本发明属于生物医药领域，涉及抑制人类冠状病毒感染的多肽，具体涉及能广谱地抑制人类冠状病毒感染的多肽及其应用。
技术背景
资料显示，2002年于中国广州首次发现一种新型病原体，其造成人的严重急性呼吸道综合征(severeacuterespiratorysyndrome,sars)，又被称为传染性非典型肺炎，该病原体称之为严重急性呼吸道综合征冠状病毒(severeacuterespiratorysyndromecoronavirus,sars-cov)。截至2003年7月，该疾患已波及全世界29个国家和地区，累计确诊病例数超过8000人，平均死亡率超过10％。在2012年，又一种新型冠状病毒在中东地区的爆发，即中东呼吸道冠状病毒(middleeastrespiratorysyndromecoronavirus,mers-cov)，据世界卫生组织(who)报道，截至2016年1月20日，确诊的病例已达1626例，并且死亡率高达36％。目前，可感染人类的冠状病毒还包括人冠状病毒229e(hcov-229e)、人冠状病毒nl63(hcov-nl63)，人冠状病毒oc43(hcov-oc43)、香港ⅰ型人冠状病毒(hcov-hku1)。人类冠状病毒的存在为人类的生存与健康带来了严重的威胁，给全球的经济发展带来了严重的影响。另外，现已发现一些类sars病毒，包括rsshc014-cov或rsw1v1-cov，与sars-cov的基因序列高度相似。有关研究表明，rsshc014-cov同样具有感染人类的潜力，并且sars-cov的特异性针对抗体药物对其并没有抑制作用(参考文献：menachery,v.d.,b.l.yount,jr.,k.debbink,s.agnihothram,l.e.gralinski,j.a.plante,r.l.graham,t.scobey,x.y.ge,e.f.donaldson,s.h.randell,a.lanzavecchia,w.a.marasco,z.l.shi,andr.s.baric.2015.asars-likeclusterofcirculatingbatcoronavirusesshowspotentialforhumanemergence.natmed21:1508-1513.)；因而，这类病毒的存在，同样为人类的生存与健康带来严重的隐患。
研究表明，人冠状病毒病毒在侵染靶细胞的过程中，其包膜糖蛋白(s蛋白)发挥着关键作用；s蛋白可分为s1亚单位和s2亚单位，s1亚单位负责与其靶细胞表面受体的结合，然后导致一系列分子事件后，s2蛋白n端的融合肽被暴露，使其能够插入靶细胞膜中；之后s2蛋白发生一系列构象改变，其n-端七肽重复域(hr1或nhr)形成三聚体，并与其c-端七肽重复域(hr2或chr)相互作用，形成“融合核心结构”---“六螺旋束”(6hb)，使得病毒膜和靶细胞膜被拉近从而发生膜融合，病毒的基因物质通过融合孔进入靶细胞内复制产生新的病毒颗粒。
目前，有关该类病毒的抑制剂的研发中，s蛋白的s1区域和s2区域是两个重要的靶点，其中，针对于s1区域的进入抑制剂以抗体为主，虽然这类抗体对特定的病毒有很好的中和活性，但对其它的人冠状病毒并没有交叉保护效果；有研究表明，虽然sars-cov与其类似病毒rsshc014-cov的基因同源性较高，并且受体相同，但sars-cov的特异性抗体仍然缺乏对rsshc014-cov的中和活性(参考文献：menachery,v.d.,b.l.yount,jr.,k.debbink,s.agnihothram,l.e.gralinski,j.a.plante,r.l.graham,t.scobey,x.y.ge,e.f.donaldson,s.h.randell,a.lanzavecchia,w.a.marasco,z.l.shi,andr.s.baric.2015.asars-likeclusterofcirculatingbatcoronavirusesshowspotentialforhumanemergence.natmed21:1508-1513.)