本发明涉及生物技术领域,具体涉及一种重组noti限制性内切酶在大肠杆菌中的生产方法。
背景技术：
限制性核酸内切酶是可以识别特定的核苷酸序列，并在每条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键进行切割的一类酶，简称限制酶。根据限制酶的结构，辅因子的需求切位与作用方式，可将限制酶分为三种类型，分别是第一型(typei)、第二型(typeii)及第三型(typeiii)。
第一型限制酶同时具有修饰及识别切割的作用；另有识别dna上特定碱基序列的能力，通常其切割位距离识别位可达数千个碱基之远。例如：ecob、ecok。
第二型限制酶只具有识别切割的作用，修饰作用由其他酶进行。所识别的位置多为短的回文序列；所剪切的碱基序列通常即为所识别的序列。是遗传工程上，实用性较高的限制酶种类。例如：ecori、hindⅲ。
第三型限制酶与第一型限制酶类似，同时具有修饰及识别切割的作用。可识别短的不对称序列，切割位与识别序列约距24-26个碱基对。例如：hinfⅲ。
ⅱ型限制与修饰系统所占的比例最大，达93％。
其中ⅱ型酶相对来说最简单，它们识别回文对称序列，在回文序列内部或附近切割dna，产生带3'-羟基和5'-磷酸基团的dna产物，需mg2+的存在才能发挥活性，相应的修饰酶只需sam。识别序列主要为4-6bp，或更长且呈二重对称的特殊序列，但有少数酶识别更长的序列或简并序列，切割位置因酶而异，有些是隔开的。
ⅱs型限制与修饰系统，占5％，与ⅱ型具有相似的辅因子要求，但识别位点是非对称，也是非间断的，长度为4-7bp，切割位点可能在识别位点一侧的20bp范围内。
ⅱ型限制酶一般是同源二聚体，由两个彼此按相反方向结合在一起的相同亚单位组成，每个亚单位作用在dna链的两个互补位点上。修饰酶是单体，修饰作用一般由两个甲基转移酶来完成，分别作用于其中一条链，但甲基化的碱基在两条链上是不同的。
在ⅱ型限制酶中还有一类特殊的类型，该酶只切割双链dna中的一条链，造成一个切口，这类限制酶也称切口酶，如n.bstnbi。
本研发项目中的noti限制性内切酶即属于ⅱ型限制酶其识别位点为：
5’-gc^ggccgc-3’
5’-cgccgg^cg-3’
通过切割c与g之间的磷酸二酯键使3’端带有磷酸基团，5’端带有羟基。
noti不仅为一普通的限制性内切酶，它在生物领域的其他方向也具有重要的应用价值及研究潜力，有关notⅰ蛋白性质特征及功能机制等方面的报道日渐增多。
目前商品化noti蛋白的价格居高不下，主要原因在于表达量较低、提纯繁杂、得率低、酶活低等问题的存在，现有的noti表达工艺落后，很难实现重组noti在大肠杆菌中表达；目前文献中noti纯化流程涉及到了阴离子交换柱、肝素琼脂糖亲和层析柱、deae-琼脂糖柱、pei柱等上柱洗脱过程，整个纯化流程约需3到4天，工艺繁琐且蛋白损失较大。
技术实现要素：
本发明目的提供一种重组noti限制性内切酶在大肠杆菌中的生产方法，以解决上述技术问题。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：
一种重组noti限制性内切酶在大肠杆菌中的生产方法，包括以下步骤：
a)、pcreatduet-noti-甲基化酶表达质粒的构建；
b)、noti限制性内切酶与甲基化酶蛋白的诱导表达与鉴定；
c)、noti限制性内切酶与甲基化酶蛋白的纯化与鉴定。
进一步的，所述的步骤a)具体分如下步骤：根据密码子优化后的基因序列，noti限制性内切酶与甲基化酶直接进行基因合成；将质粒pcreatduet通过酶切进行线性化，线性化产物与基因合成产物进行无缝构建，形成重组产物；取20ul重组产物转移到top10感受态细胞中，冰上静置30min，然后42℃热激90s，再冰上静置2min，再加入600ullb液体培养基，37℃摇床200rpm摇45min，涂布于含50ug/ml卡那霉素抗性的lb平板中，最后放入37℃培养箱培养过夜；随机挑取四个克隆，接入4ml含卡那霉素抗性的lb平板中；37℃摇床220rpm摇过夜，抽提质粒并测序。
进一步的，所述的步骤b)具体分如下步骤：将步骤a)中鉴定为阳性的pcreatduet-noti-甲基化酶质粒转入感受态bl21(de3)中，涂布于含卡那霉素的lb平板上，37℃倒置培养过夜；挑单克隆于含卡那霉素的lb平板中，37℃摇床，220rpm培养过夜，以1:100接过夜菌于4ml含卡那霉素抗性的lb平板中，继续培养2.5h，od600nm达到0.6～0.8时加入iptg至终浓度0.5mm，于15℃过夜诱导蛋白表达；取2ml菌液12000rpm离心1min收集菌体，加入100ul的1×上样缓冲液，煮沸5min，冷却后12000rpm离心1min，取10ul样品进行12％聚丙烯酰胺凝胶电泳，取下凝胶利用快染仪染色脱色10min，观察诱导前后蛋白条带的变化，结果显示目的蛋白有表达。
