本发明涉及多肽合成领域，特别涉及一种固液结合制备地加瑞克的方法。
技术背景
地加瑞克(degarelix)由ferringpharmaceuticals开发，于2008年12月24日在美国上市，商品名firmagon,用于治疗晚期前列腺癌；地加瑞克是一种促性腺激素释放激素(gnrh)受体抑制剂类药物，可逆性抑制垂体gnrh受体来减少促性腺激素释放继而抑制睾酮的释放，其通过抑制对前列腺癌持续生长至关重要的睾酮来延缓前列腺癌的生长和恶化；其可以避免以激素治疗前列腺癌来降低睾酮浓度的初期却造成睾酮浓度激增的弊端，由此可以避免初始刺激该激素受体可暂时性促进肿瘤生长而不是抑制它，临床研究显示，其疗效显著，临床应用前景广阔。
地加瑞克为含有七个非天然氨基酸的线性十肽，分子量为1630.75，其氨基酸序列为ac-d-2nal-d-4cpa-d-3pal-ser-4aph(l-hor)-d-4aph(cbm)-leu-lys(ipr)-pro-d-ala-nh2，其中ac为乙酰基(acetyl)，2nal为2-萘基丙氨酸(2-naphthylalanine)，4cpa为4-氯苯丙氨酸(4-chlorophenylalanine)，3pai为3-吡啶基丙氨酸(3-pyridylalanine)，4aph为4-氨基苯丙氨酸(4-aminophenylalanine)，hor为氢化乳清酸，cbm为氨基甲酰(carbamoyl)，lys(ipr)为n6-异丙基赖氨酸(n6-isopropyllysine)；其结构式如下：
国内外报道了boc和fmoc两种化学合成地加瑞克的方法，在boc方法中，专利us5925730中公开了采用boc化学固相合成方法，首先制备得到地加瑞克；其中6位4aph(cbm)采用boc-4aph(fmoc)-oh为合成原料接入肽序中，偶联后，脱掉fmoc,用叔丁基异氰酸酯与侧链氨基反应，得到酰胺被叔丁基保护4aph(cbm)，叔丁基在随后的tfa脱boc过程中一起被脱掉；其中5位4aph(hor)也是采用boc-4aph(fmoc)-oh为合成原料接入肽序中，脱掉fmoc后,与l-氢化乳清酸发生偶联反应，得到4aph(l-hor)；专利us5977302中公开了采用boc化学液相合成方法，经由“4-2-4”、“3-3-4”或“3-4-3”液相合成策略完成地加瑞克的合成；以上合成方法需要用到剧毒hf作为裂解试剂，所以大批量生产受到限制；而专利us9090656同样也采用boc化学法液相片段策略“3-4-3”制得地加瑞克，其采用了不同于专利us5925730和us5977302的侧链保护策略，有效的避免了hf的使用，但是合成过程中多次使用到钯碳脱保护基，不仅操作繁琐，成本较高，而且容易造成重金属超标等不利因素。
在地加瑞克结构中自n端起第五位为非天然氨基酸4aph(l-hor)，其结构为(l-氢化乳清酸)-4-氨基-苯丙氨酸，在碱性条件下，结构中二氢尿嘧啶会发生重排而成为乙内酰脲(koedjikov,a.h.et.al.,j.chem.soc.perkin,trans.2,1984,pages1077-1081；kaneti,j.et.al.,org.biomol.chem.,2004,pages1098-1103)，重排示意如下：