；靶向于s2区域的进入抑制剂以多肽类药物为主，这类进入抑制剂多来源于病毒s2蛋七肽重复区域2(hr2)氨基酸序列；hr2多肽能够与病毒的七肽重复区域1(hr1)三聚体结合，形成稳定的异源6hb，阻止了病毒的hr2与病毒的hr1三聚体结合，使它们不能形成同源6hb，从而抑制了病毒膜和靶细胞膜的融合，也就抑制了病毒的基因进入靶细胞膜进行复制(如图1所示)；目前，具有相同作用机制的多肽类进入抑制剂在艾滋病病毒(hiv)的治疗方面已起到重要的作用，例如，恩夫韦肽(enfuvirtide，fuzeon，又称t20)是美国fda批准的国际上第一个多肽类hiv进入抑制剂，其目前被用于艾滋病的临床治疗，对那些已产生hiv逆转录酶抑制剂抗药性的患者有很好的疗效；本申请的发明人之一―姜世勃是t20药物原型多肽(多肽637-666)的发明人(美国专利号：5,444,044)。
本申请的前期研究发现，在人类冠状病毒的s2区域中，七肽重复域(hr)的氨基酸序列的相似度较高，并且其通过形成六螺旋介导融合的机制非常类似，这为研发广谱的人类冠状病毒多肽类抑制剂提供了重要的理论基础；但目前多肽类进入抑制剂的设计方案中，仅仅基于病毒自身的的hr2的氨基酸序列或六螺旋结构而设计，尚缺乏广谱性的设计理念，因而目前所报道的人冠状病毒多肽类抑制剂往往缺乏广谱的抗病毒效果(参考文献：lu,l.,q.liu,y.zhu,k.h.chan,l.qin,y.li,q.wang,j.f.chan,l.du,f.yu,c.ma,s.ye,k.y.yuen,r.zhang,ands.jiang.2014.structure-baseddiscoveryofmiddleeastrespiratorysyndromecoronavirusfusioninhibitor.natcommun5:3067.和gao,j.,g.lu,j.qi,y.li,y.wu,y.deng,h.geng,h.li,q.wang,h.xiao,w.tan,j.yan,andg.f.gao.2013.structureofthefusioncoreandinhibitionoffusionbyaheptadrepeatpeptidederivedfromthesproteinofmiddleeastrespiratorysyndromecoronavirus.jvirol87:13134-13140.)。
基于现有技术的现状，本申请的发明人拟通过基于病毒的hr区域较为保守的现象，根据多种人冠状病毒hr2的序列特点和六螺旋的结构特点，并采用对多种生物化学手段对多肽的活性进行预测评估，提供可对2种以上人类冠状病毒的感染具有广谱的抑制作用的多肽，本申请将对人冠状病毒防控和治疗方面具有重大的意义，可为目前仍在流行的人类冠状病毒以及未来有可能爆发的新型人类冠状病毒提供有效的预防和治疗的药物候选。
技术实现要素：
本发明的目的是克服现有技术的存在的缺陷，提供能广谱地抑制人类冠状病毒感染的多肽。
本申请基于病毒的hr区域较为保守的现象，根据多种人冠状病毒hr2的序列特点和六螺旋的结构特点，提供了可对人类冠状病毒感染具有广谱抑制功能的多肽类进入抑制剂。所述的广谱多肽类进入抑制剂可以与2种以上的人类冠状病毒(包括目前正在流行的mers-cov)s2蛋白中的hr1区域结合，干扰病毒自身六螺旋的形成过程，从而抑制病毒的融合感染过程。
本发明所述的多肽其序列如表1所示(或详见于多肽序列表中)，或由其中的氨基酸序列经过修饰例如经过取代、缺失或添加一或多个氨基酸的氨基酸序列组成，这些多肽的共有特征为通过抑制由人类冠状病毒表面的ⅰ型跨膜糖蛋白--s蛋白所介导的融合过程发挥对病毒感染的抑制活性。
表1、
