本发明属于生物技术应用领域，涉及一种棉花非编码RNA基因GhDAN1及其应用。
技术背景
棉花作为最重要的农作物之一，生产天然的纺织工业原料，每年带动全球60亿元的纺织工业产业链，保证2千万个产业工人就业。近年来我国棉花种植面积逐年下降，生产成本相对于美国进口棉居高不下。生产成本高的主要原因是棉花种植机械化程度不高导致的人工成本高。机械化播种对水分的控制要求高，而我国棉花主要产区处于西北内陆，主要集中在新疆地区，多有干旱、高盐碱等自然条件限制。苗期干旱使棉花产量降低，纤维品质下降。因此如何提高棉花品种对干旱等逆境胁迫的耐受力，对降低我国棉花种植成本，进一步增强在国际上的竞争力具有重要的意义。培育干旱耐受性棉花品种是我国棉花生产的迫切要求。
近年来，棉花的基因组学和功能基因组学的发展为分子设计育种打开了新的道路，对主要耐旱基因的识别和应用可以直接指导棉花精准设计育种。干旱胁迫对棉花产生复杂的影响，包括种子萌发率、苗期子叶含水量、叶片光谱和光合效率。这些生理现象，引起清蛋白、球蛋白和醇溶蛋白含量的变化。目前棉花耐旱性相关的分子遗传研究还是主要围绕着胁迫诱导基因。这类胁迫诱导基因主要可以分为以代谢功能为主的渗透调节型基因、胁迫信号转导基因和耐旱相关转录因子。在棉花基因组中，参与渗透调节作用的基因包涵有脯氨酸代谢途径中的吡咯琳-5-羧酸合成酶、海藻糖代谢、水通道蛋白等。非生物胁迫信号转导基因包括受体激酶GbRLK，GhMKK1，GhMPK6a，GhMKK5，GhMAP3K40，胁迫响应基因GhRDL1等。棉花干旱调控的转录因子研究主要集中在WRKY转录因子基因家族GhWRKY27a，GhWRKY25，GhWRKY41，GhWRKY17，GhWRKY15，GhWRKY3。另外，植物对干旱胁迫进行调节的ABA信号途径中的NAC类转录因子在棉花中也可能具有重要功能。
长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是基因组中一类特殊的转录本，是长度超过200碱基(nucleotide，nt)但是不具有编码蛋白质能力的RNA。与普通的编码基因不同，lncRNA的功能并不通过蛋白质形式表现出来，而是以调控其他基因表达的形式表现出来。由于lncRNA并不表达为蛋白质，而是对已有的基因进行调控，因此在应用lncRNA的基因功能改良中，并不涉及到引入外源编码基因，只是对基因组固有的基因活性行为进行改良，基本不具有转基因安全问题。
长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是一类长度大于200个碱基(nt)，且不具有蛋白编码能力的转录本。LncRNA具有对环境刺激产生积极应答的表达特征，并且序列保守性低等特点，满足调控植物对环境适应性的遗传基础要求。植物对环境胁迫耐受性的调节机制需要具备以下几个特点。首先是应激性，也就是对不同的环境变化的刺激都能产生适应性的反应。第二，不依赖于基因组的序列。由于遗传变异发生的概率相对低，而环境变化的因素相对多。以相对稳定的基因组序列来应对相对多变的环境，就要降低对序列的依赖。LncRNA根据在基因组DNA上的转录位置可以分为基因间区RNA(long intergenic non-coding RNA，lincRNA)，天然反义转录本(natural antisense transcript,NAT)和内含子RNA(intronic non-coding RNA,incRNA)等。LncRNA的表达在动物和植物物种中都具有显著的组织特异性和应激性。另外，lncRNA既可以通过与蛋白质的结合，来影响染色质的结构；又可以通过在本地形成nat-siRNA来对基因进行表达干预；还能影响mRNA的编辑。这些调节作用都不依赖于序列的变异就可以完成。因此lncRNA不仅在植物适应性中的功能具有重要的意义，在提高作物适应性等应用中也具有重要的意义。在农作物的抗旱、耐盐碱方面，从lncRNA功能入手的应用还是未开发领域。
LncRNA对环境胁迫的适应性功能研究，目前在植物界里仅有少量的报告。例如拟南芥中的P5CDH与SRO5互为NAT，这两个基因的转录重叠部分在高盐环境下会转录并产生NAT-siRNA，进而可能发挥次级调控功能。尽管研究数据还很有限，但是从中可以看出NAT和其可能产生的NAT-siRNA可以对多种生物和非生物逆境的刺激产生应答，参与到胁迫耐受性的分子调控。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种对棉花耐旱性具有直接调控功能的非编码RNA基因，并且通过基因工程对该基因的表达活性进行调整，以有效达到提高棉花耐旱性的目的，并根据该基因在植物基因组的保守功能，推广至单子叶和双子叶农作物耐旱性改良应用。
本发明的目的之一在于提供一种棉花非编码RNA干旱适应性调节基因GhDAN1(Drought affective non-coding gene 1)，其序列在四倍体陆地棉(G.hirsutum)TM-1A亚组中如SEQ ID NO.1所示，在四倍体陆地棉(G.hirsutum)TM-1D亚组中如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示；在二倍体亚洲棉(G.arboreum)中如SEQ ID NO.4所示，在雷蒙徳氏棉(G.raimondii)中如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。
本发明目的之二在于提供所述基因GhDAN1的克隆方法及一种重组质粒。
本发明目的之三在于提供所述基因GhDAN1的工程应用。
具体的，本发明提供了所述基因GhDAN1在增强单子叶和双子叶农作物耐旱能力中的应用。
具体的，本发明提供了了所述基因GhDAN1在提高棉花耐旱性能中的应用。
更为具体的，本发明提供了基因GhDAN1在开发耐旱单子叶和双子叶农作物新品种中的应用。
更为具体的，本发明提供了基因GhDAN1在培育耐旱棉花新品种中的应用。
本发明的目的通过以下技术方案实现：
本发明还提供了一种扩增基因GhDAN1的方法，所用的扩增引物对如下：
XLOC_222336-1:GAAAACTCTCTTGAATGCTCG(如SEQ ID NO.7所示)；
XLOC_222336-2:CAGGATTCTTTAGTTACGCAAG(如SEQ ID NO.8所示)。
本发明还提供一组扩增基因GhDAN1的引物对：
XLOC_222336-1:GAAAACTCTCTTGAATGCTCG(如SEQ ID NO.7所示)；
XLOC_222336-2:CAGGATTCTTTAGTTACGCAAG(如SEQ ID NO.8所示)。
本发明还提供一种重组质粒VIGS-TRV2-GhDAN1-1，将基因GhDAN1序列连接到中间载体VIGS-TRV2所得。本发明还提供所述基因GhDAN1、所述扩增引物对或所述重组质粒VIGS-TRV2-GhDAN1-1在基因工程中的应用，特别是在提高单子叶和双子叶农作物耐旱能力或开发耐旱单子叶和双子叶农作物新品种中的应用，更优选的是在提高棉花耐旱性能或在培育耐旱棉花新品种中的应用。
本发明所述的应用，具体方法为GhDAN1基因克隆、构建表达载体通过转基因技术转染到野生型植物品种中。
本发明所述的转基因棉花的构建方法，扩增基因GhDAN1所用的扩增引物对为：
XLOC_222336-1:GAAAACTCTCTTGAATGCTCG(如SEQ ID NO.7所示)；
XLOC_222336-2:CAGGATTCTTTAGTTACGCAAG(如SEQ ID NO.8所示)。
