本发明涉及生物制药领域，具体涉及为一种提高胰岛素及其类似物前体表达的毕赤酵母发酵方法。
背景技术：
糖尿病是一种常见的内分泌代谢疾病。近年来，全世界糖尿病的患病率都在迅猛增长。2015年，全球成年糖尿病患者数量达4.15亿，其中，中国的糖尿病患者人数超过了1亿。糖尿病成为继心脑血管疾病、肿瘤之后的另一个严重危害人民健康的重要慢性非传染性疾病。糖尿病的急、慢性并发症，尤其是慢性病并发症累及多个器官，致残、致死率高，严重影响患者的身心健康，并给个人、家庭和社会带来沉重的负担。
胰岛素治疗一直被当作是治疗糖尿病并使血糖得到良好控制的重要手段。上世纪70年代，人们通过基因工程技术开发出了重组人胰岛素。到90年代，随着胰岛素技术的不断发展，人们又相继开发出了具有不同作用时间特点的新一代胰岛素类似物，例如赖脯胰岛素、门冬胰岛素、赖谷胰岛素、地特胰岛素、德谷胰岛素、甘精胰岛素等。
在外源蛋白的表达过程中，毕赤酵母的胞内和胞外均有一定量的蛋白酶的表达，因此大多数外源蛋白均面临着被降解的问题。尤其是发酵培养后期，由于营养成分的缺失及有毒副产物的累积，大量细胞活性降低或裂解，从而释放出更多的蛋白酶。蛋白酶的存在不仅影响到目标蛋白的质量，同时也降低目标蛋白的产率。因此，为保证目标产物的质量及产量，行业内通常会提前终止培养。
毕赤酵母发酵过程中通常使用氨水来控制ph，该方法的优势在于ph控制的较为稳定。然而，由于氨水具有强烈的腐蚀性和刺激性且易爆，在使用和储存过程中存在较大的风险。另外，由于氨水不能灭菌，只能通过过滤器进行除菌，增加了过滤器及其验证的成本。
毕赤酵母发酵过程上的菌体浓度测定通常采用湿重法(wcw)或吸光度法(od600)，这两种测量方法均有较大误差，且培养基中的颗粒和死细胞均能被检测到，因此所测得的值不能反映真正活细胞的量。同时，这两种方法操作较为麻烦且涉及到取样操作，增加了染菌风险。另外，使用该方法通常几个小时测量一次，不能反映菌体的实时状态，很多关键阶段和异常情况可能会被漏掉。
毕赤酵母发酵过程中的碳源(甘油、甲醇等)的补加方式通常采用恒速补加、递增减或者恒定比生长速率，这几种方法均不能根据毕赤酵母的实时生长特性来进行碳源的补加。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种提高胰岛素及其类似物前体表达的毕赤酵母发酵方法。
本发明技术方案为：
一种提高胰岛素及其类似物前体表达的毕赤酵母发酵方法，所述发酵方法包括如下步骤：
1)起始生长阶段：将毕赤酵母菌株接种于发酵起始培养基中，接种浓度为2.0-6.0×105cfu/ml，温度控制在28-32℃，空气通入比为1.0-1.5vvm，随着菌体浓度逐渐增加，起始培养基中的碳源逐渐被消耗，溶氧值也逐渐下降，通过搅拌控制溶氧值≥50％；至发酵起始培养基碳源被消耗尽后，溶氧值开始反弹，反弹至80％时该阶段结束；
2)甘油补加阶段：所述步骤1)溶氧值反弹至80％时开始补加甘油溶液，设定甘油起始补加速率f0＝8-12g/l(毕赤酵母菌液)/h，然后基于微生物生长动力学模型实时调整甘油补加速率，使菌体活细胞呈指数生长，从而获得大量的有较高活性的菌体，控制温度为28-32℃，空气通入比为1.0-1.5vvm，溶氧值≥30％，ph4.0-6.0；当实时活细胞浓度(即活细胞电容率)x＝17-19pf/cm时，停止补加甘油；
3)甲醇诱导阶段：停止补加甘油30-50min后，开始补加甲醇溶液进行诱导，设定起始甲醇补加速率f0＝3-7g/l/h，然后基于微生物生长动力学模型实时调整甲醇补加速率，使得毕赤酵母发酵产生的目标蛋白(胰岛素及其类似物)的增加量基本能够维持在每小时增加0.04g/l的速度，控制温度为25-28℃，空气通入比为1.5-2.5vvm，溶氧值≤10％，ph4.0-6.0；
4)发酵培养到80-100h时，以与甲醇相同补加速率连续补加有机氮源，发酵培养130-180h结束。
