氮营养运输基因OsNPF7.1在提高水稻分蘖和穗数中的应用的制作方法

本发明属于植物基因工程领域，具体涉及氮营养运输基因osnpf7.1在提高水稻分蘖和穗数中的应用。

背景技术：

氮营养与水稻分蘖发育密切相关，这是因为分蘖芽生长前期需要提供更多的营养物质。有报道指出，当茎鞘含氮量低于1.3%，叶片含氮量小于2%时，分蘖芽的分化发育就会停止，而茎鞘含氮水平在2.7%-3.3%，叶片含氮5%时，水稻分蘖就能正常发生（蒋彭炎，洪晓富，冯来定，等.水培条件下氮浓度对水稻氮素吸收和分蘖发生的影响研究.作物学报，1997，23：191-199.）。水稻谷氨酰胺合成酶gs1能够将铵根同化成谷氨酰胺（sukanyar,lim,snustaddp.root-andshoot-specificresponsesofindividualglutaminesynthetasegenesofmaizetonitrateandammonium.plantmolecularbiology,1994,26(6):1935-1946.），其中osgs1;2在水稻铵根同化中起主要作用（funayamak,kojimas,tabuchi-kobayashim,etal.cytosolicglutaminesynthetase1;2isresponsiblefortheprimaryassimilationofammoniuminriceroots.plantandcellphysiology,2013:pct046.）。同时，水稻osgs1;2对分蘖侧芽的伸长非常重要，osgs1;2的缺失导致水稻分蘖芽严重减少，并且导致木质素积累（ohashim,ishiyamak,kusanom,etal.lackofcytosolicglutaminesynthetase1;2invasculartissuesofaxillarybudscausesseverereductionintheiroutgrowthanddisorderofmetabolicbalanceinriceseedlings.theplantjournal,2015,81:347-356.）。

氮运输npf家族成员在生长发育上起重要作用（rentschd,schmidts,tegederm.transportersforuptakeandallocationoforganicnitrogencompoundsinplants.febsletters,2007,581:2281-2289.）。水稻npf家族成员sp1对水稻穗长和结实控制起重要作用（lis,qianq,fuz,etal.shortpanicle1encodesaputativeptrfamilytransporteranddeterminesricepaniclesize.theplantjournal,2009,58(4):592-605.）。osnpf2.2介导了木质部硝酸根的卸载，影响水稻生长和种子灌浆结实（liy,ouyangj,wangyy,etal.disruptionofthericenitratetransporterosnpf2.2hindersroot-to-shootnitratetransportandvasculardevelopment.scientificreports,2015,5:9635.）。osnpf7.2对硝酸根有低亲和运输，能够影响植株生长（hur,qiud,cheny,etal.knock-downofatonoplastlocalizedlow-affinitynitratetransporterosnpf7.2affectsricegrowthunderhighnitratesupply.frontiersinplantscience,2016,7.）。超表达高亲和硝酸根运输基因osnrt2.3b能促进水稻生长，提高氮利用效率，增加产量（fanx,tangz,tany,etal.overexpressionofaph-sensitivenitratetransporterinriceincreasescropyields.proceedingsofthenationalacademyofsciences,2016,113(26):7118-7123.）。

水稻npf家族有80多个成员，挖掘出氮高效运输基因，特别是控制水稻株型的关键基因，将有利于水稻高产品种的培育。虽然已了解氮肥可以影响植物生长发育，但是氮肥是如何影响植株生长发育的，目前还未知。特别是，氮素是如何被npf家族中某些关键基因运输，又是如何引起植株生长发育变化的，目前也没有什么相关报道。本发明通过长期研究发现，npf家族中osnpf7.1基因对水稻分蘖和有效穗等有重要的控制作用，可应用于植物株型改良从而使水稻增产。

技术实现要素：

本发明的目的在于解决现有技术中存在的问题，提供水稻npf基因家族成员osnpf7.1基因在提高水稻分蘖和穗数中的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

