一种微藻快速生长突变体筛选方法及应用与流程

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种具有高生长速率的微藻突变体藻株的筛选方法和应用。特别涉及一种通过结合群体dna遗传图谱技术aflp和流式细胞技术筛选微藻快速生长突变体的方法。该方法筛选迅速，结果可靠。

背景技术：

微藻属于古老的低等植物，广泛分布于湖泊、海洋等水域，具有高效吸收太阳能，固定二氧化碳进行快速增殖的能力(光合作用)。同时微藻细胞可以生产多种高价值的营养物质及化工原料，如类胡萝卜素、蛋白质、多糖、油脂等。随着经济的快速发展，能源短缺问题亟待解决。在经历了两代生物质能源的开发后(乙醇、纤维素乙醇)，微藻以其增殖快、油脂占细胞干重大、不与人争粮不与粮争地、可操作性强等优点渐渐发展成为第三代生物质能源的主力。

目前生产中所用藻种多是从自然界直接分离所得的野生种，其后代性状单一且容易产生藻种退化。所以有必要人为地对现有藻种进行育种改良。目前主要的育种手段有：从自然界筛选的天然藻种、经物理化学诱变得到的突变体、基因工程手段得到的转基因藻种。每个方法都有自身的优缺点：天然藻种筛选工作量大且存在藻种退化的现象，物理化学诱变专一性不强，转基因表达不稳定。

中国专利201410844238.2涉及荧光显微筛检生长快和油脂含量高的微藻单细胞。该方法利用显微镜图像处理软件通过拍摄的显微镜图像对藻细胞的颜色进行定量化数据分析，筛选出生长速率快的优势微藻单细胞。但该方法忽视了藻细胞大小及每个藻细胞叶绿素含量的个体差异。比如，若一个藻细胞较大，其每个细胞叶绿素含量较高，所得荧光显微的图片颜色较深，但可能其细胞数量并不高，故而颜色较深不能说明该藻株具有生长较快的优势。

中国专利申请201310691127.8涉及一种微藻藻株人工选育方法。该方法利用常压室温等离子体对野生藻株进行诱变，利用酶标仪或者具有孔板扫描功能的分光光度计对孔板培养的微藻od值进行测定，获得藻细胞生长情况。但该方法不能准确得出优势藻种具体的细胞浓度及增长比例，并且突变体株的稳定性有待验证。

中国专利申请201510127466.2涉及一种快速生长微藻藻株高通量筛选系统和方法。该方法是利用微流控系统，将微藻细胞洗涤并分散到凝胶至适当浓度，注入到微流控芯片中，形成单分散单细胞液滴，对包裹在油相中的微球进行去油、过滤、再分散，于恒温培养箱进行培养；通过倒置显微镜成像判别是否存在活细胞及细胞生长速度的快慢，通过随机间隔取样采集凝胶放大图片，并对有细胞生长的凝胶微球进行计数，进而监测微藻在单细胞水平的生长状况。但该方法涉及复杂的微流控系统的建立并且要解决如何防止污染的问题。

中国专利申请201310164886.9涉及提高微藻生长速率和油脂产率的方法。该申请中利用适应进化来进行实验，即不通过基因工程手段而活化潜在途径、强化特定代谢表型或提高环境适应能力。培养微生物到达一定的指标(细胞密度、生长速率或底物消耗等)后进行传代培养，不断重复这个过程直至代谢表型不再变化。但该方法只是盲目的传代20-200个培养循环，导致传代次数过多，培养周期过长。

由于已有方法中的不足，本领域中仍然需要更加高效、可靠的微藻突变体特别是快速生长突变体的筛选方法。

发明简述

在本发明中，将物理化学诱变、天然藻种筛选的方法与群体dna遗传图谱技术结合，通过分析代间遗传背景差异，避免了常规藻种筛选中不断传代的盲目性，同时可以解决物理化学诱变突变株的不稳定遗传的问题。

本发明的一具体实例中，对化学诱变剂甲基磺酸乙酯(ethylmethanesulfonate，ems)诱变处理后的雨生红球藻nies-144藻株传代培养，传代期间利用群体dna遗传图谱分析技术——扩增片段长度多态性(amplifiedfragmentlengthpolymorphism，aflp)监测不同代间遗传背景的变化趋势，用来确定传代培养次数，进而利用流式细胞技术快速筛选出生长优势突变体藻株。