本发明的有益效果：
植物耐旱性状的分子机理主要通过脱落酸激素信号传导途径，由基因编码的蛋白质，包括受体蛋白、转录因子和激酶等调动对于环境适应性的分子调控网络，从而抵御逆境环境。而本发明中的非编码基因在干旱逆境中，对这些蛋白质编码基因产生调控作用，从而提高棉花的耐旱性。
通过对40个棉花保守性lncRNA的干扰表达分析实验结果的统计分析结果发现，GhDAN1在棉花干旱胁迫中受到诱导表达。本发明基因GhDAN1全长序列是通过棉花基因组总RNA链特异性测序数据组装和拼接得到的全长cDNA序列。该技术通过对棉花总RNA的深度测序，使基因组中非编码区转录本、非Poly A尾RNA、低丰度RNA和特异链表达RNA能够快速准确的获得。
本发明所克隆的基因位于异源四倍体陆地棉基因组中的A08染色体，全长gDNA为5570bp。在陆地棉基因组中转录活跃，并出现多种可变剪切体。在拟南芥和水稻基因组中没有全长同源序列。通过短序列比对分析中发现，在长度为3880bp的RNA转录本1600-1710bp和2300-2400bp处，分别具有一段在水稻和拟南芥基因组中相似度在74-83％的同源区域。GhDAN1在染色体上位于一个谷氨酰还原酶(Glutaredoxin，GRX)编码基因GhGRX上游1646bp。该基因结构首次得到全面展示。
利用陆地棉35个组织的转录组数据进行分析表明，该基因在不同组织中表达具有差异。相对定量反转录PCR结果表明，该基因在叶片中表达高于胚珠，是在叶片组织中特异表达lncRNA。
对棉花进行干旱处理8天后，经VIGS沉默GhDAN1的植株出现了明显耐旱的表型，表现为叶片萎蔫度低。进一步的生理生化指标检测发现，相对于对照组，VIGS沉默GhDAN1的植株光合速率高、呼吸速率低、气孔导度低、水利用效率高。这些初步数据表明非编码基因GhDAN1可以参与棉花干旱耐受适应性分子调控。
附图说明
图1:GhDAN1基因结构；
图2:GhDAN1在陆地棉基因组中的可变剪切转录本；
图3:GhDAN1和临近基因GhGRX的表达特征；
图4:抑制GhDAN1表达的棉花瞬时转化植株表现为耐旱表型；
图5:q-PCR检测VIGS瞬时转基因抑制GhDAN1表达效果；
图6:抑制GhDAN1表达的棉花瞬时转化植株生理指标检测。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步说明，下面实施例未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域的公知手段。
实施例1基因的获得
通过对二倍体亚洲棉(G.arboreum,A2)、二倍体雷蒙德氏棉(G.raimondii,D5)和异源四倍体陆地棉(G.hirsutum,AD)的叶片组织进行链特异性总RNA测序的数据分析。棉花RNA文库的测序深度平均超过30倍，每个文库得到9.7亿条raw reads。分别应用各个棉花基因组作为参考，将全部raw reads进行比对，97.76％的reads可以完全比对。利用完全比对的reads，应用Cufflinks策略进行lncRNA的序列从头拼装。最终在亚洲棉、雷蒙徳氏棉和陆地棉基因组分别得到4107、2767和8514个lncRNA。根据序列同源性比对、全基因组共线性分析，在二倍体和四倍体棉花基因组中，共得到421个保守性lncRNA。发现其中一个高表达的lncRNA基因GhDAN1(Seq NO1，图1)，位于一个谷氨酰还原酶(Glutaredoxin，GRX)编码基因的上游，是一个受到干旱胁迫诱导表达的基因。根据拼接的GhDAN1全长序列，其序列在四倍体陆地棉(G.hirsutum)TM-1A亚组中如SEQ ID NO.1所示，在四倍体陆地棉(G.hirsutum)TM-1D亚组中如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示；在亚洲棉(G.arboreum)中如SEQ ID NO.4所示，在雷蒙徳氏棉(G.raimondii)中如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。
实施例2棉花非编码RNA基因GhDAN1基因结构，在棉属基因组与植物基因组中的进化结构
GhDAN1在陆地棉基因组中具有6个可变剪切RNA序列模式，各种可变剪切模式带有3-4个外显子，长度为652-3880bp(图2)。该基因位于异源四倍体陆地棉基因组的A亚组，其gDNA全长在二倍体亚洲棉基因组(SEQ ID NO.4)和异源四倍体棉花A亚基因组(SEQ ID NO.1)中的序列保守性为98％。在异源四倍体陆地棉D亚组(SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3)和雷蒙徳氏棉基因组(SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6)上的相对应的位置并不能产生活跃的转录本，序列相似度下降到74-85％，并分类比对到基因组的两段序列上。说明该基因是从A基因组祖先种遗传而来。
实施例3 GhDAN1在四倍体棉花基因组的表达特性
GhDAN1位于异源四倍体陆地棉基因组A08染色体，gDNA长度为5570bp。GhDAN1全长在拟南芥和水稻中没有明显的同源基因。GhDAN1位于临近基因GhGRX的5’上游1646bp(图1)。GhGRX编码了一个谷氨酰还原酶(Glutaredoxin，GRX)，这类蛋白在抗氧化防御途径中通过减少脱氢抗坏血酸盐(dehydroascorbate)、氧化物酶(peroxidase)和甲硫氨酸亚砜还原酶(methionine sulfoxide reductase)来进行抗氧化防御。
棉花叶片与胚珠的转录组表达数据分析表明，GhDAN1在叶片组织中表达活性远远高于胚珠(图3)。而其旁邻基因在叶片与胚珠中的表达差异不大(图3)。在干旱处理后的棉花叶片中表达升高。这一结果说明GhDAN1与干旱条件的分子应答密切相关，在调控耐旱性方面起到至关重要的作用。
实施例4基因在棉花耐干旱方面的作用
1、棉花苗期瞬时转基因沉默GhDAN1表达的耐旱表型与基因型
1.1实验材料
植物材料为异源四倍体陆地棉遗传标准系TM-1(G.hirsutum,Texas Marker-1,TM-1)。植物生长室条件为22-25摄氏度，光周期条件为16小时光照/8小时黑暗。实验处理选用萌发后7-10天，子叶完全展开但是没有真叶的苗。处理用农杆菌菌株GV3101。载体构建阶段使用大肠杆菌DH5α。
1.2实验方法
1.2.1病毒诱导的基因沉默(Virus induced gene silencing,VIGS)载体构建。
根据GhDAN1的保守区域设计引物(引物和序列)，以棉花叶片cDNA为模版进行PCR扩增。
引物序列：
XLOC_222336-1:5’GAAAACTCTCTTGAATGCTCG 3’
XLOC_222336-2:5’CAGGATTCTTTAGTTACGCAAG 3’
PCR反应体系：
PCR扩增条件：94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火复性30s，72℃延伸45s，30个循环，72℃延伸10min。
对得到的扩增DNA片段经过测序确认序列无误后，用限制性内切酶EcoRI和BamHI进行酶切，并连接入VIGS-TRV2载体中，进行大肠杆菌DH5α的转化。转化得到的阳性克隆经过PCR和测序鉴定序列无误后，命名载体为VIGS-TRV2-GhDAN1-1，并提取质粒DNA，并转化到农杆菌菌株GV3101中，作为下一步实验用菌株。每组处理和对照组材料设计16个单株。实验共进行了3次重复，其中1次为双盲实验，即实验人员不清楚实验载体信息。