优选地，所述菌体生长动力学模型为ft+△t＝(1+μt)ft，
其中：ft表示t时的碳源补加速率，μt表示t时的比生长速率，ft+△t表示t+△t时的碳源补加速率。
优选地，所述发酵起始培养基组成为：
甘油20-40g/l，尿素5-8g/l，caso4·2h2o0.4-1.0g/l，mgso45-8g/l，koh20-30g/l，h3po420-30ml/l，ptm1溶液2-6ml/l，消泡剂1-3ml/l。
进一步优选地，所述ptm1溶液为cuso4·5h2o6g/l，ki0.08g/l，mnso4·h2o3g/l，na2moo4·2h2o0.2g/l，h3bo30.02g/l，znso4·7h2o20g/l，feso4·7h2o65g/l，cocl2·6h2o0.5g/l，h2so45ml/l，biotin0.2g/l。
优选地，所述步骤2)、步骤3)过程中采用50％(w/v)尿素溶液控制ph。
优选地，所述步骤2)甘油溶液的组成是将8-14mlptm1溶液添加到1l甘油溶液(50％，w/v)中配制而成。
优选地，所述步骤3)甲醇溶液组成是将8-14mlptm1溶液添加到1l甲醇中配制而成。
优选地，所述步骤4)有机氮源为50％(w/v)的酵母提取物或大豆蛋白胨。
优选地，所述步骤4)补加有机氮源的方法还可以采用放掉20％-60％的发酵液，快速补加同等体积的补料培养基的方法。
进一步优选地，所述补料培养基组成为：caso40.1-0.5g/l，mgso45-10g/l，koh5-10g/l，h3po410-20g/l，有机氮源5-10g/l。
本发明有益效果：
1、发酵起始培养基：毕赤酵母发酵通常采用bmgy/bsm培养基。bmgy培养基含有较高比例的酵母提取物和蛋白胨，其单位体积的成本过高，并且动物来源的蛋白胨存在着外源病毒污染的风险。另外，在d/c级洁净生产环境中配制培养基时，大量的有机物质粉末会对洁净环境造成很大的影响。bsm培养基不存在上述影响，但含有氨水。本发明优化的起始培养基不含有机氮源，且用尿素代替了氨水，不存在上述问题。
2、发酵过程中的ph控制：本发明发酵过程中的ph控制用尿素代替氨水，解决了刺激性及防爆的问题。同时，尿素可以在线蒸汽灭菌，替代了氨水的过滤除菌方法，使得成本大大降低。另外，尿素代替氨水，氮源的利用率增加，提高了胰岛素及其类似物前体的表达量。
3、在发酵的中后期，本发明通过连续或半连续补加少量微生物或植物来源的有机氮源来延长发酵周期，在保证目标产物质量的同时，提高了其产量。原因在于：一方面提供为菌体生长和蛋白表达提供丰富的营养元素；另一方面，由于有机氮源中含有大量的多肽或蛋白质，竞争性结合发酵液中的蛋白酶，从而减少了目标蛋白降解。另外，所涉及到的有机氮源是微生物来源或植物来源的，对于胰岛素等生物制品，无病毒携带风险。
4、发酵培养过程中根据活细胞在线检测数据拟合菌体生长动力学模型，并根据此模型自动设定碳源(前期甘油，后期甲醇)补加速率。
1)该方法采用在线活细胞检测法替代了湿重法和吸光度法来测量菌体浓度。首先，该方法检测到的只有活细胞，培养基中的颗粒及死细胞检测不到，因此通过该方法可以了解到菌体的真实状态；其次，该方法可以在线检测菌体活细胞浓度，避免了取样及样品处理过程；最后，该方法可实时了解菌体的生长状态，从而可实时调控发酵过程。
2)该方法通过采集到的活细胞浓度实时数据(x)，计算出实时比生长速率(μt)，然后根据模型ft+△t＝(1+μt)ft得出实时碳源补加速率(ft+△t)。这种补料方法可根据菌体的生长特征实时调整碳源补加速率，从而根据需求进行发酵调控：诱导前，可获得大量的活性高的菌体；诱导后，可获得大量的、质量稳定的目标蛋白。另外，该方法可实现从小试直接到生产的顺利放大。