本发明所述的多肽其具有多肽抗病毒活性的“广谱性”；实践显示，对于人冠状病毒的防控不能仅针对单一病毒种类，而要寻找其“共性”而进行防治，这样才可以更好地防控目前流行的以及未来新型的人类冠状病的爆发；本发明中采用多种生物化学手段对所述的多肽的活性进行预测评估，证实所述的多肽可对2种以上人类冠状病毒的感染具有广谱的抑制作用；尤其是对严重急性呼吸道综合征冠状病毒(severeacuterespiratorysyndromecoronavirus,sars-cov)、类sars冠状病毒(rsshc014-cov或rsw1v1-cov)、中东呼吸道冠状病毒(middleeastrespiratorysyndromecoronavirus,mers-cov)和人冠状病毒229e(hcov-229e)中2种以上人类冠状病毒的感染具有广谱的抑制作用，本发明将对人冠状病毒防控和治疗面具有重大的意义，可为目前仍在流行的人类冠状病毒以及未来有可能爆发的新型人类冠状病毒提供有效的预防和治疗的药物候选。
本发明中，通过建立分别由mers-cov和sars-covs蛋白介导的细胞-细胞融合系统进行检测所述系列多肽对相应病毒融合过程的抑制活性(如图2所示)，本发明的一个实施例中采用mers-cov的细胞-细胞融合系统(2014年lul.(陆路，本专利的发明人之一)等人通过将病毒的s蛋白与gfp共表达的方法构建了mers-cov的细胞-细胞融合系统，并在此系统上，成功地设计并评估了一系列活性较好的mers-cov多肽类进入抑制剂，该成果发表在nature子刊naturecommunications上)，以及采用相同的方法分别检测了本申请所述的多肽对mers-cov和sars-cov的融合抑制效果，并以目前活性最好的mers-cov多肽类进入抑制剂hr2p-m2作为对照(参考文献：lu,l.,q.liu,y.zhu,k.h.chan,l.qin,y.li,q.wang,j.f.chan,l.du,f.yu,c.ma,s.ye,k.y.yuen,r.zhang,ands.jiang.2014.structure-baseddiscoveryofmiddleeastrespiratorysyndromecoronavirusfusioninhibitor.natcommun5:3067.)，结果显示，在mers-cov的细胞-细胞融合实验中，hcov-ek系列多肽和hr2p-m2多肽均显示有较好的抑制效果，并且hcov-ek系列多肽抑制活性明显优于hr2p-m2多肽(如图2a所示)所示；同样，hcov-ek系列多肽对sars-covs蛋白介导的细胞-细胞融同样具有较好的抑制活性，而多肽hr2p-m2在5μm时没有明显的抑制效果(如图2b所示)。
本发明中，进一步实验验证所述hcov-ek系列多肽对人冠状病毒的抑制的广谱性，分别建立hcov-229e和类sars病毒(rsshc014-cov或rsw1v1-cov)的细胞-细胞融合系统，并以hcov-ek1多肽为代表检测所述系列多肽的广谱性；结果显示，hcov-ek1在10μm时，可对mers-cov，sars-cov，hcov-229e，以及类sars病毒(rsshc014-cov或rsw1v1-cov)s蛋白介导的细胞-细胞融合的融合过程达到100％的抑制效果(如图3a所示)；在图3b中具体的显示了hcov-ek1多肽在上述多种病毒的细胞-细胞融合实验中的抑制活性，其半数抑制浓度(ic50)均在1μm以下，从而进一步显示所述的系列多肽对人冠状病毒高效广谱的抑制效果；表2中，进一步系统地展现了hcov-ek系列多肽在不同融合模型上的ic50。
表2、hcov-ek系列多肽对多种人冠状病毒的s蛋白所介导的细胞-细胞融合的抑制活性:
本发明中，以目前仍处于流行状态的mers-cov病毒为代表，检测hcov-ek系列多肽对其假病毒的抑制效果，结果显示，hcov-ek系列多肽对mers-cov假病毒具有较好的抑制效果，甚至比多肽hr2p-m2的抗病毒活性有6-10倍的提高(如图4所示)，该结果与上述的mers-cov细胞-细胞融合实验结果较为一致。