1.2.2农杆菌侵染
转化有VIGS-TRV2-GhDAN1-1载体的GV3101菌液经过液体培养过夜，菌液浓度达到OD600＝0.5后，与TRV1载体菌液进行等浓度混合。实验的正对照采用CLA1载体，对叶绿素合成具有抑制作用。混合后的菌液用注射器注射到棉花苗子叶背部。注射后的植物避光放置8小时后，恢复正常16/8小时光周期培养。培养温度为22-25度。
1.2.3表型观察
农杆菌侵染3-4周，正对照CLA1组的植物开始出现主要叶脉的白化现象后，开始对植物的生长发育情况进行观察。对生长情况一致的植株开始采取停止浇水的方式进行干旱处理。停水处理8天后对植物的外观进行观察。
1.2.4基因型与表型鉴定
根据GhDAN1的VIGS沉默片段区域和非沉默判断区域分别设计引物，用相对订量PCR的方法对GhDAN1的表达进行检测，筛选出GhDAN1表达明显受到抑制的植株。对干旱表型的鉴定根据植物的形态学特征、叶片的萎蔫程度来进行观察。
1.3实验结果
利用病毒诱导的基因沉默(Virus induced gene silencing,VIGS)的方法在棉花苗期干扰GhDAN1的表达，实现瞬时转基因作用，并对VIGS处理的棉花苗进行停止浇水干旱处理。停水8天后，VIGS干扰GhDAN1的植株表现出优于对照组的耐旱性，植物叶片伸展度较好(图4)。同期处理的对照组植物全部出现叶片严重皱缩萎蔫性状(图4)。qRT-PCR分析表明，通过VIGS手段对GhDAN1表达进行转基因干扰后，GhDAN1表达相对降低(图5)。
2、沉默GhDAN1表达的植物耐旱生理指标检测
对于干旱处理8天的VIGS植物，使用便携式光合仪LI-6400XT分别测量光合效率、气孔导度、水利用效率和呼吸速率。相对于干旱处理以前，以上四个生理指标在干旱处理后都有一定幅度的降低(图6)。在VIGS处理GhDAN1的植株中，出现了光合速率高(图6)，气孔导度低的状态(图6)。干旱处理8天后，由于气孔导度降低(图6)，植物可以保持较高的水利用率(图6)和低呼吸速率(图6)。实验重复了三次，其中双盲试验1次，每次实验各个处理组样本群体为n＝16。耐旱表型在三次重复中全部出现。但是以上初步试验结果说明GhDAN1通过对旁邻基因的表达调控来抵御植物在干旱胁迫形成的过氧化物损伤。
<110>南京农业大学
<120>一种棉花非编码RNA基因GhDAN1及其应用
<130>8
<170>Patent In version 3.2
<210>1
<211>5570
<212>DNA
<213>四倍体陆地棉（G. hirsutum）
<400>1
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<400>2
caaccaaaat agatcagcgg ctgccaaaag gcaagccgat cagatgcaat gaaaattata 60
tgctggaatg tccgtggatt ggggagtcta cgggcagtgc gaaggcttca tttttactga 120
agcaaaataa cccccaaatg gtcttcttca tggagactaa agttaatgaa agacgtatgg 180
agaaaattaa gagtaggtgt ggttttatga atgggtttga tgtaggagta gtaggtacgc 240
gaggagggat ctgcctagca tggaaagagg agattcaggt tagtctaaaa tctttctcga 300
cgagtcatat tgatttgttg atcaaagaag aatgtgttag taaagaatag agattcacta 360
ggttttatgg gtcaccttat atacacaata aaaatgcctc atagaattta ctaagaattt 420
tgggtcagga acaagatcac ccatggctag tgagtggaga ttttaatgaa ataatgtact 480
ttttcgaaaa aaggggaggc caactaaggg aggagaaaag gatgatagca ttctgtgaag 540
tcttaaaaga atgccaactt atagatgtgg gctatacggg agcatagtat acatgggaga 600
gagggaatct accgaaaacg aatattaaag aaagactgga taggggtgtt gcaaatgaaa 660
aatggatgaa actctttcca agaggcaata tacatcattt aacgtcttta ctttcagatc 720
attgcccctt ttttatcagc acaactaata aaaatagttt caagggaaac ccaatattta 780
aatttgaaac atggtggacc acataggagt cgattgaaga ggagattaag aaatcatggg 840
agtccttaaa tggatctatt tttgaaaaga ttgaaagact acagatcagt ctgtcaagat 900
gggcaagatc aataaagaat atatgaaagg ggttgacgaa caagctcaca aaagagttag 960
aaaatttaat ggagaaagaa agagatgatg atataatgac atagataatt gatacgagaa 1020
ttaatctgaa tatggagatt gataaatatg aaatgtattg ggaacaaaga gcacgggcca 1080
attggcttca gctaggggat aagaatacaa catttttcca caaatatgcc tcaatgcaga 1140
aatgaatcaa cacaataaac agactggaca cagataatgg aaagaaaatt tttgaggaac 1200
cagaaataaa tgagactgct acaaagtact tccagaatct attttcgtca atggagtagg 1260
gaatctatcc tatcttttaa caggcattaa caatagcatt tcttcagaca tcaacacaac 1320
cctattggca aaatatatgg cagaagagat ctttattaca gtaaaaggaa tggggcccac 1380
aaaaacacca cgctacgatg gctttccggc actatttttt caaaaatact ggcacattgt 1440
gggtaaagat attgaaacct tttgcttgaa agttttgaat gacagcaagg attttgaagc 1500
tttaaaccta actgagatag tacttattcc atagatctcc aaccccacaa atcttgttaa 1560
cttcagaccc attagtctat gcacagttat atacaaaatt gtagccaaaa ctattgctaa 1620
tcgtcttcag gaatttattg gaaggtgtat tgacaatgct caaagtgcgt tcgttctggg 1680
