本发明属于DNA的提取方法，具体涉及一种基于反复冻融方式的基因组DNA提取方法。技术背景随着分子生物学技术的发展，DNA的成功提取已经成为相关科学研究的基础及关键。提取基因组DNA通常应用于构建基因组文库、全基因组测序、Southern杂交、RFLP及PCR扩增等。快速提取高质量基因组的DNA将会为物种亲缘关系研究、基因组比较、遗传多样性和某些特定基因的标记等后续的分子生物学研究提供参考。尤其在进行群体遗传学研究中需要的研究样本量大，除了对DNA的质量和数量有要求外，还需要方法简便易行。一般分子生物学实验指导书上的常规方法，由于不同种类或同一种类的不同组织因其细胞结构及所含成分的不同，需要分别对不同的物种采用不同的方法进行DNA提取，如细菌基因组DNA的提取需采用CTAB法、线虫基因组DNA的提取大多采用研磨法等；市面上现有的DNA提取试剂盒，也往往只针对单一物种。如针对革兰氏阳性细菌或革兰氏阴性细菌的DNA提取试剂盒等，鲜有报道采用一种方法对不同物种进行DNA的提取。常规的基因组DNA提取方法步骤繁琐、耗时长。一般需要耗时3～5个小时。且DNA纯度不高，在DNA提取的过程中或多或少的都遇到了蛋白质、糖类、酚类及RNA等物质的污染。特别是糖类和酚类物质影响对核酸内切酶具有很强的抑制作用，对Southern杂交产生较大的影响；其对普通的PCR扩增也具有较大的影响，糖类物质的存在会影响DNA的解链及Taq酶的活性。当遇到含糖量较高或酚类含量较高的物种时，常规的方法很难能满足全基因组测序高纯度、大片段的要求。所以如何简单、快速、高效的去除这些物质的污染，对提纯基因组DNA来说至关重要。技术实现要素：发明目的：针对上述现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种基于反复冻融方式的基因组DNA提取方法，可打破不同物种之间的DNA提取，步骤简单、提取过程耗时短，可获得高纯度基因组DNA(几乎不含蛋白质、糖类、酚类及RNA等物质)而且DNA的含量满足全基因组测序文库构建、Southern杂交、RFLP及普通PCR扩增等一般分子生物学实验操作的要求。技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：一种基于反复冻融方式的基因组DNA提取方法，步骤如下：(1)收集待提取DNA的组织细胞于离心管中，加入提取缓冲液，充分混匀，反复冻融2次；(2)向步骤(1)得到的混合溶液中加入RNase充分混匀，孵育；(3)向步骤(2)得到的混合溶液中加入NaCl和SDS充分混匀后，再次冻融；(4)向步骤(3)得到的混合溶液加入等体积苯酚-氯仿-异戊醇的混合溶液，抽提，离心取上清；(5)向步骤(4)得到的上清溶液中加入等体积的氯仿-异戊醇，抽提，离心取上清；(6)向步骤(5)得到的混合溶液加入冷乙醇和醋酸钠水溶液，离心，沉淀；(7)向步骤(6)得到的沉淀中加入酒精洗涤后室温干燥，加ddH2O或TE缓冲液溶解DNA。步骤(1)中，所述的提取缓冲液按如下方法配置得到：将NaCl4g、CTAB10g、聚乙烯吡咯烷酮2g、1mol/LpH8.0的Tris-HCl缓冲液10mL、1mol/LpH8.0的EDTA2mL溶于ddH2O中，定容到100mL。步骤(1)中，组织细胞包括细菌和真菌。步骤(1)中，每4～6mL组织细胞菌液，加入提取缓冲液400μL。步骤(2)中，每4～6mL组织细胞菌液，加入5μL10mg/mLRNase充分混匀，37℃孵育10min。步骤(3)中，每4～6mL组织细胞菌液，加入50μL5MNaCl和100μL10％SDS。步骤(4)中，向步骤(3)得到的混合溶液加入等体积的体积比为25∶24∶1的苯酚-氯仿-异戊醇的混合溶液，抽提，12000rpm，离心10min，取上清。步骤(5)中，向步骤(4)得到的上清溶液中加入等体积的体积比为24∶1的氯仿-异戊醇，抽提，12000rpm，离心10min，取上清；重复两次，其中第二次离心5min。步骤(6)中，向步骤(5)得到的混合溶液加入2倍体积的冷乙醇和0.1倍体积的3mol/L醋酸钠水溶液，离心，沉淀。步骤(7)中，向步骤(6)得到的沉淀中加入70％的乙醇洗涤后室温干燥，加ddH2O或TE缓冲液溶解DNA。