一种利用自杀载体消除沙门菌中多拷贝质粒的方法与流程

本发明属于微生物领域，具体涉及一种利用自杀载体消除沙门菌中多拷贝质粒的方法及其应用。

背景技术：

沙门菌是重要的人兽共患病原菌，也是世界范围内重要的食源性病原菌之一，具有重要的公共卫生意义。同时，沙门菌是畜禽的重要病原菌，对畜禽养殖业的危害性极大，目前需要建立新的有效防治措施。因此研究其致病机理对有效防治沙门菌感染具有重要的意义。

质粒是细菌细胞内独立于染色体外的遗传物质，常存在于细胞质内，为双螺旋、闭环dna分子，可自身复制并能进行世代传递。它们在沙门菌的耐药、产毒素能力等方面起着极为重要的作用。有学者已经在鸡白痢沙门菌中发现一个4080bp的多拷贝小质粒，命名为pspi12，质粒图谱见图5。(li,q.,etal.(2014)."ageneknock-inmethodusedtopurifyplasmidpspi12fromsalmonellaentericaserovarpullorumandcharacterizationofipaj."jmicrobiolmethods98:128-133.)。

自杀载体(suicidevector)的特点是只能在特定的宿主菌中进行复制和存活，而在其它细菌中却不能长期存活。因此，自杀载体也是构建细菌基因缺失株和突变株的常用工具之一。pdm4是一种用于构建革兰氏阴性菌基因突变株的自杀载体，由pgf704质粒衍生而来(miltonetal.1996)，当革兰氏阴性菌的生存环境中含有蔗糖时，蔗糖可以诱导pdm4自杀载体上sacb基因的表达，产生蔗糖果聚酶，催化蔗糖水解成葡萄糖和果糖，并将果糖聚合成高分子量的果聚糖。果聚糖积累革兰氏阴性菌产生毒性作用，造成细胞死亡，从而杀死细菌。而只有失去了含该基因的质粒，宿主菌才能存活下来。自杀载体图谱见图6。

目前的质粒消除方法主要采用化学消除剂(嵌合染料、香豆霉素、新生霉素、利福平、丝裂霉素c、十二烷基硫酸钠)和物理学消除法(高温、高压电穿孔、原生质体)，以及分子生物学消除法(转座子、质粒不相容性)达到对质粒的消除，但是这些方法仅对某些菌株中的部分质粒有效，即在不同的菌株之间，或在不同的质粒之间，这些质粒消除方法的有效性存在着极大的差异。此外许多消除剂本身也是诱变剂，容易引起宿主菌基因的突变。所以研制定向消除某一定特质粒或者某一多拷贝质粒的分子生物学技术显得尤为重要。

技术实现要素：

为了克服现有技术中所存在的问题，本发明的目的在于提供利用自杀载体消除沙门菌中多拷贝质粒的方法及其应用。

为了实现上述目的以及其他相关目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面，提供一种利用自杀载体消除沙门菌中多拷贝质粒的方法，为采用外源自杀载体将沙门菌中的多拷贝质粒进行消除。

优选地，所述沙门菌为鸡白痢沙门菌。鸡白痢沙门菌为现有技术，具体信息为：accession:nc_021984.1；gi:529218781。

优选地，所述沙门菌为鸡白痢沙门菌s06004。

优选地，所述多拷贝质粒为pspi12。pspi12的大小为4080bp。pspi12的质粒图谱如图5所示。

所述多拷贝质粒pspi12的详细信息还可参考li,q.,etal.(2014)."ageneknock-inmethodusedtopurifyplasmidpspi12fromsalmonellaentericaserovarpullorumandcharacterizationofipaj."jmicrobiolmethods98:128-133。