附图说明

图1为用10对高多态性引物扩增所得的f0-f14代的aflp遗传图谱。

图2示出f0-f14代遗传背景的变化趋势。

图3筛选出的3株血球藻nies-144的快速生长突变体与野生型生长曲线对比。

发明详述

在第一方面，本发明提供了一种筛选微藻细胞突变体的方法，包括以下步骤：

a)对微藻细胞群体进行诱变，或提供包含微藻细胞突变体的微藻细胞群体；

b)对经诱变的微藻细胞群体或所述包含微藻细胞突变体的微藻细胞群体进行传代；

c)通过群体dna遗传图谱技术分析每代的微藻细胞群体的遗传背景；

d)根据群体遗传背景的变化确定最佳传代；和

e)对处于最佳传代的微藻细胞群体进行筛选，获得期望的微藻细胞突变体。

在一些实施方案中，所述诱变是随机诱变，例如化学诱变或辐射诱变，优选甲基磺酸乙酯(ems)诱变。本领域已知的其他诱变方法也可用于本发明的方法中，只要其能够在微藻细胞群体中产生期望的突变。在一些实施方案中，所述微藻细胞突变体是天然突变体。

在一些实施方案中，所述群体dna遗传图谱技术包括但不限于限制性酶切片段长度多态性(rflp)、随机引物扩增多态性dna(rapd)、扩增片段长度多态性(aflp)、短串联重复序列dna遗传多态性分析(str)和单核苷酸多态性分析(snp)。在一优选实施方式中，所述群体dna遗传图谱技术是扩增片段长度多态性(aflp)。如何执行群体dna遗传图谱技术属于本领域上技术人员的能力范围。

可以通过本发明的方法筛选突变体的微藻可以是各种微藻，包括但不限于小球藻(chlorella)、眼虫藻(euglenagracilis)、栅藻(scenedesmus)、扁藻(tetraselmisgracilis)、菱形藻(nitzschia)、富油新绿藻(neochlorisoleoabundans)、微拟球藻(nannochloropsis)、杜氏藻(dunaliella)和血球藻(haematococcuspluvialis)。在一具体实施方式中，所述微藻是血球藻。

在一些实施方案中，所要筛选的微藻突变体是快速生长突变体。在相同培养条件下，目标微藻细胞突变体相对于相应的野生型微藻细胞具有增加的生长速率。生长速率例如可以通过细胞数目或生物质计算。例如，所述微藻细胞突变体的生长速率相对于相应的野生型微藻细胞增加大约50％-500％，例如增加大约50％、大约100％、大约150％、大约200％、大约250％、大约300％、大约350％、大约400％、大约450％或大约500％。

在一些实施方案中，其中步骤d)中将群体遗传背景经历剧烈变化后，其群体遗传背景与前一代相比无明显变化或变化较少的一代确定为最佳传代。例如，在使用alfp分析群体遗传背景的实施方案中，可以通过比较相邻两代之间dna扩增条带的差异来显示遗传背景的变化程度。通常而言，在传代开始时，野生型微藻细胞占优势，因此群体遗传背景变化较小。随着传代进行，突变体微藻细胞(例如快速生长突变体微藻细胞)比例逐渐增加，这将伴随着群体遗传背景的剧烈变化。在传代后期，突变体微藻细胞已经占据主导地位，群体遗传背景因而也趋于稳定。此时，由于突变体细胞在群体中已经占多数，可以停止传代，开展后续的筛选，将更容易获得期望的突变体，例如快速生长突变体。此外，由于经过上述传代，微藻的遗传背景已经趋于稳定，因此获得的期望的微藻突变体将很可能是能够稳定遗传的突变体。根据本文上述教导，本领域技术人员可以容易地确定最佳的传代数目。通过本发明的方法，可以更加高效、可靠地获得稳定遗传的微藻突变体特别是快速生长突变体。

在本发明的方法的一些实施方案中，其中步骤e)中通过流式细胞术进行所述筛选。使用流式细胞术可以对突变体微藻细胞进行快速、精确、高通量筛选。

在第二方面，本发明还提供了通过本发明的方法获得的微藻细胞突变体。

所述微藻可以是各种微藻，包括但不限于小球藻(chlorella)、眼虫藻(euglenagracilis)、栅藻(scenedesmus)、扁藻(tetraselmisgracilis)、菱形藻(nitzschia)、富油新绿藻(neochlorisoleoabundans)、微拟球藻(nannochloropsis)、杜氏藻(dunaliella)和血球藻(haematococcuspluvialis)。在一具体实施方式中，所述微藻是血球藻。

在一些实施方案中，所述微藻突变体是快速生长突变体。在相同培养条件下，所述微藻细胞突变体相对于相应的野生型微藻细胞具有增加的生长速率。例如，所述微藻细胞突变体的生长速率相对于相应的野生型微藻细胞增加大约50％-500％，例如增加大约50％、大约100％、大约150％、大约200％、大约250％、大约300％、大约350％、大约400％、大约450％或大约500％。在一些实施方案中，所述微藻突变体能够稳定遗传。