本发明中，在所述hcov-ek系列多肽显示出高效广谱的抗人冠状病毒的活性同时，优选的，以hcov-ek1多肽为代表的系列多肽的具体的抗病毒机制得到了明确的展示；如图5a所示的nativepage实验中，hcov-ek1多肽可以与衍生于多种人冠状病毒hr1的多肽(包括sars-cov-hr1p,mers-cov-hr1p,hcov-229e-hr1p)混合后，均产生了一条新的条带，该条带即为疑似六螺旋条带(由于sars-cov-hr1p与rsshc014-cov-hr1p或rsw1v1-cov-hr1p的氨基酸序列完全相同，这里就没有再做重复)；另外，实验结果还表明：hcov-ek1多肽与多肽hcov-nl63-hr1p或多肽hcov-oc43-hr1p混合后，可以出现同样的现象，表明hcov-ek系列多肽还具有抑制hcov-nl63和hcov-oc43的活性；而在多肽的二级结构检测中显示，当hcov-ek1多肽与sars-cov-hr1p,mers-cov-hr1p或hcov-229e-hr1p混合后，出现高度的螺旋结构，该结果符合六螺旋核心结构的cd光谱，而其tm值表示其稳定程度(如图5b所示)；由此可见，hcov-ek系列多肽的抗病毒机制主要是通过与病毒的hr1区域结合，干扰病毒自身6hb的形成，从而抑制病毒的融合进入过程。
本发明的上述实验结果表明，所述的hcov-ek系列多肽有非常广谱并高效的抗病毒活性，可对2种以上的人冠状病毒有很好的抑制效果。这将为人类冠状病毒的防控提供一种新的策略，同时也为加快广谱抗人冠状病毒的多肽小分子药物的研发提供了新的理论依据；进一步的，hcov-ek系列多肽清晰的抗病毒机制，为其应用的安全性和优化途径的明确性提供了保证。
本发明的另外一个目的是提供对人类冠状病毒感染感染具有广谱地抑制功能的重组蛋白，该蛋白的核心区域是本申请中所涉及的具有抑制多种人类冠状病毒感染能力的多肽序列。
本发明还涉及了一组核酸分子，其编码本发明所述分离的肽，包括密码子优化衍生物。
本发明还涉及了一组表达载体，其包含本发明所述分离的核酸分子。
本发明还涉及了一组分离的重组细胞，其包含本发明所述的表达载体。
本发明还涉及所述的分离的肽、分离的核酸分子、表达载体或重组细胞作为药物的应用。
本发明涉及一组药物组合物，其包含本发明的多肽、核酸分子、表达载体和/或重组细胞以及任选存在的药物可接受的载体或赋形剂。
本发明还涉及了本发明所述的多肽、核酸分子、表达载体或重组细胞在用于制备抑制多种人类冠状病毒感染药物组合物中的应用。
本发明还涉及了一种抑制或预防多种人类冠状病毒感染感染的方法，包括给予被多种人类冠状病毒感染感染或有被多种人类冠状病毒感染感染风险的对象施用本发明所述的多肽、核酸分子、表达载体、重组细胞或药物组合物。
本发明经试验显示，成功地获得人类冠状病毒的“共性”，即相似的hr区域和其介导的相同融合机制，并以此为切入点提供了hcov-ek系列多肽，所述多太不仅对目前流行的一些人冠状病毒有较好的抑制效果，并且对有可能感染人类的类sars病毒(rsshc014-cov或rsw1v1-cov)同样具有很好的抑制活性。另外，本发明的有益效果还体现在对人冠状病毒多肽类进入抑制剂的研发领域具有重要的意义，一直以来，相关的研究都表明mers-cov和sars-cov的多肽类进入抑制剂之间没有交叉的保护效果，从而认为人冠状病毒多肽类进入抑制剂同样受到病毒特异性的限制(参考文献：lu,l.,q.liu,y.zhu,k.h.chan,l.qin,y.li,q.wang,j.f.chan,l.du,f.yu,c.ma,s.ye,k.y.yuen,r.zhang,ands.jiang.2014.structure-baseddiscoveryofmiddleeastrespiratorysyndromecoronavirusfusioninhibitor.natcommun5:3067.和gao,j.,g.lu,j.qi,y.li,y.wu,y.deng,h.geng,h.li,q.wang,h.xiao,w.tan,j.yan,andg.f.gao.2013.structureofthefusioncoreandinhibitionoffusionbyaheptadrepeatpeptidederivedfromthesproteinofmiddleeastrespiratorysyndromecoronavirus.jvirol87:13134-13140.)，然而本发明将首次打破这一传统观点，这对人类冠状防控具有重大的意义。