aaggctaata tccgacaatg tgttgatagc ttatgaaatt ctacatacac tacgccaaaa 1740
atgaacgagg aaaaaaggat tcatggcagt gaagctagac atgagtaaag cttacgatag 1800
agttaagtgg gcattcttga aggaagtgat acttcgtatg ggttttgcag aggaatgggt 1860
gtcactaatt ctgatatgta tttctacagt ctcttacgta gtaaccatca atgggaggag 1920
aggcaatgtt ttcaaaccta ctagaggact ctgacaaggt gacccactta gtccttttct 1980
ttttctgatt tgtagtgagg gactttcgtc cttactcagg atagcaacaa aagagggttt 2040
gataaaagga gttaaggcta gcagaagggg cttggcgatt tcacatttac tatttgtaga 2100
tgattgtatt ttgtttggcg aagctacaaa gagtagaata aagattttaa aagatatttt 2160
gagggaatat gagatttgct ctggtcaata cgtgaatttt aataaatcca tgattttctt 2220
tagctctaat acagtggaaa gggacaaaga agacatctcg actgaaatgg gaataagacg 2280
ctcgacaaat atggagaaat atctaggact ctctaatgtg gtaggaagga aaaagaagga 2340
atcttttcag aacctcaagg ataggattaa gcaggggatc aaaaattgga gtacacgatt 2400
tctatctcaa gggggaaaag aggttttcat aaaatcagta cttcaagcaa taccaactta 2460
tgctatgaca tgctttcttc taccaaaatc actatgtggg gagtttgaaa atatttttgc 2520
tagattttgg tggcaaaaag gtaaaggaaa gaaaggaatt cactggtgcc aatggaaagc 2580
tatgtgcagt tctaaagatg agggggtatg ggttttagga atatggctca attttaatat 2640
atcattatta gctaaacaag gatagaagat tattaataac cagaatgctc tcgttacgct 2700
agtatttaaa gccaaatatt tcccaaatga ccatttttta aattcccgtt tgggaaattc 2760
ttgctcttat gtgtggaaaa gtatttgtgc agctaaagct atattggcaa aaggactatg 2820
ctggagggtt ggtacgagta ctaatatatc cattaatgat gatgcttgga ttccagatgc 2880
aattaatttt agattatcaa caacgaccaa ttctatgcgt gattttaaag taaatgagtt 2940
aattgatagt aagaatagac tttggaagag ggagctgata aatagtacct tcacagaaga 3000
agatgctgca agaatccttc gaatcccctt ggcacgaaca cctcatgagg acttcctcat 3060
ttgaggaggt gaattgtcgg gtgaattcac ggtccgaagt gcctataaac tattacagag 3120
ttcggatgaa aatcttagag cttatgtttt acaaaccatc tacaaaaaat tctacaaaaa 3180
actttggagc ctgaatctac caacaaaaat aaagattaca atctggaggc tatcatggaa 3240
ttatttgcct acaaaggtga atatgcaata catgaagtta tcaatcaaca caagttgccc 3300
ccgatgtgga gaaagagctg aaacaatgga ccatttattt cgagaatgcc ctgttacagt 3360
ggaagtatgg acaacactat cacttcagaa tattat 3396
<210>3
<211>331
<212>DNA
<213>四倍体陆地棉（G. hirsutum）
<400>3
gtaatacccc tacccgtatt cgtcgccgaa atagagtatg aggcattacc agattttacc 60
gaataaatat tttagaaaaa actcaatata ccctttataa atatctaatc ttccctgcaa 120
attttaaacc gagaccaatc cgacacaacc aatccatttc aatatattct caagatagat 180
ttatcgtatt catgagataa tctcatcaca taccaaaacc aaaatttgtt agtcatacca 240
atggctaact atacattcat ttcccattaa catctacttt actagcttat acatgccatt 300
gatttccaaa ataaagtttc tttatatacc g 331
<210>4
<211>8090
<212>DNA
<213>二倍体亚洲棉（G. arboreum）
<400>4
caccttctat cagaaccttc gaccactcct gttcccctcc tacttggacc gcttttctac 60
atgctattgc ttcagctgca aaggcggacg ttaccccgtg gtggatctcg gagcaggaaa 120
gtaagacatc cccttcttcg tttctggcaa caatctctga ggcagattga tggtgattcg 180
catcatacgc atcatcaaaa tttattttga cgaactcacc aggcgggtaa ctctatccta 240
ctatcatctt cctttttgtt ggatttttta tttctaaccc atcaagttca gcaatatagt 300
tgtttatgaa gtctactact tgctaacctg tagtgttttt ctgttcgtgt attattctgt 360
ttctttctcc ccatatagta cacaatccac aacaaaagag acagctctgg tgtgaagaaa 420
gctggttaat gatgtaggta atccattgta gaaaatctgt ataaggctcc cgaataatat 480
tctgcatttt taatagtgtc taaacatcca ctatgacagg gcattcacga aagatatggt 540
cgatcgtttc agctctttct ccacataggg ggcagcttgt attgcttaca agctttcgat 600