模型来源：根据微生物生长动力学μx＝dx/dt，可得μ＝dx/dt/x。对于本发明，x表示t时的电容率(单位是pf/cm，可间接表示活细胞量)。根据底物消耗方程，△s＝m1x+m2μx+m3△p，其中，m1、m2和m3是比例系数。由于本发明所涉及的毕赤酵母发酵方式为高密度发酵，相对菌体浓度x，菌体增长量μx和目标蛋白增长量△p的值均较小可以忽略不计，因此，△s＝m1x。折算到单位时间内，则该方程为ft＝m1xt，其中，ft是t时的碳源补加速率。那么ft+△t＝m1xt+△t，ft+△t/ft＝m1xt+△t/m1xt＝xt+△t/xt＝1+μt，即ft+△t＝(1+μt)ft，其中，μt是t时的比生长速率。设定起始补加速率f0，通过活细胞浓度x计算出μt，那么就可以计算出△t后的补加速率ft+△t。
综述，本发明有益效果为：
(1)在保证目标产物质量的同时，产量提高30％以上。对于同一表达体系而言，本发明所达到的产量在国内外属于较高水平。
(2)本发明涉及的产品包括重组人胰岛素、甘精胰岛素和门冬胰岛素。三种不同的产品可以共用一套工艺，从而提高了工厂生产操作简便性。
(3)发酵后期补充有机氮源克服了生产规模由于设备局限原因造成的对培养不利的因素(如搅拌速率低、控温难等)。同时，由于有机氮源中含有大量的多肽或蛋白质，竞争性结合发酵液中的蛋白酶，从而减少了目标蛋白降解。另外，补充有机氮源显著改善发酵后期do水平并延长了发酵周期，提高了前体的表达量。
(4)本发明所涉及到的有机氮源是微生物来源或植物来源的，对于胰岛素等生物制品，无病毒携带风险。
(5)相对于产品附加值，本发明所涉及到的有机氮源的成本很低。
具体实施方式
下面结合实施例来进一步说明本发明，但本发明要求保护的范围并不局限于实施例表述的范围。
实施例1
一种提高重组人胰岛素前体表达的毕赤酵母发酵方法，所述发酵方法包括如下步骤：
1)起始生长阶段：接种浓度为2.0×105cfu/ml，温度控制在32℃，空气通入比为1.5vvm，通过搅拌控制溶氧值≥50％；
2)甘油补加阶段：溶氧值反弹至80％时开始补加甘油溶液，设定甘油起始补加速率f0＝12g/l/h，然后基于微生物生长动力学模型实时调整甘油补加速率，使菌体活细胞呈指数(x＝1.25*1.1t，x表示活细胞浓度，即活细胞电容率，t表示时间)生长，从而获得大量的有较高活性的菌体，控制温度为32℃，空气通入比为1.0vvm，溶氧值≥30％，ph5.0；当实时活细胞浓度(即活细胞电容率)x＝17pf/cm时，停止补加甘油；
3)甲醇诱导阶段：停止补加甘油50min后，开始补加甲醇溶液进行诱导，设定起始甲醇补加速率f0＝7g/l/h，然后基于微生物生长动力学模型实时调整甲醇补加速率，使得目标蛋白的增加量基本能够维持在每小时增加0.04g/l的速度，控制温度为28℃，空气通入比为2.5vvm，溶氧值≤10％，ph6.0；
4)发酵培养到80h时，以与甲醇相同补加速率连续补加有机氮源，发酵培养180h结束。
优选地，所述菌体生长动力学模型为ft+△t＝(1+μt)ft，
其中：ft表示t时的碳源补加速率，μt+△t表示t+△t时的比生长速率，ft+△t表示t+△t时的碳源补加速率。
优选地，所述发酵起始培养基组成为：
甘油20-40g/l，尿素5-8g/l，caso4·2h2o0.4-1.0g/l，mgso45-8g/l，koh20-30g/l，h3po420-30ml/l，ptm1溶液2-6ml/l，消泡剂1-3ml/l。
进一步优选地，所述ptm1溶液为cuso4·5h2o6g/l，ki0.08g/l，mnso4·h2o3g/l，na2moo4·2h2o0.2g/l，h3bo30.02g/l，znso4·7h2o20g/l，feso4·7h2o65g/l，cocl2·6h2o0.5g/l，h2so45ml/l，biotin0.2g/l。
优选地，所述步骤2)、步骤3)过程中采用50％(w/v)尿素溶液控制ph。
