一种绿色荧光蛋白结合蛋白偶联的琼脂糖的制备方法与流程

本发明属于生物试剂发明领域，具体的说，是涉及一种绿色荧光蛋白结合蛋白偶联的琼脂糖的制备方法。

背景技术：

随着现代分子生物学和生物化学技术的发展，对于小分子之间的互作研究越来越热门，一般而言，小分子互作主要包括蛋白和蛋白之间的互作，dna和蛋白之间的互作，rna和蛋白之间的互作，要研究清楚靶蛋白和其互作分子之间的关系一般采用免疫沉淀的方式，简而言之，就是用靶蛋白的抗体和proteina/g偶联后，靶蛋白会结合到proteina/g上面，其互作分子也会相应被拖下来，采用westernblot或者质谱的方式来分析其互作情况。但是，靶蛋白特异性的抗体和proteina/g结合能力较弱，因此捕获靶蛋白的能力也弱，一些和靶蛋白互作较弱或者间接性互作的分子就不容易被发掘。

目前常用的商业化beads有很多种，比如myc、flag、ha、his等等，这些beads结合效率不仅低，而且成本非常昂贵，对于大量做ip或者质谱的实验室来说，选择一种经济实惠而且效价很高的beads是非常重要的。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种绿色荧光蛋白结合蛋白偶联的琼脂糖的制备方法。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种绿色荧光蛋白结合蛋白偶联的琼脂糖的制备方法，包括如下：

（1）载体设计以及构建：设计引物pet28ahis-gbpf：tcgcggatccgaattcatgcaggttcagctggttga，pet28ahis-gbpr：gtgcggccgcaagcttagaagaaacggtaacctggg，以pcr扩增的方式获得gbp基因产物，回收后和线性化的pet28a载体连接，转化dh5a，菌落pcr验证大小正确的克隆送测序，测序正确的单菌落提取质粒并保菌；获得的gbp基因产物是做了突变改造的gbp，具体表现为将第66个氨基酸赖氨酸k突变为丙氨酸a；

（2）将取得的质粒用于目的蛋白的诱导表达及纯化；

（3）nhs偶联获得绿色荧光蛋白结合蛋白偶联的琼脂糖。

所述的目的蛋白的诱导表达及纯化为：

（1）转化：取1μl质粒加到50μlbl21感受态细胞中，冰上30min，42℃热击90秒，冰上2min，加入500μl不含抗生素的液体lb培养基，37℃150rpm复苏1h，取100μl菌液涂布于含50ug/ml卡那霉素的固体lb培养基上，37℃培养箱中倒置培养18h；

（2）活化：挑取单克隆于含50ug/ml卡那霉素的15ml液体lb培养基的50ml离心管中，37℃220rpm培养过夜；

（3）扩培：菌液按1:100的体积比例转接5ml菌液到两瓶含50ug/ml卡那霉素的500ml液体lb培养基的三角瓶中，37℃220rpm培养2h，od值0.4-0.6；

（4）诱导：分别加入500μl0.1miptg，终浓度0.1mm，16℃220rpm诱导过夜14h；

（5）收菌：用离心瓶或者50ml离心管收集菌体，4℃6000rpm离心5min；

（6）重悬：菌体用10mlpbs重悬，加入蛋白酶抑制剂复合物，100μltritonx-100，终浓度1%，100μl1m咪唑，终浓度10mm；

（7）破碎：放置冰上超声破碎直至菌液不再粘稠；

（8）离心：4℃12000rpm离心15min；

（9）平衡ni-ntaagarose：取250μlni-natagarose于1.5ml离心管中，加入750μlpbs，颠倒数次，4℃1000g离心3min；重复洗两次；

（10）结合：将蛋白上清转移到15ml离心管中，加入平衡过的ni-ntaagarose250μl，4℃旋转结合2h或者过夜；

（11）洗脱：4℃1000g离心3min，弃上清；用10倍体积含50mm咪唑的pbs洗脱杂蛋白，总共洗三次；将ni-ntaagarose转移到1.5ml离心管中，吸干上清，用400μl500mm咪唑洗脱his-gbp，4℃旋转15min后离心收集上清到新的离心管中；重复洗脱一次；

（12）bca法测蛋白浓度；同时跑sds-page胶，考染鉴定纯化效果；

（13）超滤法除咪唑：用200μlddh2o平衡10k超滤管，14000g室温离心15min；将蛋白上清转移到超滤管中，14000g室温离心15min，用450μlpbs洗五次；更换新的收集管，倒扣离心15min收集上清液蛋白。