在碱性条件下，由结构式ⅰ重排为结构式ⅱ。fmoc化学固相合成策略操作简单，避免了使用剧毒hf做裂解试剂，在多肽合成中被广泛应用；但是由于fmoc化学中，不可避免的重复使用碱性条件脱氨基保护基fmoc,所以采用fmoc化学固相合成地加瑞克的试验方案设计尤为重要。为避免重排的发生，us8828938采用fmoc化学固相合成地加瑞克，并对重排进行了试验，指出在用20％哌啶/dmf脱保护处理多个循环后，均未发现重排副产物；自n端起第六位为非天然氨基酸4aph(cbm)，其采用4aph(t-bu-cbm)保护形势，用tfa裂解并脱保护时间为25h,时间太长，容易引起肽链的降解；wo2012055903用fmoc化学液相片段法合成地加瑞克，采用“3-7”或“4-6”；专利cn102329373在采用fmoc化学固相合成地加瑞克时，先引入4aph(trt)或4aph(alloc),待肽链合成完毕后，脱掉trt或alloc，然后和l-氢化乳清酸发生偶联反应；专利cn201310531473用fmoc化学固相合成地加瑞克时，选择了一条分布、正交、特异性强的保护基策略：自n端起第五位引入4aph(teoc)，第六位引入4aph(dde),待肽链合成完毕后，先用水合肼的dmf溶液脱掉dde,与三甲基硅基异氰酸酯发生偶联反应上cbm；然后再用四丁基氟化铵的dmf溶液脱去teoc，再与l-氢化乳清酸发生偶联反应；专利cn103351428用fmoc化学固相合成地加瑞克时，则先引入4aph(mmt)或4aph(dmt),待肽链合成完毕后，脱掉mmt或dmt，然后和l-氢化乳清酸发生偶联反应；专利cn103992392则自n端起第五位引入4aph(ivdde),脱掉ivdde,然后和l-氢化乳清酸发生偶联反应；上述方案中所采用4aph保护策略中所需要原料不易获得，并且后处理比较繁琐，生产成本较高。
综上所述，boc化学固相策略要用到剧毒的hf，大批量生产受到限制，液相合成，操作复杂，对操作人员要求较高，同样制约产业化放大；fmoc化学中，需要重复使用碱性条件脱氨基保护基fmoc,造成重排杂质的产生，另外fmoc化学固相合成所采用的策略均存在后处理麻烦，所用保护氨基酸原料不易得，造价昂贵的问题；为此，本发明人对地加瑞克的合成方法进行了研究，从而得到本发明的技术方案。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种地加瑞克的合成方法。本发明采用固液结合的策略，采用普通的侧链保护基，降低了合成成本，提高了粗肽纯度，从而降低了纯化难度，提高了收率，降低了生产成本，有利于规模化工业生产。
为实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
一种固液结合制备地加瑞克的方法，包括如下步骤：
(a)液相条件下制备得到片段肽ⅰ:ac-d-2nal-d-4cpa-d-3pal-ser(tbu)-4aph(fmoc)-oh；
(b)以氨基树脂为固相载体，制备得到片段肽树脂ⅱ：h-d-4aph(cbm)-leu-lys(boc,ipr)-pro-d-ala-nh-resins；
(c)片段肽ⅰ和片段肽树脂ⅱ发生偶联，得到肽树脂ⅲ：ac-d-2nal-d-4cpa-d-3pal-ser(tbu)-4aph(fmoc)-d-4aph(cbm)-leu-lys(boc,ipr)-pro-d-ala–nh-resins；
(d)肽树脂ⅲ经脱保护试剂处理后脱掉侧链保护基fmoc，然后和l-氢化乳清酸发生偶联反应，得到肽树脂iv：
ac-d-2nal-d-4cpa-d-3pal-ser(tbu)-4aph(l-hor)-d-4aph(cbm)-leu-lys(boc,ipr)-pro-d-ala-nh-resins；
(e)肽树脂iv经裂解、纯化、冻干得到地加瑞克精肽。
其中以上技术方案步骤(a)中片段肽ⅰ的合成方法为：
将h-4aph(fmoc)-oh与碱a按照摩尔比1:1～2的比例溶解在水中，加入5～20％体积的有机溶剂b助溶,待完全溶解后，搅拌下滴加入0.9～1.0倍摩尔量(以h-4aph(fmoc)-oh的量计)ac-d-2nal-d-4cpa-d-3pal-ser(tbu)-osu的有机溶剂b溶液；tlc监测反应终点，待反应结束减压蒸发去掉有机溶剂后，再加入10％柠檬酸水溶液调溶液ph值至2～3，乙酸乙酯萃取，析晶得ac-d-2nal-d-4cpa-d-3pal-ser(tbu)-4aph(fmoc)-oh。
