本发明具体涉及一种提高蛋白分泌效率的信号肽突变体及其应用，属于基因工程技术领域。
背景技术：
环糊精葡萄糖基转移酶(简称cgt酶，ec2.4.1.19)是一种能够通过分子内转糖基化反应转化淀粉及相关基质合成环糊精的胞外酶。环糊精葡萄糖基转移酶的应用范围较广，主要用于催化生产环糊精。环糊精葡萄糖基转移酶可通过环化作用将淀粉转化生成环糊精。除了催化生产环糊精，环糊精葡萄糖基转移酶还具有其他作用。随着环糊精在食品、医药、化妆品、农业等领域的应用越来越广，cgt酶已经成为当今研究的热点。
为了克服天然菌株的低cgt酶生产能力，cgt基因在大肠杆菌(escherichiacoli)中过量表达被认为是最有效途径之一，然而，以前的报道表明，cgt酶通常在e.coli中形成不溶性包涵体或积累于周质空间，限制了其工业应用，因此，实现重组cgt酶的胞外生产是迫切需要的。
与其它系统相比，大肠杆菌(escherichiacoli)表达系统具有遗传背景清楚、操作简便、可以大规模发酵培养等优点，是现阶段最常用的表达系统。e.coli通常采用i型或ii型分泌系统进行重组蛋白分泌，其中分泌到周质一般采用ii型分泌系统，包括三种方式：依赖secb的途径、信号肽识别颗粒(srp)和双精氨酸转运途径(tat)。绝大多数的分泌蛋白是通过依赖secb的途径转运出细胞内膜到达周质的，然而目前该途径常用的信号肽例如pelb，ompa，phoa等促进分泌表达的能力有限，无法达到理想的提高分泌表达效率的效果。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题是提供一种有效提高蛋白分泌表达效率的pelb信号肽突变体pelbh及其构建方法。
本发明的第一个目的是提供一种信号肽突变体pelbh，其氨基酸序列如seqidno.1所示。
在本发明的一种实施方式中，所述信号肽突变体pelbh是在如序列seqidno.3所示的核苷酸序列的基础上，将编码第3位氨基酸酪氨酸的基因突变成编码组氨酸的基因。
本发明的第二个目的是提供编码所述信号肽突变体的基因。
在本发明的一种实施方式中，所述基因的核苷酸序列如seqidno.2所示。
本发明的第三个目的是提供一种携带所述信号肽突变体的载体或细胞。
在本发明的一种实施方式中，所述载体包括pet-20b(+)或pet-28a(+)。
本发明的第四个目的是提供一种基因工程菌，是以pet-20b(+)为载体，以大肠杆菌为宿主，表达连接有seqidno.1所示信号肽的cgt酶。
在本发明的一种实施方式中，所述cgt酶的基因序列如seqidno.4所示。
在本发明的一种实施方式中，所述cgt酶的5’端克隆了seqidno.2所示核苷酸序列。
本发明的第五个目的是提供构建所述基因工程菌的方法，所述方法以pet-20b(+)为载体，以大肠杆菌为宿主，表达连接有seqidno.1所示信号肽的cgt酶。
在本发明的一种实施方式中，所述方法包括如下步骤:
(1)以pet-20b(+)载体为模板，利用基因定点突变的方式将其分别突变为pet-20b(+)-pelbh，pet-20b(+)-pelbr，pet-20b(+)-pelbk。
(2)以geobacillusstearothermophilusstr.no.2菌株的基因组为模板，采用序列如seqidno.7所示的f2primer、序列如seqidno.8所示的r2primer为引物，用pcr扩增环糊精葡萄糖基转移酶的基因，将得到的seqidno.4所示的环糊精葡萄糖基转移酶的基因序列连接到pet-20b(+)载体和步骤(1)所构建的三种载体的信号肽下游，得到重组质粒pet-20b(+)-cgt，pet-20b(+)-pelbh-cgt，pet-20b(+)-pelbr-cgt，pet-20b(+)-pelbk-cgt。
(3)将重组质粒转化宿主菌，得到分泌表达环糊精葡萄糖基转移酶的基因工程菌。
在本发明的一种实施方式中，所述大肠杆菌为e.colibl21、e.colibl21(de3)、e.colijm109、e.colidh5α、e.colitop10中的任意一种。
在本发明的一种实施方式中，所述的大肠杆菌为escherichiacolibl21(de3)。