所述nhs偶联为：

（1）称取0.15gnhs-activatedagarose干粉于15ml离心管中，200μl蛋白上清用1mlpbs稀释后加入管中，另外加入2mlpbs让干粉充分吸胀，室温结合1h；

（2）4℃1000g离心3min，弃上清，用3mlpbs洗三次；

（3）加入3mlph7.41mtris-cl封闭nhs未结合位点，室温结合20min；

离心弃上清，用3mlpbs洗三次；

（4）加入1mlpbs，1μl1000×nan3，终0.02w/v%，4℃保存，最终得到绿色荧光蛋白结合蛋白偶联的琼脂糖。

本发明的优点在于：本绿色荧光蛋白结合蛋白偶联的琼脂糖利用原核表达的方式诱导表达出gfpbindingprotein，gfpbindingprotein能够和nhs-activatedagarose高效地结合，这种结合能力要远远大于其他琼脂糖的结合能力，同时也大于gfp抗体和proteina/g制作的琼脂糖的结合能力，同时，在gfpbindingprotein和nhs-activatedagarose完全偶联以后，采用quenchingbuffer封闭住未结合位点，有效地降低了非特异结合。

附图说明

图1铺有hek293t细胞的六孔板中各转染3微克gfp质粒，裂解后做免疫共沉淀，a为本发明绿色荧光蛋白结合蛋白偶联琼脂糖珠，b为proteina/g和gfp抗体孵育后座的ip，左边本发明琼脂糖珠做完ip后都发绿，说明结合效率非常高，右边为对应的考马斯亮蓝染色图。

图2在hek293细胞中共转染以下质粒：1微克cry2，1.5微克gfpcop1，1微克flag-co，1微克myc-spa1质粒，光处理0h、0.5h、1.5h，裂解后使用本发明琼脂糖做的co-ip结果，结果表明cry2、spa1在蓝光下竞争性结合cop1，从而抑制了cop1和co的互作。

图3在大豆中使用k599农杆菌介导的方法注射含有gfp的农杆菌，长出的发剪下研磨裂解开后使用本发明琼脂糖珠做ip，然后跑sds聚丙烯酰胺变性胶后切胶酶解，使用质谱检测gfp蛋白的表达，可以非常清晰的检测到gfp的表达。

图4绿色荧光蛋白结合蛋白偶联的琼脂糖特异性结合结果图。a是用普通方法做的ip，有明显的背景杂带，b是用我们gfpbeads做的ip，背景非常干净。

具体实施方式

实施例1

一种绿色荧光蛋白结合蛋白偶联的琼脂糖的制备方法，包括如下：

（1）载体设计以及构建：设计引物pet28ahis-gbpf：tcgcggatccgaattcatgcaggttcagctggttga，pet28ahis-gbpr：gtgcggccgcaagcttagaagaaacggtaacctggg，以pcr扩增的方式获得gbp基因产物，回收后和线性化的pet28a载体连接，转化dh5a，菌落pcr验证大小正确的克隆送测序，测序正确的单菌落提取质粒并保菌；

（2）将取得的质粒用于目的蛋白的诱导表达及纯化；

（3）nhs偶联获得绿色荧光蛋白结合蛋白偶联的琼脂糖。

所述的目的蛋白的诱导表达及纯化为：

（1）转化：取1μl质粒加到50μlbl21感受态细胞中，冰上30min，42℃热击90秒，冰上2min，加入500μl不含抗生素的液体lb培养基，37℃150rpm复苏1h，取100μl菌液涂布于含50ug/ml卡那霉素的固体lb培养基上，37℃培养箱中倒置培养18h；

（2）活化：挑取单克隆于含50ug/ml卡那霉素的15ml液体lb培养基的50ml离心管中，37℃220rpm培养过夜；

（3）扩培：菌液按1:100的体积比例转接5ml菌液到两瓶含50ug/ml卡那霉素的500ml液体lb培养基的三角瓶中，37℃220rpm培养2h，od值0.5；

（4）诱导：分别加入500μl0.1miptg，终浓度0.1mm，16℃220rpm诱导过夜14h；

（5）收菌：用离心瓶或者50ml离心管收集菌体，4℃6000rpm离心5min；

（6）重悬：菌体用10mlpbs重悬，加入一片cocktail片剂蛋白酶抑制剂复合物，100μltritonx-100，终浓度1%，100μl1m咪唑，终浓度10mm；