本发明以水稻的npf基因家族成员osnpf7.1基因为对象，从水稻中花11中克隆了osnpf7.1的cdna序列。通过构建osnpf7.1基因超表达载体，采用农杆菌eha105介导的遗传转化方法，将超表达载体导入正常粳稻品种中花11中，得到osnpf7.1基因超表达植株，其分蘖数和穗数与对照野生型中花11相比显著提高。通过rnai技术构建osnpf7.1基因干扰表达载体，将干扰表达载体导入中花11中，得到osnpf7.1基因表达量下降的干扰植株，干扰植株的分蘖数和穗数与中花11相比显著降低。这些结果表明，通过提高osnpf7.1基因的表达，可以使正常的水稻分蘖数、穗数增加，从而提高水稻产量。

基于本发明发现的osnpf7.1基因的功能，osnpf7.1基因可用于水稻选育中。所述的水稻选育为提高水稻分蘖数、穗数，从而提高水稻产量。具体可通过提高osnpf7.1基因的表达使水稻分蘖数和每株穗数增加，达到提高水稻产量的目的。

osnpf7.1基因也可用于提高其他植物的产量，如通过转基因使osnpf7.1基因在植物中（超量）表达，来提高植物的分枝数量，进而使植物的产量得到提高。所述的植物是指单子叶植物或双子叶植物；如：小麦、番茄、草坪草或苜蓿等。

所述的osnpf7.1基因编码的osnpf7.1蛋白的氨基酸序列如seqidno.1所示；所述的osnpf7.1基因的cdna序列优选如seqidno.2所示。

应该理解为，在不影响osnpf7.1蛋白活性的前提下（即不在蛋白的活性中心），本领域技术人员可对seqidno.1所示的氨基酸序列进行各种取代、添加和/或缺失一个或几个氨基酸获得具有同等功能的氨基酸序列。因此，osnpf7.1蛋白还包括seqidno.1所示氨基酸序列经取代、替换和/或增加一个或几个氨基酸获得的具有同等活性的蛋白质。此外，应理解，考虑到密码子的简并性以及不同物种密码子的偏爱性，本领域技术人员可以根据需要使用适合特定物种表达的密码子。

本发明的优点和效果：

（1）本发明克隆的osnpf7.1基因超表达后使水稻分蘖能力增强，说明osnpf7.1基因对提高水稻产量有明显影响，因此，通过基因工程技术提高osnpf7.1基因的表达能够提高植物产量。这不仅有助于通过正常施氮条件下培育高产水稻，还可以通过分子育种进行植物的品种改良。

（2）osnpf7.1基因的成功克隆，进一步证实了npf家族在氮吸收过程中的重要作用，对阐明npf家族的生物学功能有重要的意义，另外对进一步了解植物氮代谢途径，提高氮吸收效率有极大的推动作用。

（3）尽管目前已克隆到了一些提高植物产量的基因，但对植物增产的分子机制仍不清楚。而本发明克隆的osnpf7.1基因能够提高水稻的产量，对确定植物增产的关键因素有极大的推动作用。

附图说明

图1是对照中花11、osnpf7.1基因超表达植株2个株系和osnpf7.1基因干扰植株2个株系的整株表型图。

图2是对照中花11、osnpf7.1基因超表达植株2个株系和osnpf7.1基因干扰植株2个株系分蘖数的统计柱状图，数据采用spss软件进行变量分析（anova），使用duncan’s在0.05水平上进行差异显著性分析，不同组别星号（*）表示与对照具有显著差异。

图3是对照中花11、osnpf7.1基因超表达植株2个株系的单株有效穗表型图。

图4是对照中花11、osnpf7.1基因超表达植株2个株系和osnpf7.1基因干扰植株2个株系有效穗数的统计柱状图，数据采用spss软件进行变量分析（anova），使用duncan’s在0.05水平上进行差异显著性分析，不同组别星号（*）表示与对照具有显著差异。

图5是对照中花11、osnpf7.1基因超表达植株2个株系和osnpf7.1基因干扰植株2个株系中osnpf7.1基因相对表达量的统计柱状图，数据采用spss软件进行变量分析（anova），使用duncan’s在0.05水平上进行差异显著性分析，不同组别星号（*）表示与对照具有显著差异。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步详细的说明，但本发明的实施方式不限于此。若未特别指明，下述实施例所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段；所用的实验方法均为常规方法，并可按照已描述的重组技术（参见分子克隆，实验室手册，第2版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约）完成；所用的材料、试剂等，均可从商业途径得到。