本发明的第六个目的在于提供一种环糊精葡萄糖基转移酶的生产方法，所述方法是将所述基因工程菌接种至发酵培养基中，发酵至od600为0.6～0.8，加入iptg，诱导3～5d。
在本发明的一种实施方式中，所述诱导是培养温度为25℃-30℃，摇床转速220r/min，当菌体培养至od600为0.6-0.8时，加入0.1-0.25mmiptg后迅速转至不同温度的摇床，继续诱导90h。
本发明还提供所述信号肽突变体在制备蛋白或含蛋白的产品中的应用。
有益效果：1、本发明提供一种将pelb信号肽上第三位氨基酸酪氨酸突变成了组氨酸的信号肽，该信号肽能顺利将蛋白质跨膜转运至胞外；2、利用本发明提供的信号肽分泌表达环糊精葡萄糖基转移酶，发酵液中环糊精葡萄糖基转移酶的浓度为5.94g/l，酶活为154u/ml，相比原始信号肽分别提高了40％和19.5％，能够更高效地分泌蛋白。
附图说明
图1为构建重组pet-20b(+)-pelbh-cgt质粒图谱；
图2为环糊精葡萄糖基转移酶基因pcr琼脂糖电泳图；m，marker；泳道2-5依次为pet-20b(+)-pelb-cgt、pet-20b(+)-pelbh-cgt、pet-20b(+)-pelbr-cgt、pet-20b(+)-pelbk-cgt质粒上的环糊精葡萄糖基转移酶基因；
图3为环糊精葡萄糖基转移酶分泌表达发酵液上清蛋白电泳图；泳道1为pelb信号肽对照组，2为maker，3-5为实验组发酵液上清中环糊精葡萄糖基转移酶蛋白；
图4为发酵液中环糊精葡萄糖基转移酶的浓度及酶活；1为信号肽pelb；2为信号肽pelbr，3为信号肽pelbk，4为信号肽pelbh。
具体实施方式
歧化活力测定方法参考vanderveenba等的方法并做了部分改动。取600μl含有终浓度4mmo1.l-1的eps和20mmo1.l-1的麦芽糖溶液于50℃水浴保温10min,加入0.1ml适当稀释的酶液，反应10min，加入50μl3mo1.l-1hc1终止反应，5min后加入50μl3mo1.l-1naoh中和，然后加入100μlα-葡萄糖苷酶于60℃反应60min，加入100μl1mo1.l-1na2co3溶液将ph调节到8.0以上，在401nm处测定吸光值。一个酶活单位(u)定义为在该测定条件下每分钟转化1μmo1eps所需的酶量。
实施例1含有突变型pelb信号肽载体的构建
以pet-20b(+)载体为模板，采用序列如seqidno.5所示的f1primer、序列如seqidno.6所示的r1primer为引物，进行pcr，将pelb信号肽氨基端的三个氨基酸mky突变为mkh，得到重组质粒pet-20b(+)-pelbh，并采用序列如seqidno.11，seqidno.12所示的引物将pelb信号肽上第三位氨基酸酪氨酸突变成精氨酸，得到重组质粒pet-20b(+)-pelbr；用序列分别如seqidno.13、seqidno.14所示的引物将pelb信号肽上第三位氨基酸酪氨酸突变成赖氨酸，得到重组质粒pet-20b(+)-pelbk。突变后的pelbr和pelbk信号肽核苷酸序列分别如seqidno.9和seqidno.10所示)，然后将目的基因cgt克隆到此信号肽的3’端，目的蛋白的表达效率有所增强，环糊精葡萄糖基转移酶的表达量有效提高，达到5.94g/l，胞外酶活较原始菌株也有所提高，达到154u/l。
上游引物f1primer：5’-gaaacagaattctatgaaacatctgctgccgaccgctgctgct-3’
下游引物r1primer：5’-gcagcggtcggcagcagatgtttcatagaattctgtttcctgtg-3’
实施例2环糊精葡萄糖基转移酶基因的获取
本发明中使用的目的蛋白为环糊精葡萄糖基转移酶，通过pcr的方法获得。
1、geobacillusstearothermophilusstr.no.2(该菌株编号为atcc7953)菌株的基因组的提取，提取方法参见takara基因组提取试剂盒。
2、引物设计及pcr获得环糊精葡萄糖基转移酶基因。
引物设计根据ncbi数据库中geobacillusstearothermophiluscgtase基因序列(genbank登陆号为x59043.1)设计，分别含bamhi和xhoi位点的上下游引物(由上海生工生物工程合成)：