gctgcatatt aacccatatc gaaaaataat tccatgagat tctccatatt gtaatcttga 660
ttttatttgg tagatttagg agccatagtt ttttgtagaa atttctgtag ccggtttgta 720
aaggtaagct ctagggattt catcaaaagt tagtaatagt ttatagaagt tgcggaccga 780
aaactctctt gaatgctcgc ctccccagac cagtagatca tcatgaggtg cgcttgctaa 840
aggtatttag aggatttttc cagcatcatc ctctaaaaag gtattgttta taaattctct 900
tctccatgtt ctttcattac tgtcgatcaa ttcactgacc ttggcatctt gcataaaatt 960
aacaactgga atccaagcat cagcatttat aaaaatattt ctgcctgtgc caaccctcca 1020
acacattttt tttccaagac acctttggct gcccatatgc ttttccatat ataaaagctg 1080
gtttttccca accgacactt taagaaatga tcattcagaa aatattttgc tttaaaaact 1140
tgcgtaacta aagaatcctg attagtaatg atcctccacc cttgcttagc aagtagagaa 1200
atattgaatt gtgccatatt tctaaatccc aatcccccca cttcttttga tcgacacatg 1260
aatttccatt gacatcagtg tatccctttc ctaccctatc ctttttgcca ccagaattta 1320
gcaaaaatat tttctaactc cccacataac gattttggta aaaggaaaca tgacatagca 1380
taagttggaa ttgcttgaag aactgatttt ataaatacct tctttccccc ttgtgaaagt 1440
aacctagtac tccagcttac aattctcagc ttaattttat ctttgagatt ctgaaaagct 1500
tccttctttc gccttcctac aacattagga agtcctagat atttttccat atttgtggag 1560
cttctcatac ctagcaaact cgatatttct tctttctctc gttctgttgt atttgagctg 1620
tagaaaattg ttaatttgtt gtagtttaca cattgacctg agcactgttc atattccttc 1680
aaaatatatt tgaaaatttt ctctctcgtt gtgtcgcctc accaaacagt atacagtcat 1740
ctgcaaaaag caagtgtgat gtttcaggtc ctcttctact agcccttact cccttcatcg 1800
atccctcatc tatggccatt cttattaaag acgagagtct ctcactacat attaaaaaaa 1860
taaaatggct gagcggatta ccctgatgaa gctctctagt aggcttaaaa acctttcctc 1920
ttctcccatt gatgttcact gtataagaga ctgtagatat gcatttcatg attaatgtta 1980
cccattctct agcaaatcct atttgaagca taacttcttt taaaaaaacc cactcaactc 2040
tatcgtaagc cttgctcata tctagcttaa ctgccattag cctttttttc tcattccgtc 2100
gttgacgtgg tgtatgcaag agttcatagg ctatgagcac attgttagta attaaccttc 2160
tgggaagaaa attactttga gtcttatcaa tacattttcc aatgactttt ttaagacgat 2220
ttgcaattac ttttgccaca attttgtata gaactgtgca taagctgata ggtctgaagt 2280
taacaaaact tgtggggttt ggtaattttg ggataagcac aatatctgta aggtttaaag 2340
agtcaaaatc tcgtccgtcg ttcagtatgc ccaaacaaaa tttttcaaca tctttaccta 2400
caatgtgcca gaatctttga aaaaataaag ctggaaatcc atcacaacca ggtgctttag 2460
tgggccctat ttctttcaaa gctgaaaata cctttgctgc tgtaaaaggt actagtaaat 2520
ctgtgttaat atcagatgag atattagaat gaataccttt tagaatatgt gatagattcc 2580
cagtaccgtt tgacgaaaat aaattctgga agtaatttga ggctgactca ttaattgctg 2640
attcatcaga aatttccctc ccatcatcag attccagcct agtaattgtg ttcgttcatc 2700
tacgagctgt ggcatatttg tggaaaaagc cagaattttt ttcacctaat taaagccaat 2760
tggcttacgc cctttgttcc cagtacatat catccttatc tatctccata ttaaaatgaa 2820
ttttagtatc aatcagtttt actattgtgt catcatctct gtcgcctgcc aaaagatctt 2880
caagttcctt tgtgagctta ctcttcaacc catctctacc cttttttatt gagcttaccc 2940
acctcctcaa tcttgtctgc agtttttcta gcctttgagc aatagttcca tttgatgact 3000
cctacgatgt tttaatctct ctttcaatag atttctccat ggtccaccat gcctcgaatt 3060
taaaacttgg tatcccttta tagctcctct cattgttatt attgattagt aagggacaat 3120
aatctgaaat taagtgtatt aaatgctgaa taactccttt tgggccagcc attttttatt 3180
cgccactccc ctatccaatc actctttaat attcgcttcc ggtagattcc ctcgctctca 3240
cgtaaaccaa acctccgaat atcccacatc tattagttga cattcttcta aaaccccgcg 3300
aaaagcttcc atttttctcg tccctcggtt gacctctgct ttttttgaac gaatacatta 3360