（7）破碎：放置冰上超声破碎直至菌液不再粘稠；

（8）离心：4℃12000rpm离心15min；

（9）平衡ni-ntaagarose：取250μlni-natagarose于1.5ml离心管中，加入750μlpbs，颠倒数次，4℃1000g离心3min；重复洗两次；

（10）结合：将蛋白上清转移到15ml离心管中，加入平衡过的ni-ntaagarose250μl，4℃旋转结合2h；

（11）洗脱：4℃1000g离心3min，弃上清；用10倍体积含50mm咪唑的pbs洗脱杂蛋白，总共洗三次；将ni-ntaagarose转移到1.5ml离心管中，吸干上清，用400μl500mm咪唑洗脱his-gbp，4℃旋转15min后离心收集上清到新的离心管中；重复洗脱一次；

（12）bca法测蛋白浓度；同时跑sds-page胶，考染鉴定纯化效果；

（13）超滤法除咪唑：用200μlddh2o平衡10k超滤管，14000g室温离心15min；将蛋白上清转移到超滤管中，14000g室温离心15min，用450μlpbs洗五次；更换新的收集管，倒扣离心15min收集上清液蛋白。

所述nhs偶联为：

（1）称取0.15gnhs-activatedagarose干粉于15ml离心管中，200μl蛋白上清用1mlpbs稀释后加入管中，另外加入2mlpbs让干粉充分吸胀，室温结合1h；

（2）4℃1000g离心3min，弃上清，用3mlpbs洗三次；

（3）加入3mlph7.41mtris-cl封闭nhs未结合位点，室温结合20min；

离心弃上清，用3mlpbs洗三次；

（4）加入1mlpbs，1μl1000×nan3，终0.02w/v%，4℃保存，最终得到绿色荧光蛋白结合蛋白偶联的琼脂糖。

应用实施例2

（1）在铺有hek293t细胞的六孔板中各转染3μggfp质粒，裂解后采用本发明制备的琼脂糖做免疫共沉淀，具体结果如图1，a为我们自己制作的绿色荧光蛋白结合蛋白偶联琼脂糖，b为proteina/g和gfp抗体孵育后做的免疫共沉淀，左边自己制作的琼脂糖，做完ip后都发绿，说明结合效率非常高，右边为对应的考马斯亮蓝染色图；而b中显示了在做完免疫共沉淀后，beads没有明显发绿，说明ip下来的gfp蛋白相对来说比较少，而且做了考马斯亮蓝染色后基本看不到条带，也印证了其结合效率要比我们自己做的beads低很多。

（2）在hek293细胞中共转染以下质粒：1微克cry2，1.5微克gfpcop1，1微克flag-co，1微克myc-spa1质粒，光处理0h、0.5h、1.5h，裂解后使用实施例1中制作的琼脂糖珠做的co-ip结果如图2，结果表明cry2、spa1在蓝光下竞争性结合cop1，从而抑制了cop1和co的互作，此结果使用普通的方法即proteina/g和抗体孵育的方法做不出来。

gfpcop1、flag-co、myc-spa1、cry2质粒的制备方法为：

分别设计如下pcr引物：

cop1f：gcgtggtacctctagaatggaagagatttcgacgga；

cop1r：gaagcggccgcccgggtcacgcagcgagtaccaga；

cof：gcgtggtacctctagaatgttgaaacaagagagtaa；

cor：gaagcggccgcccgggtcagaatgaaggaacaatc；

spa1f：gcgtggtacctctagaatgcctgttatggaaagagt；

spa1r：gaagcggccgcccgggtcaaacaagttttagtagc；

cry2f：gcgtggtacctctagaatgaagatggacaaaaagac；

cry2r：gaagcggccgcccgggtcatttgcaaccatttttt；

以拟南芥cdna为模板，进行pcr扩增，然后回收pcr产物，将产物与线性化pci(neo)载体相连获得相对应的质粒。

（3）在大豆中使用k599农杆菌介导的方法注射含有gfp的农杆菌，长出的发根剪下研磨裂解开后使用实施例1制作的琼脂糖珠做ip，然后跑sds聚丙烯酰胺变性胶后切胶酶解，使用质谱检测gfp蛋白的表达，可以非常清晰的检测到gfp的表达（如图3），此结果使用proteina/g和gfp抗体孵育的方式做不出来，因为大豆发根中蛋白表达量非常少，只有高效的富集能力才能富集得到质谱能够识别的蛋白量。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

sequencelisting

<110>吉林大学

<120>一种绿色荧光蛋白结合蛋白偶联的琼脂糖的制备方法

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