优选地，所述步骤2)甘油溶液的组成是将8-14mlptm1溶液添加到1l甘油溶液(50％，w/v)中配制而成。
优选地，所述步骤3)甲醇溶液组成是将8-14mlptm1溶液添加到1l甲醇中配制而成。
优选地，所述步骤4)有机氮源为50％(w/v)的酵母提取物或大豆蛋白胨。
优选地，所述步骤4)补加有机氮源的方法还可以采用放掉20％-60％的发酵液，快速补加同等体积的补料培养基的方法。
进一步优选地，所述补料培养基组成为：caso40.5g/l，mgso410g/l，koh10g/l，h3po420g/l，有机氮源10g/l。
实施例2
一种提高重组人胰岛素前体表达的毕赤酵母发酵方法，所述发酵方法包括如下步骤：
1)起始生长阶段：接种浓度为6.0×105cfu/ml，温度控制在28℃，空气通入比为1.0vvm，通过搅拌控制溶氧值≥50％；
2)甘油补加阶段：溶氧值反弹至80％时开始补加甘油溶液，设定甘油起始补加速率f0＝8g/l/h，然后基于微生物生长动力学模型实时调整甘油补加速率，使菌体活细胞呈指数(x＝1.5*1.2t，x表示活细胞浓度，即活细胞电容率，t表示时间)生长，从而获得大量的有较高活性的菌体，控制温度为28℃，空气通入比为1.0vvm，溶氧值≥30％，ph4.0；当实时活细胞浓度(即活细胞电容率)x＝17pf/cm时，停止补加甘油；
3)甲醇诱导阶段：停止补加甘油30min后，开始补加甲醇溶液进行诱导，设定起始甲醇补加速率f0＝3g/l/h，然后基于微生物生长动力学模型实时调整甲醇补加速率，使得目标蛋白的增加量基本能够维持在每小时增加0.04g/l的速度，控制温度为25℃，空气通入比为1.5vvm，溶氧值≤10％，ph4.0；
4)发酵培养到80h时，以与甲醇相同补加速率连续补加有机氮源，发酵培养130h结束。
优选地，所述菌体生长动力学模型为ft+△t＝(1+μt)ft，
其中：ft表示t时的碳源补加速率，μt+△t表示t+△t时的比生长速率，ft+△t表示t+△t时的碳源补加速率。
优选地，所述发酵起始培养基组成为：
甘油20g/l，尿素5g/l，caso4·2h2o0.4g/l，mgso45g/l，koh20g/l，h3po420ml/l，ptm1溶液2ml/l，消泡剂1ml/l。
进一步优选地，所述ptm1溶液为cuso4·5h2o6g/l，ki0.08g/l，mnso4·h2o3g/l，na2moo4·2h2o0.2g/l，h3bo30.02g/l，znso4·7h2o20g/l，feso4·7h2o65g/l，cocl2·6h2o0.5g/l，h2so45ml/l，biotin0.2g/l。
优选地，所述步骤2)、步骤3)过程中采用50％(w/v)尿素溶液控制ph。
优选地，所述步骤2)甘油溶液的组成是将8-14mlptm1溶液添加到1l甘油溶液(50％，w/v)中配制而成。
优选地，所述步骤3)甲醇溶液组成是将8-14mlptm1溶液添加到1l甲醇中配制而成。
优选地，所述步骤4)有机氮源为50％(w/v)的酵母提取物或大豆蛋白胨。
优选地，所述步骤4)补加有机氮源的方法还可以采用放掉20％的发酵液，快速补加同等体积的补料培养基的方法。
进一步优选地，所述补料培养基组成为：caso40.1g/l，mgso450g/l，koh5g/l，h3po410g/l，有机氮源5g/l。
实施例3
一种提高重组人胰岛素前体表达的毕赤酵母发酵方法，所述发酵方法包括如下步骤：
1)起始生长阶段：接种浓度为2.0×105cfu/ml，温度控制在32℃，空气通入比为1.5vvm，通过搅拌控制溶氧值≥50％；