tttcgttaaa atcaccacat ccaactatgg gtgattctga tcctgaccca acttccttaa 3420
taagttccaa gaaacatcct tattggtagc ataaggtgat ccataaaacc ctgtaaacct 3480
ccactcttca ttgacattgt cctcttttac aatcacatca atatagcttt ttgagaaatt 3540
gtttaggcaa accgtaattt ctactttcca tgccatagaa attccacctc tagaacctgc 3600
tgctcctaca tcgattccat tctcaaaacc acatctcctc ctgatttttt ctatgcgctt 3660
tacatctatt tttgtctcca taagaaatac catttggggt ttatgttgct tcagcaaata 3720
ccgaagcttc tcactgcctg tggactcatc aatccacaac gttccaacaa atggctttca 3780
ttgtgtctgg tcggcttgcc cattggcagc tgtcgatcta tttttgttgg taaaacaatc 3840
atgcttgaga gtttctgctt gctgatttat acctttcacg atatgaaaat cttaatcatt 3900
atatttcatt ctttttgctt cctctttata gtatattctg tgacagccct aaattgaccc 3960
tagtcagaaa gtggtttcgg gaccactaaa ccgagtcata aaaataatta accgtcatag 4020
ttgatgctca ttatatgtac atatgcatgt gtgaaaactt catgtttgga ttttgttaat 4080
tgtaagtgaa ttttatcaaa taggacttat gtgagaaaat ttagaaatgt gctaggcaaa 4140
tgtaaggtgg cctataaatg catgttgtga aaatgatggg tttgcatgtc aatttaccca 4200
aaatttaaac atagtggccg gccatgctat gagtggaaac atgttgcaaa catgtttagt 4260
tagtgattat gttaaaaaga ataaaataat gaaaaaggaa tatgatgaaa acaaagaaaa 4320
gaaaaaaaaa agtgtccatc ctttcacatt ttttggcttg gccgaatgtt ctaagaagaa 4380
ggggcggggg agagcttgag aaaatcagcc atgggagttt gctagactaa ggtatgtttg 4440
atgttgtcca tgagattcat gcatgttttt agttgttagt ttgagttcta cctagcccat 4500
ggtttaaatc tttgctatga gatggggatg atattcggcc atgggtgttg tcttcttggt 4560
tgatgtttga tgtttgatgt tgtggtgatg aggcatgaag atgagttaag tttcggctaa 4620
ggtggatttg tgttgatgtc atttgcatgc taagtgtgaa gctttgtaat gatacatgtg 4680
tatggtgctt ttgatgttgt gaatggaagt agaggaaaag taaaagaaaa tttatgtaga 4740
aatgtgatat atgtggattt ataggatgtt acaaatatat gtgaagccat gctagattag 4800
gaaaaattca gtcaagtgtt catgagatga aattttgtgt ttaggtgaat taaagatgat 4860
agtatagttg atattatata tatatatata tatatgtatg catattcggc catcaaatta 4920
agagcatagg tgatgatgag tctaagcttt gtacattcgg ccatatatat atatatgcat 4980
gtgtgattgg attattgata gtagggcgat agcatatggt tattagccga atagctaaga 5040
gcataaggta gcaagataaa aattttacca tgccgttccg tatgtcataa aatcattaaa 5100
atgtgaatac caatatatgt agcaaagcgg ttgaatgagt taatttattt gtttaagctc 5160
aagatcctaa aggagaggcg tccaacaagg ggaaatcgaa ggtcatcgag tagccgactt 5220
ggaattattt tacccaacac aaggtaagtc attaagcata tagttggtat tgatttaaat 5280
gatcgtaata cctatgcaat tgtgtttaat aagatgaaat gtatacaaat gtatatgtat 5340
gtagagatga aattgtcaaa tgtaaaaagg aagtgaagcg tatatagtgg ctggttttcg 5400
gcactaagtg tgagggcaat aagtgttcac ggttgagaga atagcactaa gtgtgcgggc 5460
ttgaaataca tggcactaag tgtgcgagtt taaagtacat ggcactaagt gtgcgtggtt 5520
gattattaag cactatgtat gcgaacccac tatataaata tatatatata ttttctatca 5580
attatttata ttaagggtgc gaccttaccg aatcgatttc gaacagcgaa aagggtaagt 5640
accttgagtt catggctaat aggtgctatg tttatatatg gagttgagca tggtaagttt 5700
tgaacctatg tgatgattat aattgaagtc acgtacataa ggttcatcgt ggaataggtg 5760
aaagttcgct tagttgtatg attgtaacga aaataaaatg atgtatggaa atgcctcaat 5820
tatcctattg aatagcgtat gaaatgtcaa tgtaggactt ggaatgagat tgaatcgtaa 5880
ggtctaagaa actatggcat agttcggtat ggatggagta cttagcctca tttcgttgtt 5940
tcctcttgtg aaaattttat taatggatgg tagtgtaatg cttatgactt actgagttat 6000
atactcattc ggtgtttgct tgtcacccat tttaggtttc ttggactcga ctttttgcgt 6060