上述ac-d-2nal-d-4cpa-d-3pal-ser(tbu)-osu的合成方法为：
取ac-d-2nal-d-4cpa-d-3pal-ser(tbu)-oh与hosu按摩尔比为1:1.0～1.2的比例溶解在thf中，冰浴下滴加入1.0～1.2倍量(以ac-d-2nal-d-4cpa-d-3pal-ser(tbu)-oh的量计)的dcc的thf溶液，反应3-4h,滤除不溶物，滤液浓缩后加入石油醚，析出固体，得到ac-d-2nal-d-4cpa-d-3pal-ser(tbu)-osu。
其中ac-d-2nal-d-4cpa-d-3pal-ser(tbu)-oh的合成方法：
方法一：以ac-d-2nal-oh和h-d-4cpa-oh为原料，液相条件下偶联制备得到ac-d-2nal-d-4cpa-oh；然后再和h-d-3pal-oh液相条件下偶联制备得到ac-d-2nal-d-4cpa-d-3pal-oh；随后再和h-ser(tbu)-oh液相条件下偶联制备得到ac-d-2nal-d-4cpa-d-3pal-ser(tbu)-oh。
方法二：以ctc树脂为固相载体，依次与fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-d-3pal-oh、fmoc-d-4cpa-oh和ac-d-2nal-oh偶联反应，得到ac-d-2nal-d-4cpa-d-3pal-ser(tbu)-ctcresins；然后经tfe裂解、析晶得到ac-d-2nal-d-4cpa-d-3pal-ser(tbu)-oh。
以上步骤中碱a为碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸氢钾、碳酸钾、三乙胺、二乙胺、n-乙基二异丙基胺、n,n-二异丙基乙胺等中的一种；
有机溶剂b为四氢呋喃、二氧六环、n,n-二甲基甲酰胺、丙酮、n-甲基-2-吡咯烷酮、乙腈中的一种或几种。
其中以上技术方案步骤(b)中片段肽树脂ⅱ的合成方法为：
以氨基树脂为固相载体，以2-5倍的投料比(以合成规模的物质量计)，加入相应的fmoc保护氨基酸进行偶联反应，每一个偶联反应均是在缩合剂的存在下进行的固相接肽反应，反应完毕后用脱保护试剂脱除fmoc，再与下一个fmoc保护氨基酸进行偶联反应；依次分别与fmoc-d-ala-oh、fmoc-pro-oh、fmoc-lys(boc,ipr)-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-d-4aph(cbm)-oh偶联反应，制备得到h-d-4aph(cbm)-leu-lys(boc,ipr)-pro-d-ala-nh-resins；步骤(b)中的氨基树脂为rinkamideresins、rinkamide-amresins、rinkamide-mbharesins、siemberesins中的一种。
其中以上技术方案步骤(c)中肽树脂ⅲ的合成方法为：
取2.0～4.0倍量(以固相合成规模计)片段肽ⅰ溶解于dmf中，待完全溶解后，放入冰水浴冷却5-20min，加入相同倍量的缩合剂，混合均匀后放入冰水浴中冷却3-5min，然后将活化后溶液加入装有片段肽树脂ⅱ的多肽合成柱，鼓氮偶联反应2-3h。
其中以上技术方案步骤(d)中肽树脂iv的合成方法为：
将肽树脂ⅲ经脱保护试剂脱保护后，dmf洗涤6次后，加入活化后的2.0～4.0倍量(以固相合成规模计)l-氢化乳清酸/缩合剂溶液，鼓氮气反应2-3h。