附图说明
图1、人类冠状病毒侵染靶细胞的模式图，以及hcov-ek系列多肽抑制人类冠状病毒s蛋白介导病毒与靶细胞融合的作用机制。
图2、hcov-ek系列多肽对sars-cov,mers-cov的s蛋白所介导的细胞-细胞融合的抑制活性。
图3、hcov-ek1代表多肽抗人冠状病毒的广谱性。
图4、hcov-ek系列多肽对mers-cov假病毒的抑制活性。
图5、hcov-ek1代表多肽抗病毒的作用机制。
具体实施方式
本发明通过下述实施例进一步阐明，但任何实施例或其组合不应当理解为对本发明的范围或实施方式的限制。本发明的范围由所附权利要求书限定，结合本说明书和本领域一般常识，本领域普通技术人员可以清楚地明白权利要求书所限定的范围。在不偏离本发明的精神和范围的前提下，本领域技术人员可以对本发明的技术方案进行任何修改或改变，这种修改和改变也包含在本发明的范围内。
所涉及的实验材料：
多肽：
本申请中通过将人类型冠状病毒s2蛋白中hr1和hr2序列的同源性对比，并基于相关的晶体结构，设计三条衍生于hr2区域的人工多肽，由上海杰肽生物科技有限公司进行合成及纯化，其纯度>95％。
实施例1抑制人类冠状病毒s蛋白介导的细胞-细胞融合实验(cell-cellfusion)
(一)、实验方法：
1.293t细胞转染能编码人类冠状病毒s蛋白的质粒后培养36-48h，作为效应细胞，例如，使用能编码mers-covs蛋白的质粒--paav-ires-gfp-mers-s转染的293t细胞称之为293t/mers/egfp细胞，293t细胞转染空载体质粒--paav-ires-gfp后为293t/egfp细胞，在作为阴性对照细胞；
2.上述的细胞使用0.02％的edta消化，离心，使用新鲜的10％fbs的dmem培养基重悬细胞，并调整细胞浓度至2×105个/ml，取出50μl加入到梯度稀释的药物(50μl)中，在37℃，孵育30min；
3.取100μl细胞/药物混合液加入到已经铺板在96孔板的靶细胞(huh-7)上，5％co2，37℃培养2-4小时,用荧光显微镜的绿色荧光通道观察并记录细胞的融合情况；
结果显示：
1.如图2a,b所示，hcov-ek系列多肽对sars-cov和mers-cov的s蛋白所介导的细胞-细胞融合有很好的抑制效果，显示了hcov-ek系列多肽可同时抑制两种人冠状病毒的广谱性，其中hcov-ek1多肽抗病毒活性最好；
2.以hcov-ek1多肽为代表，进一步检测系列多肽抗病毒的广谱性，结果表明，在细胞-细胞融合系统上，hcov-ek1多肽不仅可以对sars-cov和mers-cov具有抑制作用，并且还可以抑制类sars冠状病毒(rsshc014-cov或rsw1v1-cov)和hcov-229的s蛋白所介导的融合过程(如图3所示)，在表2中，系统的展示了在细胞-细胞融合实验中hcov-ek系列多肽的广谱的抗病毒效果，ic50均在在纳摩尔水平，全面地展示了系列多肽的高效广谱的抗病毒活性的特征。
实施例2多肽对人类冠状病毒假病毒的抑制活性测定
(一)、实验方法：
1.使用dmso溶解多肽并测定多肽浓度；
2.制备表达人类冠状病毒受体的靶细胞(huh7)细胞悬液，调整细胞浓度后每孔中加入104个细胞；
3.96孔板中使用含10％fbs的dmem培养液2倍梯度稀释多肽药物，每孔50μl；
4.将一定滴度的mers-cov假病毒加入药物稀释板中50μl/每孔加入。室温作用30min，使药物与病毒充分作用。每孔中加入药物与病毒混合液100μl加入到去除上清的靶细胞中，37℃培养12h后更换含10％fbs的新鲜dmem培养基。5.72h后测定luciferase，计算制作抑制率曲线，并计算药物的半数抑制浓度(ic50)；
(二)、结果显示，
1.以目前仍在流行的冠状病毒mers-cov为代表，在其假病毒系统上再次检测hcov-ek系列多肽其抗病毒活性，结果如图4所示，hcov-ek系列多肽同样展现出较好的抗病毒活性，并与之前的细胞-细胞融合实验的结果较为一致；