2)甘油补加阶段：溶氧值反弹至80％时开始补加甘油溶液，设定甘油起始补加速率f0＝12g/l/h，然后基于微生物生长动力学模型实时调整甘油补加速率，使菌体活细胞呈指数(x＝1.15*1.3t，x表示活细胞浓度，即活细胞电容率，t表示时间)生长，从而获得大量的有较高活性的菌体，控制温度为32℃，空气通入比为1.5vvm，溶氧值≥30％，ph6.0；当实时活细胞浓度(即活细胞电容率)x＝19pf/cm时，停止补加甘油；
3)甲醇诱导阶段：停止补加甘油50min后，开始补加甲醇溶液进行诱导，设定起始甲醇补加速率f0＝7g/l/h，然后基于微生物生长动力学模型实时调整甲醇补加速率，使得目标蛋白的增加量基本能够维持在每小时增加0.04g/l的速度，控制温度为28℃，空气通入比为2.5vvm，溶氧值≤10％，ph6.0；
4)发酵培养到90h时，以与甲醇相同补加速率连续补加有机氮源，发酵培养180h结束。
优选地，所述菌体生长动力学模型为ft+△t＝(1+μt)ft，
其中：ft表示t时的碳源补加速率，μt+△t表示t+△t时的比生长速率，ft+△t表示t+△t时的碳源补加速率。
优选地，所述发酵起始培养基组成为：
甘油40g/l，尿素8g/l，caso4·2h2o1.0g/l，mgso48g/l，koh30g/l，h3po430ml/l，ptm1溶液6ml/l，消泡剂3ml/l。
进一步优选地，所述ptm1溶液为cuso4·5h2o6g/l，ki0.08g/l，mnso4·h2o3g/l，na2moo4·2h2o0.2g/l，h3bo30.02g/l，znso4·7h2o20g/l，feso4·7h2o65g/l，cocl2·6h2o0.5g/l，h2so45ml/l，biotin0.2g/l。
优选地，所述步骤2)、步骤3)过程中采用50％(w/v)尿素溶液控制ph。
优选地，所述步骤2)甘油溶液的组成为是将8-14mlptm1溶液添加到1l甘油溶液(50％，w/v)中配制而成。
优选地，所述步骤3)甲醇溶液组成是将8-14mlptm1溶液添加到1l甲醇中配制而成。
优选地，所述步骤4)有机氮源为50％(w/v)的酵母提取物或大豆蛋白胨。
优选地，所述步骤4)补加有机氮源的方法还可以采用放掉20％-60％的发酵液，快速补加同等体积的补料培养基的方法。
进一步优选地，所述补料培养基组成为：caso40.5g/l，mgso410g/l，koh10g/l，h3po420g/l，有机氮源10g/l。
实施例4
一种提高重组人胰岛素前体表达的毕赤酵母发酵方法，所述发酵方法包括如下步骤：
1)起始生长阶段：接种浓度为4.0×105cfu/ml，温度控制在29℃，空气通入比为1.3vvm，通过搅拌控制溶氧值≥50％；
2)甘油补加阶段：溶氧值反弹至80％时开始补加甘油溶液，设定甘油起始补加速率f0＝9g/l/h，然后基于微生物生长动力学模型实时调整甘油补加速率，使菌体活细胞呈指数生长，从而获得大量的有较高活性的菌体，控制温度为30℃，空气通入比为1.3vvm，溶氧值≥30％，ph5.0；当实时活细胞浓度(即活细胞电容率)x＝18pf/cm时，停止补加甘油；
3)甲醇诱导阶段：停止补加甘油45min后，开始补加甲醇溶液进行诱导，设定起始甲醇补加速率f0＝6g/l/h，然后基于微生物生长动力学模型实时调整甲醇补加速率，使得目标蛋白的增加量基本能够维持在每小时增加0.04g/l的速度，控制温度为27℃，空气通入比为2.2vvm，溶氧值≤10％，ph5.0；
4)发酵培养到100h时，以与甲醇相同补加速率连续补加有机氮源，发酵培养160h结束。
优选地，所述菌体生长动力学模型为ft+△t＝(1+μt)ft，
其中：ft表示t时的碳源补加速率，μt+△t表示t+△t时的比生长速率，ft+△t表示t+△t时的碳源补加速率。
优选地，所述发酵起始培养基组成为：
甘油35g/l，尿素7g/l，caso4·2h2o0.8g/l，mgso47g/l，koh25g/l，h3po425ml/l，ptm1溶液5ml/l，消泡剂2ml/l。