进一步的，将过夜培养已转入pcreatduet-noti-甲基化酶质粒的bl21菌液以1:100接于800ml含卡那霉素抗性lb中，37℃摇床，220rpm培养2h左右，od600nm达到0.6-0.8时，加入iptg至终浓度0.5mm，于15℃过夜诱导蛋白表达，8000rpm离心10min，收集菌体，零下20℃保存；零下20℃冻存菌体按每克湿菌5ml的比例加入细菌裂解液，超声破菌，4℃，16000rpm离心15min，沉淀在底部，分别取上清、包涵体沉淀做sds-page，结果显示noti蛋白主要存在于上清中；收集菌体加入裂解液重悬，超声破碎后离心，16000rpm离心15min，将上清液置于干净的50ml的离心管中加入2mlni柱，4℃孵育2h，裂解液洗柱100ml，利用含有20mm咪唑的裂解液洗脱30ml，含有500mm咪唑的裂解液洗脱5ml，将5ml含有500mm咪唑的洗脱液以noti储存液作为流动相过分子筛superdex200，根据280nm紫外吸收值收集含目的蛋白的洗脱液，将目的蛋白液用12％的sds-page进行检测。
本发明的有益效果：
本发明应用大肠杆菌表达系统，通过设计共表达载体，与甲基化酶基因共同表达，甲基化酶可以保护大肠杆菌基因组免受noti的影响，从而实现重组noti在大肠杆菌中表达，再经过亲和层析和superdex200凝胶过滤层析对noti蛋白进行提纯，整个纯化过程仅需5到6h，简单的两步纯化方式整体大幅缩短了noti蛋白的纯化流程与纯化时间，同时提高了noti蛋白的纯度、得率和酶活。该noti蛋白纯化工艺的新方法，为研发及生产其他ⅱ型限制性内切酶奠定了基础。
具体实施方式
以下通过具体实施例对本发明进行详细描述。
本发明包括以下步骤：
一种重组noti限制性内切酶在大肠杆菌中的生产方法，包括以下步骤：
a)、pcreatduet-noti-甲基化酶表达质粒的构建；
b)、noti限制性内切酶与甲基化酶蛋白的诱导表达与鉴定；
c)、noti限制性内切酶与甲基化酶蛋白的纯化与鉴定。
所述的步骤a)具体分如下步骤：根据密码子优化后的基因序列，noti限制性内切酶与甲基化酶直接进行基因合成；将质粒pcreatduet通过酶切进行线性化，线性化产物与基因合成产物进行无缝构建，形成重组产物；取20ul重组产物转移到top10感受态细胞中，冰上静置30min，然后42℃热激90s，再冰上静置2min，再加入600ullb液体培养基，37℃摇床200rpm摇45min，涂布于含50ug/ml卡那霉素抗性的lb平板中，最后放入37℃培养箱培养过夜；随机挑取四个克隆，接入4ml含卡那霉素抗性的lb平板中；37℃摇床220rpm摇过夜，抽提质粒并测序。
所述的步骤b)具体分如下步骤：将步骤a)中鉴定为阳性的pcreatduet-noti-甲基化酶质粒转入感受态bl21(de3)中，涂布于含卡那霉素的lb平板上，37℃倒置培养过夜；挑单克隆于含卡那霉素的lb平板中，37℃摇床，220rpm培养过夜，以1:100接过夜菌于4ml含卡那霉素抗性的lb平板中，继续培养2.5h，od600nm达到0.6～0.8时加入iptg至终浓度0.5mm，于15℃过夜诱导蛋白表达；取2ml菌液12000rpm离心1min收集菌体，加入100ul的1×上样缓冲液，煮沸5min，冷却后12000rpm离心1min，取10ul样品进行12％聚丙烯酰胺凝胶电泳，取下凝胶利用快染仪染色脱色10min，观察诱导前后蛋白条带的变化，结果显示目的蛋白有表达。
将过夜培养已转入pcreatduet-noti-甲基化酶质粒的bl21(de3)菌液以1:100接于800ml含卡那霉素抗性lb中，37℃摇床，220rpm培养2h左右，od600nm达到0.6-0.8时，加入iptg至终浓度0.5mm，于15℃过夜诱导蛋白表达，8000rpm离心10min，收集菌体，零下20℃保存；零下20℃冻存菌体按每克湿菌5ml的比例加入细菌裂解液，超声破菌，4℃，16000rpm离心15min，沉淀在底部，分别取上清、包涵体沉淀做sds-page，结果显示noti蛋白主要存在于上清中；收集菌体加入裂解液重悬，超声破碎后离心，16000rpm离心15min，将上清液置于干净的50ml的离心管中加入2mlni柱，4℃孵育2h，裂解液洗柱100ml，利用含有20mm咪唑的裂解液洗脱30ml，含有500mm咪唑的裂解液洗脱5ml，将5ml含有500mm咪唑的洗脱液以noti储存液作为流动相过分子筛superdex200，根据280nm紫外吸收值收集含目的蛋白的洗脱液，将目的蛋白液用12％的sds-page进行检测。
以上所述的本发明实施方式，并不构成对本发明保护范围的限定,任何在本发明的精神和原则之内所作的修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的权利要求保护范围之内。