其中以上技术方案缩合剂为dic/hobt、dic/hoat、tbtu/hobt/dipea、hbtu/hobt/dipea、hatu/hoat/dipea的一种；脱保护试剂为15～25％(体积含量)哌啶/dmf溶液。
其中以上技术方案步骤(e)中裂解试剂为加入体积比1-5％清除剂的tfa溶液，上述清除剂为苯甲醚、苯甲硫醚、乙二硫醇、巯基乙醇、苯酚、水和三异丙基硅烷中的一种或几种。
相对于现有技术，本发明的有益效果是：本发明首次合成ac-d-2nal-d-4cpa-d-3pal-ser(tbu)-4aph(fmoc)-oh用于地加瑞克的固相合成，避免固相逐步合成过程中，重复使用碱性条件脱fmoc带来的4aph(l-hor)重排副反应的难题；本工艺合成过程简单，所用原料便宜易得，易于放大生产；本发明避免使用剧毒试剂hf，采用tfa组合裂解后，经纯化、冻干得到纯度99.5％的精肽，且总收率达到65％。
具体实施方式
下面用具体实施例对本发明进行详细说明，但不限定本专利；根据本发明改变原料的投料比、或是反应溶剂或及缩合剂等，均在本发明的保护范围内。
说明书和权利要求书中所使用的缩写含义如下：
fmoc9-芴甲氧羰基
ctc树脂2-氯三苯甲基氯树脂
tbu叔丁基
2nal2-萘基丙氨酸
trt三苯甲基
4cpa4-氯苯丙氨酸
boc叔丁氧羰基
3pal3-吡啶基丙氨酸
4aph4-氨基苯丙氨酸
hor氢化乳清酸
cbm氨基甲酰
lys(ipr)n6-异丙基赖氨酸
nmpn-甲基-2-吡咯烷酮
dcm二氯甲烷
dmfn,n-二甲基甲酰胺
dmap4-二甲氨基吡啶
dipean,n-二异丙基乙胺
dicn,n-二异丙基碳二亚胺
hbtu苯并三氮唑-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸盐
hatu2-(7-偶氮苯并三氮唑)-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸酯
tbtuo-苯并三氮唑-n,n,n',n'-四甲基脲四氟硼酸
hobt1-羟基苯并三唑
hoat1-羟基-7-偶氮苯并三氮唑
tfa三氟乙酸
tis三异丙基硅烷
实施例1：ac-d-2nal-d-4cpa-d-3pal-ser(tbu)-4aph(fmoc)-oh的合成
准确称取h-d-4cpa-oh199.6g(1.0mol)和碳酸钠127.2g(1.2mol)溶于2400ml水中，低温下(2-8℃)缓慢加入ac-d-2nal-osu的四氢呋喃溶液(298.3g，1.0mol)/2000ml，搅拌反应，tlc监测反应终点，反应完全后，旋蒸掉thf，冰水浴下加入稀盐酸调溶液ph值至2～3，2000ml乙酸乙酯萃取3次,合并有机相，400ml饱和食盐水洗3次，无水硫酸钠干燥，旋蒸浓缩至2000ml，静置析晶，得ac-d-2nal-d-4cpa-oh390.3g，收率82.1％。
准确称取h-d-3pal-oh136.3g(0.82mol)和碳酸钠106.0g(1.0mol)溶于2400ml水中，低温下(2-8℃)缓慢加入ac-d-2nal-d-4cpa-osu的四氢呋喃溶液(390.3g，0.82mol)/2000ml，搅拌反应，tlc监测反应终点，反应完全后，旋蒸掉thf，冰水浴下加入稀盐酸调溶液ph值至2～3，2000ml乙酸乙酯萃取3次,合并有机相，400ml饱和食盐水洗3次，无水硫酸钠干燥，旋蒸浓缩至2000ml，静置析晶，得ac-d-2nal-d-4cpa-d-3pal-oh417.3g，收率81.6％。