有益效果：与现有技术相比，本发明的基于反复冻融方式的基因组DNA提取方法，具有以下优势：1)本发明方法适用于细菌(革兰氏阳性、阴性细菌)、真菌、线虫等多种物种的基因组DNA提取，具有一定的广泛性。2)使用本发明方法提取的基因组DNA相较于传统的CTAB法、试剂盒法浓度高，有利于进行后续的分子生物学实验。3)使用本发明方法提取的基因组DNA纯度较高，完整性较好，满足SouthernBlot、全基因组测序的需求。4)本发明方法同样适于提取含糖量高的物种的基因组DNA。5)使用本发明方法提取基因组DNA所用时间较短，节省时间。6)本发明方法不添加溶菌酶、蛋白酶K等生物试剂，避免了DNA低温保存的问题，且为相关的分子生物学实验节省一定的成本。7)本发明步骤简单、易操作，可实现高质量基因组DNA提取。附图说明图1是实施例1提取的DNA的1％琼脂糖凝胶电泳图；图2是实施例2提取的DNA的1％琼脂糖凝胶电泳图；图3是实施例3提取的DNA的1％琼脂糖凝胶电泳图；图4是实施例4提取的DNA的1％琼脂糖凝胶电泳图；图5是实施例5DNA扩增后的1％琼脂糖凝胶电泳图；具体实施方式下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。以下实施例中，所使用的提取缓冲液，按如下方法配置得到：将NaCl4g、CTAB10g、聚乙烯吡咯烷酮2g、1mol/LpH8.0的Tris-HCl缓冲液10mL、1mol/LpH8.0的EDTA2mL溶于ddH2O中，定容到100mL。实施例1革兰氏阳性、阴性细菌的基因组DNA提取(见图1)1、革兰氏阴性细菌(吡咯伯克霍尔德氏菌JK-SH007，BurkholderiapyrrociniaJK-SH007)基因组DNA提取，步骤如下：(1)3～6mL吡咯伯克霍尔德氏菌JK-SH007过夜培养，10000rpm离心2min，弃上清；(2)向步骤(1)得到的细胞中加入提取缓冲液400μL，充分混匀，反复冻融2次(本实施例的冻为液氮速冻，融为常温融化，也可采用冰箱冷冻以及在常温到60℃以下融化)；(3)向步骤(2)得到的混合溶液加入5μL10mg/mLRNase充分混匀，37℃孵育10min；(4)向步骤(3)得到的混合溶液加入50μL5MNaCl和100μL10％SDS充分混匀后，再次冻融；(5)向步骤(4)得到的混合溶液加入等体积苯酚-氯仿-异戊醇(25∶24∶1)的混合溶液，抽提，离心，取上清；重复两次；(6)向步骤(5)得到的上清溶液中加入等体积的氯仿-异戊醇(24∶1)，抽提，离心，取上清；(7)向步骤(6)得到的混合溶液加入2倍体积的冷乙醇和0.1倍体积的醋酸钠(3mol/L)水溶液，离心，沉淀；(8)向步骤(7)得到的沉淀中加入70％的乙醇洗涤后室温干燥，加ddH2O或TE缓冲液溶解DNA。2、革兰氏阳性细菌(短小芽胞杆菌BacilluspumilusHRl0)基因组DNA提取，步骤如下：(1)3～6mL短小芽胞杆菌BacilluspumilusHR10过夜培养，10000rpm离心2min，弃上清；(2)向步骤(1)得到的细胞中加入提取缓冲液400μL，充分混匀，反复冻融2次；(3)向步骤(2)得到的混合溶液加入5μL10mg/mLRNase充分混匀，37℃孵育10min；(4)向步骤(3)得到的混合溶液加入50μL5MNaCl和100μL10％SDS充分混匀后，再次冻融；(5)向步骤(4)得到的混合溶液加入等体积苯酚-氯仿-异戊醇(25∶24∶1)的混合溶液，抽提，离心，取上清；重复两次；(6)向步骤(5)得到的上清溶液中加入等体积的氯仿-异戊醇(24∶1)，抽提，离心，取上清；(7)向步骤(6)得到的混合溶液加入2倍体积的冷乙醇和0.1倍体积的醋酸钠(3mol/L)水溶液，离心，沉淀；(8)向步骤(7)得到的沉淀中加入70％的乙醇洗涤后室温干燥，加ddH2O或TE缓冲液溶解DNA。结果如图1所示，图中，泳道1：吡咯伯克霍尔德氏菌JK-SH007基因组DNA提取结果；泳道2：短小芽胞杆菌BacilluspumilusHR10基因组DNA提取结果，条带单一明亮，说明本发明具有一定的广泛性，能够同时满足革兰氏阴性细菌与革兰氏阳性细菌的基因组DNA的提取。