实施例1osnpf7.1基因超表达植株的构建

提取水稻中花11的rna，并将其反转录成cdna，利用引物对：

f1：5'-ggtaccatggcgtttcttttttttttttgtggcacagttcct-3'（kpni），

r1：5'-ggatccgacttggatgacagccttcttcaa-3'（bamhi）；

通过pcr扩增osnpf7.1基因的cdna后，通过kpni、bamhi酶切后连入pcambia-1306载体（pcambia-1306载体购自cambia公司），构建出osnpf7.1基因的超表达载体osnpf7.1-p1306。采用农杆菌eha105介导的遗传转化方法，将超表达载体导入正常水稻品种中花11中。

将得到的所有转基因小苗移栽于带泥土的筐中，定期浇水，施肥，待小苗长高约10cm时，种于大田中，待苗长大后，提取基因组dna通过pcr对转基因植株进行检测，检测引物对为：

f2：5'-gatgttggcgacctcgtatt-3'，

r2：5'-tcgttatgtttatcggcacttt-3'。

若扩增出517bp的片段，则说明转基因植株为阳性植株。阳性植株单株收种并种植，直至t2代鉴定出纯合的转基因植株，即得到osnpf7.1基因超表达植株。osnpf7.1基因超表达植株的分蘖数和有效穗数远多于对照中花11植株，差异显著，如图1、2、3、4中所示。

取osnpf7.1基因超表达植株叶片，提取rna并将其反转录成cdna，通过实时荧光定量pcr检测osnpf7.1基因的表达量，结果显示（图5）超表达植株osnpf7.1基因的表达量与对照中花11相比显著升高。实时荧光定量pcr所用引物对为：

f3：5'-ttgtggcacagttcctcagcaaga-3'，

r3：5'-gttgcgcgactatggggatgcctc-3'。

实施例2osnpf7.1基因干扰植株的构建

提取水稻中花11的rna，并将其反转录成cdna，利用引物对：

f4：5'-ggtacccacagttcctcagcaagacaagcg-3'（kpni），

r4：5'-ggatccggtctcccctcccctgtggcggct-3'（bamhi）；

f5：5'-actagtcacagttcctcagcaagacaagcg-3'（spei），

r5：5'-gagctcggtctcccctcccctgtggcggct-3'（saci）；

各自pcr扩增出osnpf7.1基因的cdna片段后，通过相应的限制性内切酶酶切后连入ptck303载体，构建出osnpf7.1基因的干扰表达载体osnpf7.1-ptck303。采用农杆菌eha105介导的遗传转化方法，将干扰表达载体导入正常粳稻品种中花11中。

将得到的所有转基因小苗移栽于带泥土的筐中，定期浇水，施肥，待小苗长高约10cm时，种于大田中，待苗长大后，提取基因组dna通过pcr对转基因植株进行检测，检测引物对为：

f2：5'-gatgttggcgacctcgtatt-3'，

r2：5'-tcgttatgtttatcggcacttt-3'。

若扩增出517bp的片段，则说明转基因植株为阳性植株。阳性植株单株收种并种植，直至t2代鉴定出纯合的转基因植株，即得到osnpf7.1基因干扰植株。osnpf7.1基因干扰植株的分蘖数和有效穗数远少于对照中花11植株，差异显著，如图1、2、3中所示。

取osnpf7.1基因干扰植株叶片，提取rna并将其反转录成cdna，通过实时荧光定量pcr检测osnpf7.1基因的表达量，结果显示（图5）干扰植株osnpf7.1基因的表达量与对照中花11相比显著降低。实时荧光定量pcr所用引物同实施例1。

上述结果表明，通过提高osnpf7.1基因的表达，可以增加水稻的分蘖数、穗数，进而提高水稻产量。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

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<110>武汉生物工程学院

<120>氮营养运输基因osnpf7.1在提高水稻分蘖和穗数中的应用

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