本发明涉及一种中药领域的方法，具体涉及一种提高金银花中木犀草苷产量的方法。
背景技术：
：金银花是常用的传统中药，金银花中的化学成分类型多种多样，主要包括黄酮类、有机酸类、环烯醚萜苷类、皂苷类、挥发油等化学成分，主要功能性成分是以绿原酸为代表的有机酸类和以木犀草苷为代表的黄铜类物质。木犀草苷是体现金银花药理活性的主要化学成分之一，具有与很强的抗菌、抗病毒和抗癌等多种药理作用，被广泛应用于医药、食品和日用品工业中。但是木犀草苷在金银花中的含量很低，不同产地来源、品种在0.023％-0.193％范围内。因此，提高金银花提取物中木犀草苷的获得率具有巨大的应用前景和潜在的经济效益。曲霉属真菌是发酵工业和食品加工业的重要菌种，广泛应用于酿造和中药发酵。研究表明，曲霉分泌的酶系强大，代谢产物丰富，其中黑曲霉、土曲霉、红曲霉能有效转化中药材有效活性成分，获得新的性味和功效。技术实现要素：针对现有技术中从金银花中只能提取得到少量的木犀草苷，本发明提供了一种黑曲霉发酵金银花来提高金银花中木犀草苷含量的方法。为实现上述目的，本发明采用了如下的技术方案：一种黑曲霉发酵金银花提高木犀草苷产量的方法，其特征在于：包括以下步骤：a)分离纯化黑曲霉；b)制备黑曲霉孢子悬浮液待用；c)粉碎金银花：用粉碎机将金银花粉碎；d)制备发酵基质：将一定质量比的粉碎后的金银花、大米和水装于密闭容器中，浸泡一定时间后再进行灭菌得到金银花固态发酵基质；e)接种并发酵：取适量黑曲霉孢子悬浮液接种于金银花固态发酵基质中，在一定的温度下发酵，发酵一定天数后得到发酵物，即可将发酵物用于提取木犀草苷。原理：分离纯化出黑曲霉，接种于发酵基质中并且在一定的条件下进行发酵，将发酵后的金银花进行化学成分分析，并且将其与没有发酵的金银花的化学成分进行对比，最后发现发酵后的金银花中的木犀草苷含量显著提高，绿原酸的含量明显降低。这是因为发酵金银花过程中，这种黑曲霉产生复杂多样的胞外酶类，对金银花化学成分进行转化与修饰，改变了金银花中木犀草苷与绿原酸的含量。相比于现有技术，本发明具有如下有益效果：本发明采用从土壤中分离的一株黑曲霉发酵金银花，发酵后的金银花能够直接作为原料应用于木犀草苷的提取，如下表(发酵前与发酵后的含量测定结果表)所示，能够在短时间内显著增加金银花中木犀草苷的产量；并且本发明技术操作简单，发酵周期短，成本低廉，无污染，总的来看，其应用前景广阔。成分发酵前(mg/g)发酵后(mg/g)变化(mg/g)木犀草苷3.718.47+4.76具体实施方式实施例1一种黑曲霉发酵金银花提高木犀草苷产量的方法，包括以下步骤：a)从冬虫夏草周围土壤中分离纯化黑曲霉，形态与分子鉴定，25℃恒温培养，待菌落长成黑褐色时，这个时候的菌落处于旺盛期，挑取菌丝进行平板划线，最后得到纯化的黑曲霉；b)将纯化后的黑曲霉放入装有无菌水的离心管中，摇床震荡，制得4×106个/ml的孢子悬浮液待用；c)然后将金银花放入高速粉碎机中粉碎；d)将粉碎的金银花20g，大米5g，水25ml都置于300ml三角瓶中，浸泡30min后，然后再进行灭菌，制得金银花固态发酵基质；e)在固态发酵基质中加入黑曲霉孢子悬浮液(质量为发酵基质质量的8％)，温度控制在25℃，发酵15天,这时菌丝布满整个金银花基质，菌丝繁茂，得到金银花的发酵产物，备用。对比实施例1包括以下步骤：a)将20g金银花放入高速粉碎机中粉碎；b)将粉碎的金银花20g，大米5g，水25ml都置于300ml三角瓶中，浸泡30min后，然后再进行灭菌，制得金银花固态发酵基质；c)将金银花固态发酵基质放入室温25℃的环境中，放置15天。效果实验例最后将实施例1中所得金银花的发酵产物与对比实施例1中的没有经过发酵的金银花通过醇提法提取活性成分，并测定提取物中的木犀草苷的含量，其过程为：将发酵产物/直接粉碎物放置于烘箱中干燥，干燥温度为35℃，时间为5h；用高速粉碎机对干燥后的发酵产物/直接粉碎物进行粉碎，粉碎后过60目筛子；称取筛子筛下的发酵产物/直接粉碎物20g，加入200ml95％乙醇，浸泡过夜，再用超声波处理器超声提取三次，每次30min，再用旋转蒸发仪浓缩提取液(40℃)，旋干后称重，再用甲醇定容，使得最后得到金银花提取液浓度为20mg/ml。采用高效液相色谱法测定金银花提取液中木犀草苷的含量，具体的实验操作方法如下：agilent1100高效液相色谱仪，四级杆泵，手动进样器以及二极管阵列检测器。色谱条件为ageladurashellc18色谱柱(4.6×250mm，5μm)；流动相乙腈-水-0.4％磷酸溶液；梯度洗脱程序见表1；检测波长:0-20min为210nm，10-30min为350nm；柱温30℃；流速：1ml/min，进样量10μl，结果如下表所示，明显看出发酵后的金银花中木犀草苷的含量明显提高。