2.与近期报道的mers-cov多肽类进入抑制剂hr2p-m2相比，hcov-ek系列多肽的抗mers-cov活性均有明显的提高，表明本发明中的hcov-ek系列多肽在获得其抗病毒的“广谱性”的同时，并没有以牺牲其抗病毒活性为代价。
实施例3、hr2多肽抗病毒作用机制研究实验
以hcov-ek1为代表，检测系列多肽与衍生于不同人冠状病毒hr1区域的多肽(hr1ps)之间的相互作用，从而进一步探索hcov-ek系列多肽的抗病毒机制；由于sars-cov和类sars病毒(rsshc014-cov或rsw1v1-cov)在hr1区域的序列完全一致，因而这里可以同时解释hcov-ek系列多肽抗rsshc014-cov或rsw1v1-cov的机制；本部分研究参照文献进行。(liu,s.,g.xiao,y.chen,y.he,j.niu,c.r.escalante,h.xiong,j.farmar,a.k.debnath,p.tien,ands.jiang.2004.interactionbetweenheptadrepeat1and2regionsinspikeproteinofsars-associatedcoronavirus:implicationsforvirusfusogenicmechanismandidentificationoffusioninhibitors.lancet363:938-947.)
(一)、实验方法：
1、非变性聚丙稀酰胺凝胶电泳(n-page)：将hr1系列多肽分别于hr2系列多肽混合(终浓度各30μm)，37℃孵育30分钟，取5×高ph值上样缓冲液，与4倍体积的肽混合物混匀，然后点样(每孔25μl)于18％非变性胶中(北京天恩泽)，于室温下125v恒压电泳2小时，考马斯亮蓝染色，结果显示，hcov-ek1在与hr1p系列多肽混合以后，均产生了一条可能是六螺旋复合物的新条带(如图5a所示)；
2、圆二色谱测定多肽二级结构：用50mmol/l，ph7.2的磷酸缓冲液将游离多肽或多肽混合物稀释到终浓度为10μmol/l，使用分光偏振仪(j-815型，jascoinc,japan)测定圆二色谱。检测温度4℃，带宽5.0nm，解析度0.1nm，光径0.1cm，反应时间4.0s，扫描速度50nm/min。在222nm以5℃/min的温度梯度变化监测多肽的热变性，减去缓冲溶液的空白对照来校正谱值，对熔解曲线进行平滑化处理，并用jasco计算热解离转变的中点温度，即tm值。
(二)、结果显示：
1.如图5a所示，衍生于多种人冠状病毒hr1的多肽，包括sars-cov-hr1p(rsshc014-cov-hr1p或rsw1v1-cov-hr1p),mers-cov-hr1p,hcov-229e-hr1p，与hcov-ek1多肽混合后，均产生了一条可能是六螺旋复合物的新条带；另外，实验结果表明hcov-ek1多肽与hcov-nl63-hr1p多肽或hcov-oc43-hr1p多肽混合后，可以出现同样的现象，提示hcov-ek系列多肽还有抑制hcov-nl63和hcov-oc43的活性；
2.如图5b所示，单独的多肽为低螺旋结构，当hcov-ek1多肽与sars-cov-hr1p(rsshc014-cov-hr1p或rsw1v1-cov-hr1p),mers-cov-hr1p或hcov-229e-hr1p混合后，出现高度的螺旋结构，该结果符合六螺旋核心结构的cd光谱；而其tm值表示其稳定程度。
本申请的上述实验结果表明，所述hcov-ek系列多肽有非常广谱并高效的抗病毒活性，可对2种以上的人冠状病毒有很好的抑制效果，其中包括sars-cov,mers-cov，hcov-229e以及类sars病毒(rsshc014-cov或rsw1v1-cov)；该hcov-ek系列多肽的主要抗病毒机制是通过与病毒的hr1区域结合，形成稳定的异源6hb，阻止了病毒自身的hr2与hr1三聚体结合，使它们不能形成同源6hb，进而干扰病毒与细胞膜之间的融合，阻断病毒感染。
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