实施例

现参照下列意在举例说明本发明(而非限定本发明)的实施例来描述本发明。

实施例1、血球藻的活化及预培养：

从固体平板上挑取血球藻nies-144单克隆藻株接种于含10mlbasal液体培养基的50ml三角瓶中，15μmol·m^-2·s^-1、20℃下静置培养10d，转接入含100mlbasal培养基的250ml三角瓶里同等条件下培养4d。1500g，5min离心收集藻细胞。

实施例2、ems化学诱变藻细胞：

1、1500g，5min离心收集对数期血球藻细胞，用4％ems(甲基磺酸乙酯)处理1h；1500g，5min离心去除诱变剂。

2、50ml硫代硫酸钠na2s2o3重悬细胞以终止诱变反应。

3、离心去除硫代硫酸钠，用basal培养基清洗藻细胞两次，最后重悬于basal培养基中并避光24h。

4、将诱变后的藻细胞接种于250ml三角瓶，记为f0代，15μmol·m^-2·s^-1、20℃下静置培养，待f0代恢复活力并长出新鲜藻细胞后依次传代接种，分别记为f1、f2、f3.....。

实施例3、通过计算推测合适的传代次数

假设初始接种量为n个细胞，其中包含一个快速生长突变体。

野生型增长到对数期可增长10倍，假设快速生长突变体到对数期可增长20倍，则可以通过计算当该快速生长突变体比例增至50％时所需的传代次数。

各代生长到对数期时快速生长突变体所占比例(fn)如下所示

当fn＝50％时，若初始接种量n＝4x10⁴，则可推导出传代次数n＝13.7。然而，由于诱变后获得的突变体增长效率具有不确定性，以及初始接种量可能存在差异，实际中需要的传代次数和理论计算会存在较大差异。因此仍然需要适于实践的确定最佳传代次数的方法。

实施例4、aflp检测血球藻遗传背景变化

1、收集经诱变后每一代的藻细胞并用试剂盒(qiagenplantminikit)提取血球藻总dna。

2、限制性内切酶ecori和msei37℃5min消化dna。随后80℃处理5min使酶失活。注意酶切反应的各成分需在室温按照以下顺序依次添加。

表1.利用限制性内切酶消化基因组dna的反应组成

3、酶切后的dna片段与接头于25℃反应10min。连接体系如下表2：

表2.酶切片段与接头连接反应的条件

4、预扩增及选择性扩增：

两轮pcr均采用20μl体系。预扩增反应体系如下表3所示：

表3.预扩增pcr反应体系

预扩增反应程序：

选择性扩增反应体系如下表4所示：

表4.选择性扩增反应体系

选择性扩增反应程序：

5、pcr产物加变性缓冲液，90℃5min变性后置于冰上，配制20ml7％的聚丙烯酰胺胶，电泳缓冲液为1xtbe，所用仪器为li-cor4300。

上述实验过程中用到的接头及两轮pcr引物信息如下：

e-l、e-s、m-l、m-s为ecori和msei接头引物，e-a，m-c为预扩增引物，其余为荧光标记的选择性扩增引物，选择性扩增引物两两配对可形成64对引物。

表5.接头引物与扩增引物

aflp结果如图1所示。图1显示10对高多态性引物(1-2、1-7、2-3、2-7、3-2、4-3、4-4、5-4、8-3、8-4)所扩增得到的条带有所差异。通过这些差异，可以显示出不同代之间的变化。起初突变体混合液遗传背景复杂，所以11代之前的dna遗传背景变化较大并没有稳定下来，11代之后随着传代次数的增加，生长优势株突变体逐渐占据较高比例，所以11代之后的遗传图谱条带变化不大，逐渐趋于稳定。

图2为f0-f14代遗传背景的变化趋势，更加直观的显示不同代之间遗传背景的差异。可以得出接种至第14代时，优势突变株已经占据较高比例，与公式推导得出的最佳传代次数相一致。此时aflp遗传图谱也显示其dna背景趋于稳定，可以进行后续突变株的快速筛选。

实施例5、突变体筛选

aflp带型逐渐稳定之后，将血球藻突变体按照2500/5000/10000个细胞涂布于basal固体平板上，约1个月后长出单克隆，挑取出单克隆藻株接种到24孔板，长至对数期时用流式细胞仪检测各藻株的细胞数，按照相同的接种量接种于12孔板并在第二天、第四天用流式细胞仪检测细胞浓度，即可代表各藻株的生长速度。从中挑选出生长速度较快的突变体。

挑选出的7个生长突变体用血球计数板计数的方法进行复筛，进一步验证挑选出的生长突变体的可重复性。

图3示出了用上述方法筛选出的3株生长速度最快的突变株与野生型对比，这3株突变体相对野生型都有明显的生长优势，最后生物质相比野生型增长了47％。由此，说明以aflp技术为监测基础结合流式细胞技术的微藻快速生长突变体筛选方法是可行的。该方法所筛选到的突变体可以稳定遗传。