准确称取h-ser(tbu)-oh118.8g(0.74mol)和碳酸钠94.3g(0.89mol)溶于2000ml水中，低温下(2-8℃)缓慢加入ac-d-2nal-d-4cpa-d-3pal-osu的四氢呋喃溶液(417.3g，0.67mol)/2000ml，搅拌反应，tlc监测反应终点，反应完全后，旋蒸掉thf，冰水浴下加入10％柠檬酸调溶液ph值至2～3，2000ml乙酸乙酯萃取3次,合并有机相，300ml饱和食盐水洗3次，无水硫酸钠干燥，旋蒸浓缩至2000ml，静置析晶，得ac-d-2nal-d-4cpa-d-3pal-ser(tbu)-oh462.9g，收率90.1％。
准确称取h-4aph(fmoc)-oh265.6g(0.66mol)和碳酸钠84.8g(0.80mol)溶于2000ml水中，低温下(2-8℃)缓慢加入ac-d-2nal-d-4cpa-d-3pal-ser(tbu)-osu的四氢呋喃溶液(462.9g，0.60mol)/2000ml，搅拌反应，tlc监测反应终点，反应完全后，旋蒸掉thf，冰水浴下加入10％柠檬酸调溶液ph值至2～3，2000ml乙酸乙酯萃取3次,合并有机相，300ml饱和食盐水洗3次，无水硫酸钠干燥，旋蒸浓缩至2000ml，静置析晶，得ac-d-2nal-d-4cpa-d-3pal-ser(tbu)-4aph(fmoc)-oh619.8g，收率89.2％。
实施例2：ac-d-2nal-d-4cpa-d-3pal-ser(tbu)-4aph(fmoc)-oh的合成
称取ctc树脂500.0g(sub＝1.0mmol/g)置于合成柱中，用4000mldmf洗涤两次,加入4000mldcm溶胀30min；抽滤掉dcm后，加入溶有383.5g(100mmol)fmoc-ser(tbu)-oh的dcm/dmf(3/1,体积比)溶液1500ml，搅拌后加入dipea330ml(2000mmol)，鼓n2反应60min，抽掉反应液，加入dcm/ch3oh/dipea(体积比17：2：1)混合溶液3000ml封端3次，每次10min；然后用dmf洗涤6次，取小样测替代度为0.75mmol/g，合成规模0.5mol。
合成柱内树脂经3000ml20％哌啶/dmf溶液脱保护两次后，用dmf洗涤6次；然后加入活化后的fmoc-d-3pal-oh/hobt/dic溶液，室温下反应3h，滤掉反应液后，用dmf洗涤6次；然后再循环上述操作，分别与fmoc-d-4cpa-oh和ac-d-2nal-oh偶联反应，得到ac-d-2nal-d-4cpa-d-3pal-ser(tbu)-ctcresins洗涤干燥后853.6g；
将肽树脂加入900ml裂解试剂tfe/acoh/dcm(1/1/3)中反应3h,然后浓缩后加入石油醚中析晶得到ac-d-2nal-d-4cpa-d-3pal-ser(tbu)-oh固体381.2g,收率99.4％。
准确称取h-4aph(fmoc)-oh241.4g(0.60mol)和碳酸钠84.8g(0.80mol)溶于2000ml水中，低温下(2-8℃)缓慢加入ac-d-2nal-d-4cpa-d-3pal-ser(tbu)-osu的四氢呋喃溶液(381.2g，0.50mol)/2000ml，搅拌反应，tlc监测反应终点，反应完全后，旋蒸掉thf，冰水浴下加入10％柠檬酸调溶液ph值至2～3，2000ml乙酸乙酯萃取3次,合并有机相，300ml饱和食盐水洗3次，无水硫酸钠干燥，旋蒸浓缩至2000ml，静置析晶，得ac-d-2nal-d-4cpa-d-3pal-ser(tbu)-4aph(fmoc)-oh519.2g，收率90.2％。
实施例3：h-d-4aph(cbm)-leu-lys(boc,ipr)-pro-d-ala-nh-resins的制备