实施例2细菌(吡咯伯克霍尔德氏菌JK-SH007)、真菌(灰葡萄孢Botrytiscinerea)和线虫(松材线虫Bursaphelenchuhxylophilus)的基因组DNA提取，步骤如下：(1)分别收集3～6mL过夜培养的吡咯伯克霍尔德氏菌JK-SH007菌体、1-2培养皿生长旺盛的灰葡萄孢(Botrytiscinerea)、约10000条松材线虫于1.5mL离心管；(2)向步骤(1)得到的细胞中加入提取缓冲液400μL，充分混匀，反复冻融2次；(3)向步骤(2)得到的混合溶液加入5μL10mg/mLRNase充分混匀，37℃孵育10min；(4)向步骤(3)得到的混合溶液加入50μL5MNaCl和100μL10％SDS充分混匀后，再次冻融；(5)向步骤(4)得到的混合溶液加入等体积苯酚-氯仿-异戊醇(25∶24∶1)的混合溶液，抽提，离心，取上清；重复两次；(6)向步骤(5)得到的上清溶液中加入等体积的氯仿-异戊醇(24∶1)，抽提，离心，取上清；(7)向步骤(6)得到的混合溶液加入2倍体积的冷乙醇和0.1倍体积的醋酸钠(3mol/L)水溶液，离心，沉淀；(8)向步骤(7)得到的沉淀中加入70％的乙醇洗涤后室温干燥，加ddH2O或TE缓冲液溶解DNA；(9)对上述提取的DNA进行浓度及电泳检测。表1DNA提取浓度、纯度备注：1：松材线虫；2：灰葡萄孢；3：吡咯伯克霍尔德氏菌JK-SH007结果如图2和表1所示，图中，泳道1：松材线虫基因组DNA提取结果，泳道2：灰葡萄孢基因组DNA提取结果，泳道3：吡咯伯克霍尔德氏菌JK-SH007基因组DNA提取结果，本发明能够同时满足细菌、真菌与线虫的基因组DNA的提取，说明本发明具有一定的广泛性。实施例3采用实施例1的方法与CTAB+SDS法提取含糖量高的细菌基因组DNA进行比较。1、使用本申请的方法提取组织细胞的基因组DNA，步骤如下：(1)3～6mL组织细胞过夜培养，10000rpm离心2min，弃上清；(2)向步骤(1)得到的细胞中加入提取缓冲液400μL，充分混匀，反复冻融2次；(3)向步骤(2)得到的混合溶液加入5μL10mg/mLRNase充分混匀，37℃孵育10min；(4)向步骤(3)得到的混合溶液加入50μL5MNaCl和100μL10％SDS充分混匀后，再次冻融；(5)向步骤(4)得到的混合溶液加入等体积苯酚-氯仿-异戊醇(25∶24∶1)的混合溶液，抽提，离心，取上清；(重复两次)(6)向步骤(5)得到的上清溶液中加入等体积的氯仿-异戊醇(24∶1)，抽提，离心，取上清；(7)向步骤(6)得到的混合溶液加入2倍体积的冷乙醇和0.1倍体积的醋酸钠(3mol/L)水溶液，离心，沉淀；(8)向步骤(7)得到的沉淀中加入70％的乙醇洗涤后室温干燥，加ddH2O或TE缓冲液溶解DNA。2、使用CTAB+SDS法提取相同组织细胞的基因组DNA，方法同[穰杰，李莉，唐琼，等.第三代测序细菌基因组DNA提取方法的比较[J].湖南师范大学自然科学学报，2015，38(6)：14-20.]。以吡咯伯克霍尔德氏菌JK-SH007为例，结果如图3所示，图中，泳道1：使用本发明方法对吡咯伯克霍尔德氏菌JK-SH007基因组DNA的提取结果；泳道2：使用CTAB-SDS法对吡咯伯克霍尔德氏菌JK-SH007基因组DNA的提取结果，说明本发明方法提取的基因组DNA相较于传统的CTAB法纯度高，无蛋白质、糖类等物质的污染，完全满足Southernblot、全基因组测序的要求。有利于进行后续的分子生物学实验；本发明方法适于提取含糖量高的物种的基因组DNA。表2本发明与传统CTAB方法提取的基因组DNA浓度比较1DNA浓度21DNA浓度31DNA浓度41DNA浓度CTAB法349.08ng/μL433.93ng/μL221.90ng/μL279.81ng/μL本发明方法1085.30ng/μL808.37ng/μL709.43ng/μL687.39ng/μL备注：1：吡咯伯克霍尔德氏菌JK-SH007；2：短小芽胞杆菌BacilluspumilusHRl0；3：灰葡萄孢；4：松材线虫。