上游引物f2primer：5’-cgcggatccgcaatcttcatcgtgtccgacacccaaaag-3’(下划线序列为bamhi酶切位点)；
下游引物r2primer：5’-ccgctcgagttaattctgccaatccacgataattttgccggt-3’(下划线序列为xhoi酶切位点)。
使用lataqhsdna聚合酶扩增不含自身信号肽序列的cgt基因。
以提取的geobacillusstearothermophilusstr.no.2的基因组为模板，pcr条件为:95℃预变性3min；98℃变性1min；55℃退火1min；72℃延伸2min15s，反应30个循环；最后72℃延伸l0min。pcr产物用dna纯化试剂盒回收。
实施例3产环糊精葡萄糖基转移酶大肠杆菌工程菌构建及诱导表达
1：重组质粒的构建及转化。
用限制性内切酶bamhi和xhoi酶切上一步所得环糊精葡萄糖基转移酶基因pcr产物，验证用酶切体系为：pcr产物dna5μl，bamhi0.5μl，xhoi0.5μl，10×hbuffer2μl，加入双蒸水至20μl；回收用酶切体系为：质粒dna16μl，ncoi1μl，ecori1μl，10×hbuffer2μl。进行1％琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物或回收目的片段。同时将重组质粒pet-20b(+)-pelbh，pet-20b(+)-pelbr，pet-20b(+)-pelbk做同样的双酶切处理，然后胶回收酶切产物。
连接插入片段和质粒,采用连接试剂盒。将载体和插入片段按1∶1到1∶10的分子数比混合，加入等量的连接混合溶液，16℃下采用t4连接酶连接1h或过夜。然后转化escherichiacoli.bl21(de3)感受态细胞，大肠杆菌感受态制备方法参见感受态细胞制备试剂盒(takara)的说明书。
将转化的受体菌涂布到含有100μg/ml氨苄青霉素的lb固体平板上，37℃培养过夜，挑选测序正确菌株在含100μg/ml氨苄青霉素的lb培养基中培养过夜，提取质粒并采用酶切电泳和测序鉴定。序列测定由上海生工生物工程有限公司完成。最终载体pet-20b(+)-pelbh-cgt的结构如图1所示，图2为四种重组质粒上的环糊精葡萄糖基转移酶基因菌落pcr验证图。
2、重组大肠杆菌的诱导表达。
种子培养：将保藏的菌种接入装有50mllb培养基的250ml三角瓶中，回旋式摇床转速200r/min，培养温度为37℃，培养8h。发酵培养：将培养好的种子培养液按4％(v/v)的接种量接种至装有100ml发酵培养基的500ml三角瓶中进行培养，开始培养温度为30℃，摇床转速200r/min，当菌体培养至od600为0.6时，加入0.1-0.25mmiptg后迅速转至不同温度的摇床，继续诱导90h。各培养基使用前添加100μg/ml氨苄青霉素。
发酵结束后，离心取上清液进行sds-page电泳(图3)，用考马斯亮蓝法测定样品中的蛋白浓度。测得pelb信号肽介导发酵的发酵液上清中的蛋白浓度为4.97mg/ml，环糊精葡萄糖基转移酶的酶活为110u/ml(图4)。将含有融合了pelbh、pelbr、pelbk信号肽的质粒的菌株在相同条件下培养、发酵，测定发酵结束后的cgt酶歧化活力，结果如4图所示，酶活分别为154u/ml，149u/ml，135u/ml，同时发酵液上清中的蛋白浓度分别为5.94mg/ml，5.43mg/ml，5.08mg/ml，由此可见突变后的pelb信号肽在提高环糊精葡萄糖基转移酶胞外酶活的同时也提高了其胞外产量,其中突变型信号肽pelbh效果最明显，相比原本的pelb信号肽，环糊精葡萄糖基转移酶胞外酶活提升了40％，发酵液上清中的蛋白浓度提高了19.5％。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
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<110>江南大学
<120>一种提高蛋白分泌效率的信号肽突变体及其应用
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