准确称取rinkamideam树脂(初始替代度0.91mmol/g)220g置于肽树脂合成反应器中，加入1.0ldcm溶胀2h。溶胀结束，以dmf洗涤3次，每次1.0l，然后加入2.0l20％哌啶/dmf溶液脱保护两次，分别进行10min和10min。脱保护完成，树脂以dmf洗涤6次，每次2.0l。称取fmoc-d-ala-oh124.4g(0.40mol)、hobt59.4g(0.44mol)用0.8ldmf溶解后，加入68ml(0.44mol)dic活化，将溶液加入到反应器中，反应2h，kaisertest监测反应进程。反应结束，树脂以dmf洗涤6次。然后重复上述操作，依次与fmoc-pro-oh、fmoc-lys(boc,ipr)-oh、fmoc-leu-oh偶联反应，制备得到h-leu-lys(boc,ipr)-pro-d-ala-nh-resins；然后再与fmoc-d-4aph(cbm)-osu发生偶联，制备得到h-d-4aph(cbm)-leu-lys(boc,ipr)-pro-d-ala-nh-resins。
实施例4：h-d-4aph(cbm)-leu-lys(boc,ipr)-pro-d-ala-nh-resins的制备
准确称取rinkamide树脂(初始替代度0.91mmol/g)110g置于肽树脂合成反应器中，加入0.5ldcm溶胀2h。溶胀结束，以dmf洗涤3次，每次0.5l，然后加入1.0l20％哌啶/dmf溶液脱保护两次，分别进行10min和10min。脱保护完成，树脂以dmf洗涤6次，每次2.0l。称取fmoc-d-ala-oh62.2g(0.20mol)、hobt29.7g(0.22mol)用0.8ldmf溶解后，加入34ml(0.22mol)dic活化，将溶液加入到反应器中，反应2h，kaisertest监测反应进程。反应结束，树脂以dmf洗涤6次。然后重复上述操作，依次与fmoc-pro-oh、fmoc-lys(boc,ipr)-oh、fmoc-leu-oh偶联反应，制备得到h-leu-lys(boc,ipr)-pro-d-ala-nh-resins；然后再与fmoc-d-4aph(cbm)-osu发生偶联，制备得到h-d-4aph(cbm)-leu-lys(boc,ipr)-pro-d-ala-nh-resins。
实施例5：ac-d-2nal-d-4cpa-d-3pal-ser(tbu)-4aph(fmoc)-d-4aph(cbm)-leu-lys(boc,ipr)-pro-d-ala–nh–resins的合成
准确称取实施例1所得ac-d-2nal-d-4cpa-d-3pal-ser(tbu)-4aph(fmoc)-oh460.5g(0.40mol)、hobt59.4g(0.44mol)用1.2ldmf溶解后，放入冰水浴中冷却20min，加入68ml(0.44mol)dic混合均匀，再放入冰水浴中冷却5min，将活化后溶液加入到实施例3树脂反应器中，kaisertest监测反应进程，反应3h。反应液抽入5l10％柠檬酸水溶液中回收ac-d-2nal-d-4cpa-d-3pal-ser(tbu)-4aph(fmoc)-oh210.2g.
实施例6：ac-d-2nal-d-4cpa-d-3pal-ser(tbu)-4aph(fmoc)-d-4aph(cbm)-leu-lys(boc,ipr)-pro-d-ala–nh–resins的合成
准确称取实施例2所得ac-d-2nal-d-4cpa-d-3pal-ser(tbu)-4aph(fmoc)-oh230.3g(0.20mol)、hobt29.7g(0.22mol)用0.6ldmf溶解后，放入冰水浴中冷却20min，加入34ml(0.22mol)dic混合均匀，再放入冰水浴中冷却5min，将活化后溶液加入到实施例4树脂反应器中，kaisertest监测反应进程，反应3h。反应液抽入2.5l10％柠檬酸水溶液中回收ac-d-2nal-d-4cpa-d-3pal-ser(tbu)-4aph(fmoc)-oh105.2g.