进一步优选地，所述ptm1溶液为cuso4·5h2o6g/l，ki0.08g/l，mnso4·h2o3g/l，na2moo4·2h2o0.2g/l，h3bo30.02g/l，znso4·7h2o20g/l，feso4·7h2o65g/l，cocl2·6h2o0.5g/l，h2so45ml/l，biotin0.2g/l。
优选地，所述步骤2)、步骤3)过程中采用50％(w/v)尿素溶液控制ph。
优选地，所述步骤2)甘油溶液的组成是将8-14mlptm1溶液添加到1l甘油溶液(50％，w/v)中配制而成。
优选地，所述步骤3)甲醇溶液组成是将8-14mlptm1溶液添加到1l甲醇中配制而成。
优选地，所述步骤4)有机氮源为50％(w/v)的酵母提取物或大豆蛋白胨。
优选地，所述步骤4)补加有机氮源的方法还可以采用放掉40％的发酵液，快速补加同等体积的补料培养基的方法。
进一步优选地，所述补料培养基组成为：caso40.4g/l，mgso48g/l，koh8g/l，h3po415g/l，有机氮源8g/l。
对比例
对象：采用gs115型毕赤酵母(购自invitrogen公司，美国)发酵表达重组人胰岛素前体。
发酵培养：1)起始生长阶段：将扩培后的菌种接种至发酵培养基中，菌种的接种体积为发酵培养基体积的2.5％，通过转速控制溶氧值量≥50％，在30℃下培养至溶氧值反弹至80％；2)甘油补加阶段：以20g/l/h的速率补加甘油溶液、通过转速控制溶氧值≥30％，补加氨水控制ph值在5.0，培养至菌体浓度为od600在300时停加甘油；3)甲醇诱导阶段：等溶氧值量反弹至80％后以7.0g/l/h的速率补加甲醇溶液，培养温度降至28℃，通过转速控制溶氧值为10％，培养130h时结束。
表1培养过程中前体表达量测试结果
实施例5
重组人胰岛素基因序列：ins001，seqidno:1所示核苷酸序列
一种提高重组人胰岛素表达的方法，所述方法包括以下：
1)起始生长阶段：接种浓度为2.0-6.0×105cfu/ml，温度控制在28-32℃，空气通入比为1.0-1.5vvm，通过搅拌控制溶氧值≥50％；
2)甘油补加阶段：溶氧值反弹至80％时开始补加甘油溶液，设定甘油起始补加速率f0＝8-12g/l/h，然后基于微生物生长动力学模型实时调整甘油补加速率，使菌体活细胞呈指数生长，从而获得大量的有较高活性的菌体，控制温度为28-32℃，空气通入比为1.0-1.5vvm，溶氧值≥30％，ph4.0-6.0；当实时活细胞浓度(即活细胞电容率)x＝17-19pf/cm时，停止补加甘油；
3)甲醇诱导阶段：停止补加甘油30-50min后，开始补加甲醇溶液进行诱导，设定起始甲醇补加速率f0＝3-7g/l/h，然后基于微生物生长动力学模型实时调整甲醇补加速率，使得目标蛋白的增加量基本能够维持在每小时增加0.04g/l的速度，控制温度为25-28℃，空气通入比为1.5-2.5vvm，溶氧值≤10％，ph4.0-6.0；
4)发酵培养到80-100h时，以与甲醇相同补加速率连续补加有机氮源，发酵培养130-180h结束。
优选地，所述菌体生长动力学模型为ft+△t＝(1+μt)ft，
其中：ft表示t时的碳源补加速率，μt+△t表示t+△t时的比生长速率，ft+△t表示t+△t时的碳源补加速率。
优选地，所述发酵起始培养基组成为：
甘油20-40g/l，尿素5-8g/l，caso4·2h2o0.4-1.0g/l，mgso45-8g/l，koh20-30g/l，h3po420-30ml/l，ptm1溶液2-6ml/l，消泡剂1-3ml/l。
进一步优选地，所述ptm1溶液为cuso4·5h2o6g/l，ki0.08g/l，mnso4·h2o3g/l，na2moo4·2h2o0.2g/l，h3bo30.02g/l，znso4·7h2o20g/l，feso4·7h2o65g/l，cocl2·6h2o0.5g/l，h2so45ml/l，biotin0.2g/l。