attcgggacc gtcatcgaag tcatcacacc ggctagcaac ttttggtatc ttctttttag 6120
ttggtctagg agaacatttc ggcatgtata ggctattatg tttgtttgaa ctttggtatg 6180
taaactttgg atagccatgc gaaaatggct tatatacgtt tttagcatag tactataatc 6240
gtttgtatgt tgatcactaa gaggtatgga aatgtttgga aacgattagc cattggaatg 6300
gttaatcatg attatacttt gtgctatgta tgcaaaaagg gctaattgaa tcatggaaac 6360
tatgaaatag gtaaagtcta ccttaaaggc agatgctgac agcagcagcg atgtggatgt 6420
gaaaaatcac taaaaatagt aggaatggaa ttaaatagtg aataaattat ataaatgaac 6480
cttgatgaat ctactttcat atggaagaaa cgaaatggtc atatgagttg tatgttaaga 6540
gatatttagg tcttcgtgaa acaggaccag aacagtttct ggattccctg ttccgacttt 6600
ggaaaacaaa cggaatcagt attgaagccc tgtacaggga gatatccaag tagtaatacg 6660
cgaaggtcag tgtagtcgat ccctgtaaca tgggagactt taactaataa actgtactaa 6720
ttggcccgac caaaaattct agaaaaaaat ttgtagatgg atatatgagt ctagtttcag 6780
ggaaaaatca cgaaactgat tttcgagttg tagaactcaa gatatgattt ttaaggtgac 6840
agtgacacag ttagccagct gtctggaaaa ttttttttat gaacggtgaa attaagtgaa 6900
cgaagtctgt taacccctcg tgtccgaccc cggcgacggt ctcgggtatg gggtgttaca 6960
tattccttta ttgtcatctt caatttttaa ctcctccgat tttcttttcc tcaaaatact 7020
ctcactgtta gccatgtctg tctctttagt tgcctcaatt ctcttccaac tcgatttctt 7080
tgctggtttt aaaagacttg cgcaattatt gtttacccca cattcgtttg cttccacatt 7140
agttatcctg gattttttgg cccatctcac ttctatccct ctcttgaaaa atttgctcag 7200
agattttctc tatagcacct gtatatgaac attgcatctg catcttcttt gaaatggcat 7260
taagctttaa actctctttt ccaacaaaat tgacttctgc ttttaatgct aaagaataag 7320
gaggatcatc tctaatttta tttttttcta caggtgtaaa cgtgaggcat tcattgagcc 7380
catgccccat ccttccaaag ccaaaataga aagttggtaa tttttaatat ttaaatggga 7440
tccagaactt actttgattt tctgttaaga tgaaaatacc cctgcgcaag ggttttttca 7500
catttaactg aactctaagt tgacagaaat caccattaat tgtcgatctc agaacgcctc 7560
caaaagtaat cccaatagca tgcattaaat ctttttttta tcaaattctg gtagacatgg 7620
gccaatctta atccaatatg gggatgaatt aagtcaaatt tgactcctct ctatcgattt 7680
agtcaaccga tcaaacagca ctaagttttt ttgaaacaac caaggctgcc cctccataat 7740
tgtctccaac tttcttcacc ttcaacacta tcaagaataa attctgctct gccaattgga 7800
tctcaaactt tttcctcgtc ttccatatac ttttcatctg tgccctaaaa ctatctggat 7860
tataggattt ttttttccat atagggcaaa gtagggttgg cttatcgctg ggtaccacca 7920
ttgagctttt aactgataac tgaatgagtt cttctgccag aaaggagacc tcctctcctg 7980
taaaaccctc tttgccacca ctttccttca tcccaagccg aagaaaaacc tgttctcgct 8040
aggatcctaa agaaaacact cttgactagg gtttttaagg ctgctcgaac 8090
<210>5
<211>2880
<212>DNA
<213>雷蒙徳氏棉（G. raimondii）
<400>5
tcccaaccaa tatggattgg cggctgccaa aaggaaaccc gaccggatgc aatgaaaatt 60
atatgttgga atgtttgtgg attagggagt ccacgggcag tacagaggtt tcagtatttg 120
ctgaagcaat acaaccccca aatggtcttt gttatggaga caaaaattaa tgagaagcgt 180
atggaaaagg tcaaaaagag atgtggtttt gtgaatgaaa ttgatgtcgg aatagaaggc 240
tctcgagatg ggctatgttt ggcatggaaa aggggaaatt atggttagtt taagaagttt 300
ctgaaaaagc catattgatg tgatgattaa gaaggacaat gtaaatgaag aatgaagatt 360
tacgaggttt tatggttcac cttatgtaag caacaagaat gtctcgtgga atttgttaag 420
gaaactaggt caagaacaaa attatccttg gttagtaagt ggtgatttta atgaaatcat 480
gtattccttt gaaaagagcg taggtatacc gagggaagag agaataatag aggcctttcg 540
tgaggtttta gaggaattct aattagtgga tgtagggtat acgatggtat ggtttacatg 600
gaagagaagg aatctaccga aaacaaacat caatgagaga cttgataggg gcgttgcgaa 660
