaaatgttctgcaagaattgcaagcag1740

agctgcttcctgatgacaaggtccgtataattaacgacctcaagaccaaggaagggccta1800

ccacgatggttggagatggaatgaatgatgcgcctgcactagctgcagcagacgttggga1860

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ccaatgacattttgaagattccaaaagccatcaggcttgcaagaagaacccgcaggtgta1980

tcatatttaacatcgtcttctcggtggtaactaaacttgccattctcgcgctatcttttg2040

caggacatcctctcatatgggctgcagtcttagccgatgtgggaacctgcttgcttgtca2100

tactcaacagcatgactttgttaagaacaagtgccccaaagaaaaatgataaatgccacc2160

gatcttgtcatgcatcggacggggaaaagcataagcatgcaaatcatcgcgacagtaaac2220

cctgttgccaaccagcacattccagggcagatgtctgtggcagtgacatccacaataggc2280

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