优选地，所述自杀载体为pdm4。自杀载体pdm4的图谱如图6所示。

进一步地，所述方法，包括如下步骤：

(1)构建重组自杀载体：将待消除的目标片段连接至自杀载体上，获得重组自杀载体；

(2)构建供体菌：将步骤(1)所得重组自杀载体导入感受态细菌中，获得供体菌；

(3)接合转移：将步骤(2)所得供体菌与受体沙门菌混合培养，筛选获得发生同源重组的沙门菌菌株；

(4)蔗糖筛选：将步骤(3)筛选获得的同源重组的沙门菌菌株接种于含蔗糖的培养基中，筛选出可存活且多拷贝质粒被消除的菌株。

优选地，所述步骤(1)中，所述目标片段的核苷酸序列如seqidno.9所示。

优选地，所述自杀载体为pdm4。自杀载体pdm4的图谱如图6所示。进一步地，所述自杀载体为xbai单酶切的pdm4。所述pdm4含有氯霉素抗性标记。

优选地，所述步骤(2)中，所述感受态细菌为二氨基庚二酸(dap)依赖性感受态细菌。

优选地，所述步骤(2)中，所述感受态细菌为e.coliχ7213感受态细菌。

进一步地，所述步骤(3)中，通过结合转移的方式使重组自杀载体进入受体沙门菌中。

优选地，所述步骤(3)中，使用无二氨基庚二酸(dap)且含氯霉素抗性的lb平板筛选出目标菌株。

优选地，，所述步骤(3)中，所述沙门菌为鸡白痢沙门菌。鸡白痢沙门菌为现有技术，具体信息为：accession:nc_021984.1；gi:529218781。

优选地，所述沙门菌为鸡白痢沙门菌s06004。

进一步地，所述步骤(4)中，利用蔗糖诱导自杀载体启动死亡。

优选地，所述步骤(4)中，所述培养基无氯化钠。进一步地，所述培养基为lb培养基。

优选地，所述步骤(4)中，所述培养基中，蔗糖的质量体积浓度为5～20％。

进一步地，所述培养基中，蔗糖的质量体积浓度为10％。

优选地，所述步骤(4)中，采用pcr方法筛选出多拷贝质粒被消除的菌株。

本发明的第二方面，提供前述方法用于构建多拷贝质粒消除沙门菌株的用途。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明建立的利用外源自杀载体消除沙门菌中多拷贝质粒的方法，既可消除特定单拷贝质粒，也可消除多拷贝质粒，整个过程简单，快速，稳定，高效。为研究这些质粒的功能奠定基础。

附图说明

图1：重组质粒x7213(pdm4-δpspi12)的pcr鉴定，m:dna分子质量标准；1～2:ipajupf/r扩增ipaj上游片段；3:saliup和sacidown扩增pdm4-δpspi12质粒的产物；

图2：s06004-δpspi12内测引物的pcr鉴定，m:dna分子质量标准；1～6:ipajnbf/r扩增s06004-δpspi12的产物；7:ipajnbf/r扩增s06004的产物。

图3：s06004-δpspi12外测引物的pcr鉴定，m:dna分子质量标准；1～3:ipajoutf/r扩增s06004-δpspi12的产物；4:ipajoutf/r扩增s06004的产物。

图4：pspi12/km^r导入缺失株s06004-δpspi12的pcr鉴定，m:dna分子质量标准；1:ipajnbf/r扩增s06004-δpspi12-pspi12/km^r的产物；2:ipajnbf/r扩增s06004-δpspi12的产物。

图5：pspi12的质粒图谱。

图6：自杀载体pdm4的图谱。

具体实施方式

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或者按照各制造商所建议的条件。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组dna技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见sambrook等molecularcloning：alaboratorymanual，secondedition，coldspringharborlaboratorypress，1989andthirdedition，2001；ausubel等，currentprotocolsinmolecularbiology，johnwiley&sons，newyork，1987andperiodicupdates；theseriesmethodsinenzymology，academicpress，sandiego；wolffe，chromatinstructureandfunction，thirdedition，academicpress，sandiego，1998；methodsinenzymology，vol.304，chromatin(p.m.wassarmananda.p.wolffe，eds.)，academicpress，sandiego，1999；和methodsinmolecularbiology，vol.119，chromatinprotocols(p.b.becker，ed.)humanapress，totowa，1999等。

实施例1s06004的pspi12质粒消除突变株的构建

鸡白痢沙门菌s06004来源：扬州大学人兽共患病实验室保存。

1.s06004的鉴定：

1.1.细菌鉴定

1.1.1生化试验

挑取纯培养的单菌落接种生化鉴定管，37℃培养24h后观察结果。

2.s06004的pspi12质粒消除突变株的构建

2.1靶基因序列测定

2.1.1靶基因的扩增

根据genbank上已发表的沙门菌基因组序列，用引物设计软件primer5.0设计出特异性的引物，如表2所示。以鸡白痢沙门菌s06004基因组dna为模板，pcr方法扩增ipaj上游基因片段。

50μlpcr扩增体系如下表：

表1，ipaj基因pcr扩增体系

反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性45s，56℃退火30s，72℃延伸30s，共30个循环，72℃延伸10min，4℃保存。

表2：扩增靶基因引物序列

2.1.2扩增片段的鉴定

pcr产物经1％的琼脂糖凝胶电泳检测，目标片段(靶基因)大小为582bp，试剂盒回收纯化pcr产物，回收操作按fragmentpurificationkit说明书进行。