tgaaaaatgg atgcatcttt ttccaaagag aaatattcaa cacttaacac atttgatatc 720
agatcactgc tccctccttc ttaatacaaa taatgaaaaa aatttgtaag gggaccccaa 780
gttttaaatt tgaggcatgg tggaccatgg aggagtctat tgaacaagaa attaaggaat 840
cttgggagtc atcaactagt ccgcttacta aaaaacttga aaggttgcag atcagattga 900
agagataggc aagcacaatt aagaaaggtc gagacagttt aaagcgaaag ctcacaaagg 960
aacttgaaaa tctaatgccg aaggagaggg atgaagatat gatggcaaag ctaattaatg 1020
ccaaattttg acttaatatg gagattaata aagatgaaag gtattgggaa caaagggcac 1080
gggccaattg gcttcaatta agggataata attctgcctt ttttcatatg ccctagttcg 1140
tagacgaaca aacacaataa ctaggctaga atcaaatgaa tgaggcgaaa tctctgacga 1200
atcaaagatt aatgaggctg ctgttatatt ttttcagaag ttattttcat ctaatagaat 1260
tgggaattta tcccacctac taatgggcat tgacattagt atctcatctg atatcaataa 1320
aactttatta tcataatata cgacagaaga ggttcattcg gctttgaaag gaatggggac 1380
tactaaagca ccaggctctg acggtttttc gacattattt tttcagatat tctggcacat 1440
tgtaggtaaa gatgttgaaa ctttctgttt gagaattttg aagatggtaa ggattttgac 1500
tctttaaatt tgatggatat tatgcttatt ccaaaaatcc caaaccccac aagtcttgtt 1560
aattttagac ctattagttt atgcacagtt atttacaaaa ttgtggcaaa aacaatagca 1620
aatcgccttc aagaaatcat taagagatgt attgatagtg cccaaagtgc ttccatcatt 1680
ggaagattaa tctttggtaa tgtgctatta gcctatgaaa ttttacacac ttttcgccaa 1740
aagcgtacca aaaaaaaagg atatatggca gtgaagttag atatgagcaa agcttacgat 1800
agagttgaat ggggttttct aaatgaagta atactccgaa tgggctttgc aagggaatgg 1860
gtggcactaa ttatgaaatg tatctccata gtttcttatg cagtaaacat taatgggaga 1920
agacgaaaca ttttcaaacc tactagaggg ctctgacaac gtgatccact cagccctttc 1980
ctttttctga tatgcagtga gggactttca tctttgatga gactggcaat aagagagtgc 2040
ttgttaaaaa gagcaaaagc tagcagaagg ggaccagaga tatcacactt actttttgcg 2100
gatgattgta ttttgtttgg tgaaccaaaa aagagaggag cgttgatatt gaaagaaatt 2160
ttgaaggaat acgaacgatg ctcaggccaa tgcgtgaatt ttaacaaatc aatgatcttc 2220
tatagctcaa acacaacaga gggggaaaaa aagaagaaat ctcaacttta ttaggtgtga 2280
gaagctcaat aaatctggaa aaatatttaa gactgcctaa tatggtcggt agacataaga 2340
aagaatcctt tcaaaatctc aaggatatga tttacttgca aattgaagga tggagtacaa 2400
gattactatc acaatggggc aagaaggtct tcataaaatc tgtgcttcag gcaataccaa 2460
cttatgctat gtcatgcttt cttttactga aatcttaatg tggggaatta gaaaacattt 2520
ttgctaagtt ttggtggcaa aaaggatatg ggaaaaaaaa taatacattg gtgccagtag 2580
aaacatatgt gttgttcaaa agatgaagag ggaatgggtt tcataagtat gacttagttt 2640
aatatttccc tactagcgaa gcaagggtga aggattataa ataactagaa ctctcttatt 2700
gcgtgagtgc tcaaagcaaa gtattttttg aatgatgatc ttttaaattc gcgattggga 2760
aatacaagtt cttatatatg gagaaatatc taggcgacga aggctatttt gccgaaagga 2820
ctttgttgga gggtgggtac gagtacgaat gtttcaatta ataatgatgc ttggattcca 2880
<210>6
<211>331
<212>DNA
<213>雷蒙徳氏棉（G. raimondii）
<400>6
tgtaatactc cctacccgta ttcgtcgccg aaatagagta tgaggcatta ccagatttta 60
ccgtataatt ttttttaaat tcaatataac ccctttataa atatctaatc ttccctgcaa 120
attttaaacc gagaccaatc cgacacaacc aatccattgc aatatatttt caagatagat 180
ttatcgtatt cataagataa tctcatcaca taccaaaacc aaaatttgtt agccatacca 240
atggctaact atacattcat ttcacattaa catctacttt attagcttat acatgccatt 300
gatttccaaa ataaagtttc tttatatacc g 331
<210>7
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>7
gaaaactctc ttgaatgctc g 21
<210>8
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>8
caggattctt tagttacgca ag 22