成分没有经过发酵(mg/g)发酵产物(mg/g)变化(mg/g)木犀草苷3.718.47+4.76实施例2一种黑曲霉发酵金银花提高木犀草苷产量的方法，包括以下步骤：a)从冬虫夏草周围土壤中分离纯化黑曲霉，形态与分子鉴定，26℃恒温培养，待菌落长成黑褐色时，这个时候的菌落处于旺盛期，挑取菌丝进行平板划线，最后得到纯化的黑曲霉；b)将纯化后的黑曲霉装入装有无菌水的离心管中，摇床震荡，制得3×107个/ml的孢子悬浮液待用；c)然后将金银花放入高速粉碎机中粉碎；d)将粉碎的金银花28g，大米7g，水35ml都置于300ml三角瓶中，浸泡40min后，然后再进行灭菌，制得金银花固态发酵基质；e)在固态发酵基质中加入黑曲霉孢子悬浮液(质量为发酵基质质量的8％)，温度控制在26℃，发酵20天,这时菌丝布满整个金银花基质，菌丝生长茂盛，得到金银花的发酵产物，备用。对比实施例2包括以下步骤：a)将28g金银花放入高速粉碎机中粉碎；b)将粉碎的金银花28g，大米7g，水35ml都置于300ml三角瓶中，浸泡40min后，然后再进行灭菌，制得金银花固态发酵基质；c)将金银花固态发酵基质放入室温26℃的环境中，放置20天。效果实验例最后将实施例2中所得金银花的发酵产物与对比实施例2中的没有经过发酵的金银花通过醇提法提取化学成分，并测定提取物中的木犀草苷的含量，其过程为：将发酵产物/直接粉碎物放置于烘箱中干燥，干燥温度为35℃，时间为5h；用高速粉碎机对干燥后的金银花进行粉碎，粉碎后过60目筛子，留取筛子筛下的金银花；称取筛子筛下的金银花20g，加入200ml95％乙醇，浸泡过夜，再用超声波处理器超声提取三次，每次30min，再用旋转蒸发仪浓缩提取液(40℃)，旋干后称重，再用甲醇定容，使得最后得到金银花提取液浓度为20mg/ml。采用高效液相色谱法测定金银花提取液中木犀草苷的含量，具体的实验操作方法如下：agilent1100高效液相色谱仪，四级杆泵，手动进样器以及二极管阵列检测器。色谱条件为ageladurashellc18色谱柱(4.6×250mm，5μm)；流动相乙腈-水-0.4％磷酸溶液；梯度洗脱程序见表1；检测波长:0-20min为210nm，10-30min为350nm；柱温30℃；流速：1ml/min，进样量10μl。结果如下表所示，明显看出发酵后的金银花中木犀草苷的含量明显提高。成分没有经过发酵(mg/g)发酵产物(mg/g)变化(mg/g)木犀草苷3.7110.21+6.5实施例3一种黑曲霉发酵金银花提高木犀草苷产量的方法，包括以下步骤：a)从冬虫夏草周围土壤中分离纯化黑曲霉，形态与分子鉴定，28℃恒温培养，待菌落长成金黄色时，这个时候的菌落处于旺盛期，挑取菌丝进行平板划线，最后得到纯化的黑曲霉；b)将纯化后的黑曲霉放入装有无菌水的容器中，摇床震荡，制得4×106个/ml的孢子悬浮液待用；c)将金银花放入高速粉碎机中粉碎；d)将粉碎的金银花16g，大米4g，水20ml都置于300ml三角瓶中，浸泡20min后，然后再进行灭菌，制得金银花固态发酵基质；e)在固态发酵基质中加入黑曲霉孢子悬浮液(质量为发酵基质质量的8％)，温度控制在28℃，发酵10天,这时菌丝布满整个金银花基质，且菌丝色泽金黄，得到金银花的发酵产物，备用。对比实施例3包括以下步骤：a)将16g金银花放入高速粉碎机中粉碎；b)将粉碎的金银花16g，大米4g，水20ml都置于300ml三角瓶中，浸泡20min后，然后再进行灭菌，制得金银花固态发酵基质；c)将金银花固态发酵基质放入室温28℃的环境中，放置10天。效果实验例.最后将实施例3中的发酵后的金银花与对比实施例3中的没有经过发酵的金银花通过醇提法进行提取活性成分，并测定提取物中的木犀草苷的含量，其过程为：将发酵产物/直接粉碎物放置于烘箱中干燥，干燥温度为35℃，时间为5h；用高速粉碎机对干燥后的金银花进行粉碎，粉碎后过60目筛子，留取筛子筛下的金银花；称取筛子筛下的金银花20g，加入200ml95％乙醇，浸泡过夜，再用超声波处理器超声提取三次，每次30min，再用旋转蒸发仪浓缩提取液(40℃)，旋干后称重，再用甲醇定容，使得最后得到金银花提取液浓度为20mg/ml。采用高效液相色谱法测定金银花提取液中木犀草苷的含量，具体的实验操作方法如下：agilent1100高效液相色谱仪，四级杆泵，手动进样器以及二极管阵列检测器。色谱条件为ageladurashellc18色谱柱(4.6×250mm，5μm)；流动相乙腈-水-0.4％磷酸溶液；梯度洗脱程序见表1；检测波长:0-20min为210nm，10-30min为350nm；柱温30℃；流速：1ml/min，进样量10μl，结果如下表所示，明显看出发酵后的金银花中木犀草苷的含量明显提高。成分没有经过发酵(mg/g)发酵产物(mg/g)变化(mg/g)木犀草苷3.718.21+4.5当前第1页12