优选地，所述步骤2)、步骤3)过程中采用50％(w/v)尿素溶液控制ph。
优选地，所述步骤2)甘油溶液的组成是将8-14mlptm1溶液添加到1l甘油溶液(50％，w/v)中配制而成。
优选地，所述步骤3)甲醇溶液组成是将8-14mlptm1溶液添加到1l甲醇中配制而成。
优选地，所述步骤4)有机氮源为50％(w/v)的酵母提取物或大豆蛋白胨。
优选地，所述步骤4)补加有机氮源的方法还可以采用放掉20％-60％的发酵液，快速补加同等体积的补料培养基的方法。
进一步优选地，所述补料培养基组成为：caso40.1-0.5g/l，mgso45-10g/l，koh5-10g/l，h3po410-20g/l，有机氮源5-10g/l。
实施例6
甘精胰岛素基因序列：gla001，seqidno:2所示核苷酸序列
一种提高甘精胰岛素表达的方法，所述方法包括以下：
1)起始生长阶段：接种浓度为2.0-6.0×105cfu/ml，温度控制在28-32℃，空气通入比为1.0-1.5vvm，通过搅拌控制溶氧值≥50％；
2)甘油补加阶段：溶氧值反弹至80％时开始补加甘油溶液，设定甘油起始补加速率f0＝8-12g/l/h，然后基于微生物生长动力学模型实时调整甘油补加速率，使菌体活细胞呈指数生长，从而获得大量的有较高活性的菌体，控制温度为28-32℃，空气通入比为1.0-1.5vvm，溶氧值≥30％，ph4.0-6.0；当实时活细胞浓度(即活细胞电容率)x＝17-19pf/cm时，停止补加甘油；
3)甲醇诱导阶段：停止补加甘油30-50min后，开始补加甲醇溶液进行诱导，设定起始甲醇补加速率f0＝3-7g/l/h，然后基于微生物生长动力学模型实时调整甲醇补加速率，使得目标蛋白的增加量基本能够维持在每小时增加0.04g/l的速度，控制温度为25-28℃，空气通入比为1.5-2.5vvm，溶氧值≤10％，ph4.0-6.0；
4)发酵培养到80-100h时，以与甲醇相同补加速率连续补加有机氮源，发酵培养130-180h结束。
优选地，所述菌体生长动力学模型为ft+△t＝(1+μt)ft，
其中：ft表示t时的碳源补加速率，μt+△t表示t+△t时的比生长速率，ft+△t表示t+△t时的碳源补加速率。
优选地，所述发酵起始培养基组成为：
甘油20-40g/l，尿素5-8g/l，caso4·2h2o0.4-1.0g/l，mgso45-8g/l，koh20-30g/l，h3po420-30ml/l，ptm1溶液2-6ml/l，消泡剂1-3ml/l。
进一步优选地，所述ptm1溶液为cuso4·5h2o6g/l，ki0.08g/l，mnso4·h2o3g/l，na2moo4·2h2o0.2g/l，h3bo30.02g/l，znso4·7h2o20g/l，feso4·7h2o65g/l，cocl2·6h2o0.5g/l，h2so45ml/l，biotin0.2g/l。
优选地，所述步骤2)、步骤3)过程中采用50％(w/v)尿素溶液控制ph。
优选地，所述步骤2)甘油溶液的组成是将8-14mlptm1溶液添加到1l甘油溶液(50％，w/v)中配制而成。
优选地，所述步骤3)甲醇溶液组成是将8-14mlptm1溶液添加到1l甲醇中配制而成。
优选地，所述步骤4)有机氮源为50％(w/v)的酵母提取物或大豆蛋白胨。
优选地，所述步骤4)补加有机氮源的方法还可以采用放掉20％-60％的发酵液，快速补加同等体积的补料培养基的方法。
进一步优选地，所述补料培养基组成为：caso40.1-0.5g/l，mgso45-10g/l，koh5-10g/l，h3po410-20g/l，有机氮源5-10g/l。
实施例7
门冬胰岛素基因序列asp001：seqidno:3所示核苷酸序列