目标片段(靶基因)的核苷酸序列如seqidno.9所示，具体为：

gtttgttcaggacgggagaaggaaatttctggtccttccgtacgggaaatcagcagaggtgacgcactatcaggggaaggactggatacaactgacggagtgatacggaatgacagagctggaaacacatttgctgaacgccttagagcagctgcaacaggactatatgcagcggctgaacgaatgggagagcgccttcgtggaattgcagaagatgttttcgcttacgcaacgggacaacgcgatgctgaacgagcgggtcatgcagttgagtcagcaggtacagcacttgagcgagcggacagaacacttgagccagttatacagcgagaactggagataagagaggaacggctgatacaggagcgcgaacatgcgttatccctggaacgggaacgccagctggaaatacaggaacgcacactggatggtccttcgttgtcgctgtgatggcgaaactatgaaaaatggcaggttcggtggattttgacgggctaatgtggtctgcaccatctggttgcataggtattc。

2.2重组自杀载体的构建与质粒消除

2.2.1重组自杀载体的构建及鉴定

将纯化回收的dna片段参照clonexpresstmii(onestepcloningkit)的方法连接至xbai单酶切的自杀载体pdm4上，经化学转化法转入e.colidh5αλpir中，转化后涂布含有氯霉素抗性的lb平板，37℃培养过夜。挑取单菌落进行pcr验证(引物用pdm4的通用引物saliup和sacidown)，结果如图1所示，将验证正确的细菌培养后提取重组自杀质粒pdm4-ipaj，保存于-20℃备用。

2.2.2供体菌的构建及鉴定

利用化学转化法将pdm4-ipaj导入e.coliχ7213感受态细菌中(dap依赖性，终浓度50μg/ml)，涂布dap和氯霉素抗性的lb平板。挑取单菌落培养后进行pcr验证(引物用saliup和sacidown)，结果如图1所示。阳性克隆即为供体菌e.coliχ7213-pdm4-ipaj。

2.2.3接合转移

将供体菌e.coliχ7213-pdm4-ipaj与受体菌s06004分别在lb液体培养基中培养至od600约为0.6。取供体菌1ml，4,000rpm离心3min，弃去上清，用1mllb重悬，再离心后去除上清，用新鲜的lb洗两次。随后加入1ml的受体菌s06004，4,000rpm离心3min，弃900μl上清，管内残留的100μllb重悬菌体，滴加至含dap的lb固体平板上的0.22μm亲水性滤膜上，晾干后，置37℃正放过夜培养。

用1ml无菌pbs溶液将滤膜上的菌苔洗涤至10ml离心管中，取100μl涂布于含25μg/ml氯霉素抗性的lb固体平板上。根据供体菌e.coliχ7213的dap依赖性和pdm4质粒的氯霉素抗性标记，使用无dap和含氯霉素抗性的lb平板可以筛选出目标菌株。在平板上存活的菌落为含有重组自杀质粒的菌株，包括发生了一次同源重组的单交换菌株。

2.2.4蔗糖筛选与鉴定

将发生一次同源重组的单交换菌株在含10％(质量体积浓度)蔗糖无nacl的lb培养基中培养24h后，按1:10梯度稀释后分别涂布于含10％(质量体积浓度)蔗糖无nacl2的lb培养平板上。培养24小时，挑取其中生长状态较好的单菌落，用pcr的方法可以对细菌进行筛选与鉴定(引物为ipajoutf/r，质粒消除株扩增不出目的条带，而质粒未消除株可扩增出大小约为2000bp的条带，结果如图2所示；ipajnbf/r引物在消除株中无法扩增出条带，在质粒未消除株中可以扩增出750bp左右的条带，结果如图3所示)。将pspi12质粒缺失株命名为s06004-δpspi12。

为了进一步验证质粒消除株中丢失了pspi12质粒，利用质粒互不相容原理，将本实验室保存的携带有卡那霉素抗性的pspi12-km^r质粒电转入质粒消除突变株中。如果抗性质粒可以导入细菌中，即该菌为pspi12质粒消除突变株；如果抗性质粒无法导入细菌中，则即为假阳性菌，即质粒未被消除。同时利用pcr对转化菌株进行验证(使用引物ipajnbf/r，消除株导入pspi12/km^r质粒可扩出2000bp左右条带，结果如图4所示)。

本发明还尝试使用过多种序列的目标片段构建重组自杀载体，最终只有如seqidno.9所示序列的目标片段构建重组自杀载体对pspi12的消除效果最好。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。

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<110>扬州大学

<120>一种利用自杀载体消除沙门菌中多拷贝质粒的方法

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