实施例7：ac-d-2nal-d-4cpa-d-3pal-ser(tbu)-4aph(l-hor)-d-4aph(cbm)-leu-lys(boc,ipr)-pro-d-ala-nh-resins的合成
将实施例5所得肽树脂中加入2.0l20％哌啶/dmf溶液脱保护两次，分别进行10min和10min。脱保护完成，树脂以dmf洗涤6次，每次2.0l。准确称取l-氢化乳清酸161.0g(0.40mol)、hobt59.4g(0.44mol)用1.2ldmf溶解后，放入冰水浴中冷却20min，加入68ml(0.44mol)dic混合均匀，再放入冰水浴中冷却5min，将活化后溶液加入到反应器中，kaisertest监测反应进程，反应3h。反应结束后，滤掉反应液，树脂以dmf洗涤6次，每次2.0l，然后2.0ldcm洗涤3次，2.0l甲醇洗涤三次。抽干，真空干燥得肽树脂572.6g。
实施例8：ac-d-2nal-d-4cpa-d-3pal-ser(tbu)-4aph(l-hor)-d-4aph(cbm)-leu-lys(boc,ipr)-pro-d-ala-nh-resins的合成
将实施例6所得肽树脂中加入1.0l20％哌啶/dmf溶液脱保护两次，分别进行10min和10min。脱保护完成，树脂以dmf洗涤6次，每次1.0l。准确称取l-氢化乳清酸80.5g(0.20mol)、hobt29.7g(0.22mol)用0.6ldmf溶解后，放入冰水浴中冷却20min，加入34ml(0.22mol)dic混合均匀，再放入冰水浴中冷却5min，将活化后溶液加入到反应器中，kaisertest监测反应进程，反应3h。反应结束后，滤掉反应液，树脂以dmf洗涤6次，每次1.0l，然后1.0ldcm洗涤3次，1.0l甲醇洗涤三次。抽干，真空干燥得肽树脂286.9g。
实施例9：地加瑞克粗品的制备
取实施例7所得肽树脂572.6g缓慢加入冰浴下裂解试剂tfa/h2o/tis(95/3/2，v/v)3.5l中，低温反应30min后，室温下反应3h,滤除树脂后，将裂解液倒入40l冷冻的甲叔醚中，析出固体，离心分离、洗涤、干燥得粗品355.8g，纯度92.6％。
实施例10：地加瑞克粗品的制备
取实施例8所得肽树脂286.9g缓慢加入冰浴下裂解试剂tfa/苯酚/苯甲硫醚/h2o/tis(82.5/5/5/5/2.5，v/v)1.8l中，低温反应30min后，室温下反应3h,滤除树脂后，将裂解液倒入20l冷冻的甲叔醚中，析出固体，离心分离、洗涤、干燥得粗品176.2g，纯度91.5％。
实施例11：地加瑞克粗品的精制
取实施例9所得粗品，用纯化流动相a溶解，溶液经0.45um微孔滤膜过滤，待用。
经液相制备色谱纯化，填料为粒径为10um的c18，流动相为体系为0.1％tfa/水-0.1％tfa/乙腈，内径为150mm,每次上样40g,截留中控纯度为99.5％的组分合并，峰前和蜂后不符合中控标准的组分分别循环进样。
将中控合格组分减压浓缩除掉大部分乙腈，然后经液相色谱柱转盐，截留中控纯度为99.5％的合格组分，浓缩、冻干得精肽212.8g，总收率65.2％。
实施例12：地加瑞克粗品的精制
取实施例10所得粗品，用纯化流动相a溶解，溶液经0.45um微孔滤膜过滤，待用。
经液相制备色谱纯化，填料为粒径为10um的c18，流动相为体系为0.1％tfa/水-0.1％tfa/乙腈，内径为150mm,每次上样40g,截留中控纯度为99.5％的组分合并，峰前和蜂后不符合中控标准的组分分别循环进样。
将中控合格组分减压浓缩除掉大部分乙腈，然后经液相色谱柱转盐，截留中控纯度为99.5％的合格组分，浓缩、冻干得精肽106.0g，总收率65.0％。