以吡咯伯克霍尔德氏菌JK-SH007、短小芽胞杆菌BacilluspumilusHRl0、灰葡萄孢和松材线虫为例，进行比较，结果如表2所示，说明本发明方法提取的基因组DNA相较于传统的CTAB法、研磨法浓度更高，有利于进行后续的分子生物学实验表3本发明方法与传统CTAB方法提取基因组DNA的操作时间比较方法本发明方法CTAB+SDS法SDS法[1]试剂盒法[1]时间1.5-2h4.5-5h4-5h2-3h注：CTAB+SDS法、SDS法、试剂盒法，均同[穰杰，李莉，唐琼，等.第三代测序细菌基因组DNA提取方法的比较[J].湖南师范大学自然科学学报，2015，38(6)：14-20.]。以吡咯伯克霍尔德氏菌JK-SH007为例，进行比较时间，结果如表3所示，说明本发明在保证DNA的质量为前提的情况下，步骤简便，更加节省时间。实施例4以灰葡萄孢Botrytiscinerea为例，本申请的方法与液氮研磨+CTAB抽提法提取的基因组DNA完整性比较。1、使用本申请的方法提取灰葡萄孢Botrytiscinerea基因组DNA，步骤如下：(1)收集1-2培养皿生长旺盛的灰葡萄孢(Botrytiscinerea)于1.5mL离心管；(2)向步骤(1)得到的细胞中加入提取缓冲液400μL，充分混匀，反复冻融2次；(3)向步骤(2)得到的混合溶液加入5μL10mg/mLRNase充分混匀，37℃孵育10min；(4)向步骤(3)得到的混合溶液加入50μL5MNaCl和100μL10％SDS充分混匀后，再次冻融；(5)向步骤(4)得到的混合溶液加入等体积苯酚-氯仿-异戊醇(25∶24∶1)的混合溶液，抽提，离心，取上清；(重复两次)(6)向步骤(5)得到的上清溶液中加入等体积的氯仿-异戊醇(24∶1)，抽提，离心，取上清；(7)向步骤(6)得到的混合溶液加入2倍体积的冷乙醇和0.1倍体积的醋酸钠(3mol/L)水溶液，离心，沉淀；(8)向步骤(7)得到的沉淀中加入70％的乙醇洗涤后室温干燥，加ddH2O或TE缓冲液溶解DNA。2、使用液氮研磨+CTAB抽提法提取灰葡萄孢Botrytiscinerea基因组DNA，具体步骤同[宋琳玲.农业废物堆肥中微生物总DNA提取方法的研究及其应用[D].长沙.湖南大学，2008.]。结果如图4所示，图中，泳道1：使用本发明方法对灰葡萄孢基因组DNA的提取结果；泳道2：使用液氮研磨+CTAB抽提法对灰葡萄孢基因组DNA的提取结果，本发明方法提取的基因组DNA，完整性较好，满足SouthernBlot、全基因组测序的需求。实施例5对实施例2提取的灰葡萄孢Botrytiscinerea和松材线虫Bursaphelenchuhxylophilus基因组DNA进行ITS-rDNA的PCR扩增及产物检测选择扩增ITS序列的通用引物(ITS4/ITS7)对2种基因组DNA进行扩增。扩增体系为2×EasyTaqPCRSuperMix10μL、10μM引物各1μL、模板1μL、ddH2O补足20μL；PCR反应条件：94℃变性5min再以94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1.0min，33次循环，72℃延伸10min。PCR产物于1％琼脂糖凝胶中电泳，Gelred染色紫外灯下拍照。电泳结果如图5所示已经成功扩增出灰葡萄孢和松材线虫的ITS的目的条带分别为泳道1和2。条带大小约为500bp-600bp左右，条带单一、明亮。说明采用实施例2中提取的DNA可以满足PCR样品要求。对实施例2中提取的吡咯伯克霍尔德氏菌JK-SH007基因组DNA进行16srDNA的PCR扩增及产物检测。选择扩增细菌16SrDNA的通用引物(27F/1492R)对基因组DNA进行扩增。扩增体系为为20μL体系：2×EasyTaqPCRSuperMix10μL、10μM引物各1μL、模板1μL、ddH2O补足20μL。PCR反应条件：94℃变性5min再以94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1.5min，33次循环，72℃延伸10min。PCR产物于1％琼脂糖凝胶中电泳，Gelred染色紫外灯下拍照。电泳结果如图5，泳道3所示已经成功扩增出细菌的16SrDNA的目的条带1500bp。说明采用实施例2中提取的DNA可以满足PCR样品要求。当前第1页1 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