一种提高门冬胰岛素表达的方法，所述方法包括以下：
1)起始生长阶段：接种浓度为2.0-6.0×105cfu/ml，温度控制在28-32℃，空气通入比为1.0-1.5vvm，通过搅拌控制溶氧值≥50％；
2)甘油补加阶段：溶氧值反弹至80％时开始补加甘油溶液，设定甘油起始补加速率f0＝8-12g/l/h，然后基于微生物生长动力学模型实时调整甘油补加速率，使菌体活细胞呈指数生长，从而获得大量的有较高活性的菌体，控制温度为28-32℃，空气通入比为1.0-1.5vvm，溶氧值≥30％，ph4.0-6.0；当实时活细胞浓度(即活细胞电容率)x＝17-19pf/cm时，停止补加甘油；
3)甲醇诱导阶段：停止补加甘油30-50min后，开始补加甲醇溶液进行诱导，起始甲醇补加速率f0＝3-7g/l/h，然后基于微生物生长动力学模型实时调整甲醇补加速率，使得目标蛋白的增加量基本能够维持在每小时增加0.04g/l的速度，控制温度为25-28℃，空气通入比为1.5-2.5vvm，溶氧值≤10％，ph4.0-6.0；
4)发酵培养到80-100h时，以与甲醇相同补加速率连续补加有机氮源，发酵培养130-180h结束。
优选地，所述菌体生长动力学模型为ft+△t＝(1+μt)ft，
其中：ft表示t时的碳源补加速率，μt+△t表示t+△t时的比生长速率，ft+△t表示t+△t时的碳源补加速率。
优选地，所述发酵起始培养基组成为：
甘油20-40g/l，尿素5-8g/l，caso4·2h2o0.4-1.0g/l，mgso45-8g/l，koh20-30g/l，h3po420-30ml/l，ptm1溶液2-6ml/l，消泡剂1-3ml/l。
进一步优选地，所述ptm1溶液为cuso4·5h2o6g/l，ki0.08g/l，mnso4·h2o3g/l，na2moo4·2h2o0.2g/l，h3bo30.02g/l，znso4·7h2o20g/l，feso4·7h2o65g/l，cocl2·6h2o0.5g/l，h2so45ml/l，biotin0.2g/l。
优选地，所述步骤2)、步骤3)过程中采用50％(w/v)尿素溶液控制ph。
优选地，所述步骤2)甘油溶液的组成是将8-14mlptm1溶液添加到1l甘油溶液(50％，w/v)中配制而成。
优选地，所述步骤3)甲醇溶液组成是将8-14mlptm1溶液添加到1l甲醇中配制而成。
优选地，所述步骤4)有机氮源为50％(w/v)的酵母提取物或大豆蛋白胨。
优选地，所述步骤4)补加有机氮源的方法还可以采用放掉20％-60％的发酵液，快速补加同等体积的补料培养基的方法。
进一步优选地，所述补料培养基组成为：caso40.1-0.5g/l，mgso45-10g/l，koh5-10g/l，h3po410-20g/l，有机氮源5-10g/l。
上述的实施例仅为本发明的优选技术方案，而不应视为对于本发明的限制，本申请中的实施例及实施例中的特征在不冲突的情况下，可以相互任意组合。本发明的保护范围应以权利要求记载的技术方案，包括权利要求记载的技术方案中技术特征的等同替换方案为保护范围。即在此范围内的等同替换改进，也在本发明的保护范围之内。
sequencelisting
<110>宜昌东阳光长江药业股份有限公司
<120>一种提高胰岛素及其类似物前体表达的毕赤酵母发酵方法
<130>5
<160>1
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<213>毕赤酵母(pichiapastrois)
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<120>一种提高胰岛素及其类似物前体表达的毕赤酵母发酵方法
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