本发明属生物工程与技术领域，具体涉及一种生产纳豆激酶的培养基及其制备方法和用途与用法。
背景技术：
纳豆激酶（nattokinase，nk）是用大豆发酵制备的一种具有优良生物活性的蛋白酶，人们已对其进行了相当广泛深入的研究。现代科学研究已表明，它的结构为无空间折叠的线性氨基酸链，特征性作用底物为纤维蛋白，其溶栓作用优于蛇毒纤溶酶、尿激酶（uk）和蚓激酶，具有4倍大于纤溶酶的纤溶活性，分子量远远小于尿激酶、蚓激酶，且可由肠道吸收。据报道，纳豆激酶不仅拥有纤溶酶原激活物活性，而且还能直接消化利用有限的蛋白质纤维。纳豆激酶的体内外溶栓性质通过实验也已得到确定，在体内作用迅速，持续时间长，还能激活体内的纤维蛋白酶，使之温和、持续地提高血液的溶纤活性。其溶解血栓作用上的优点是它的持续性。目前临床上常用的血栓溶解剂（溶栓药物）大都是注射剂，无论是哪种注入体内，其作用时间(半衰期)都很短，只有4～20分钟，而纳豆激酶的作用时间可长达4～8小时。所以，纳豆激酶不仅有望成为临床治疗血栓病的首选治疗剂，其不同级别不同类型的制剂在预防和保健领域也将发挥重要作用。
虽然人们已对纳豆激酶进行了相当广泛深入的研究，但在如何给能够产生纳豆激酶的纳豆菌提供更好更合理更科学的营养的研发方面开展工作不多。经典的生产纳豆与纳豆激酶所用的培养基为大豆，但大豆内部菌体不易生长，产率自然不会太高；cn102586141b公开了一种以黄豆蒸煮水为主原料辅之以2种无机盐的培养基，这种情况原料的利用率难免太低；cn103205409b公开了一种以黑豆为原料制备高活性纳豆激酶的方法；cn106085991a公开了一种固态发酵制备纳豆激酶的方法，它提供了一种以花生粕为主要原料制备纳豆激酶的培养基；上述专利虽为生产纳豆激酶提供了多种原料选择并对产酶量的提升做出了一定贡献，但普遍存在原料预处理不充分、所用培养基营养组分不太均衡或不足、原料利用率偏低，微生物生长不甚旺盛，产酶效率不高等问题。还有一个更重要的问题是，传统方法所用的培养基原料大都是以粗放型原料或微生物用培养基为主成分，辅之以无机盐，从原料的廉价性考虑较多，对原料的安全性考虑不足，致使所得产品存在较大安全隐患，基本不能直接作为产品食用或应用。
技术实现要素：
为解决上述技术与产品的不足或缺陷，本发明提供一种生产纳豆激酶的优良培养基及其制备方法和用途与用法。
本发明是这样实现的：
本发明提供一种生产纳豆激酶的培养基，该培养基包括如下质量的成分（g/l）：预处理大豆600-990、葡萄糖1-50、蔗糖1-50、多胨1-70、胰蛋白胨1-60、甘氨酸1-80、丙氨酸1-60、丝氨酸1-60、赖氨酸1-60、天门冬氨酸1-60、组氨酸1-60、亮氨酸1-58、大豆蛋白肽0.01-8.0、胶原蛋白肽0.01-8.0、生物素0.001-2.0、vc0.01-5.0、ve0.01-5.0、vb50.01-8.0、烟酸0.01-5.0、烟酰胺0.01-5.0、牛磺酸0.01-5.0、l-半胱氨酸或其盐酸盐0.01-5.0、l-胱氨酸0.01-5.0、肝素钠0.01-5.0、精氨酸0.01-5.0、谷氨酸0.01-5.0、吐温-800.01-5.0、酪蛋白酸钠0.5-20.0、烷基糖苷apg0.5-18.0、辅酶q100.01-5.0、mgso4·7h2o0.1-8、cacl20.1-5，ph值6.8-7.6。
作为该培养基的一种优选方式，所述的培养基包括如下质量的成分（g/l）：预处理大豆800-980、葡萄糖2-40、蔗糖3-45、多胨3-65、胰蛋白胨2-58、甘氨酸2-76、丙氨酸1-49、丝氨酸5-56、赖氨酸3-58、天门冬氨酸5-50、组氨酸2-46、亮氨酸1-38、大豆蛋白肽0.05-6.0、胶原蛋白肽0.05-6.0、生物素0.01-1.8、vc0.05-4.0、ve0.04-4.0、vb50.05-6.0、烟酸0.03-4.0、烟酰胺0.05-4.0、牛磺酸0.05-4.0、l-半胱氨酸或其盐酸盐0.05-4.0、l-胱氨酸0.04-4.0、肝素钠0.02-3.0、精氨酸0.03-4.0、谷氨酸0.02-4.0、吐温-800.05-4.0、酪蛋白酸钠0.8-18.0、烷基糖苷apg0.6-16.0、辅酶q100.02-4.0、mgso4·7h2o0.3-6、cacl20.2-4，ph值7.2-7.4。
本发明还提供一种生产纳豆激酶的培养基中的预处理大豆及其预处理方法，该预处理大豆的方法是指按照如下工艺步骤对大豆进行处理：
a.称量
根据生产所需，称取所用量的无病虫害的干大豆；
b.雾水润豆
将上述大豆原料置于容器中，然后用喷雾水雾化大豆，翻拌均匀；
c.适度破碎
将上述润湿的大豆采用一定的破碎工具对大豆进行适度破碎，使破碎度达到每个大豆碎裂为6-10片或米粒大小即可；
d.加水浸泡
将上述适度破碎的大豆置于消过毒的密闭浸泡罐中，按质量比加入3-8倍的无菌水搅拌均匀后静置12-24h；
e.捞豆备用
将上述适度破碎的浸泡好的大豆去水留（或取）豆，将大豆吸水膨胀用不完的多余水放出，导入它罐以备重复利用。
本发明还提供一种上述生产纳豆激酶的培养基的制备方法，该方法包含以下工艺步骤：
（1）按本专利所述的配方和配方量分别称取或量取各组分并将其按对温度的敏感性分为3组：a组（耐高温——包括配方中的预处理大豆、大豆蛋白肽、蛋白胨、氨基酸和无机盐），b组（较耐高温——包括配方中的2种糖、吐温-80和酪蛋白酸钠）和c组（敏感组分——包括配方中的全部维生素），备用；
（2）将称取或量取的a组各组分在无菌条件下混合在一起，混合均匀后在121℃灭菌20-30min；
（3）将称取或量取的b组各组分在无菌条件下混合在一起，混合均匀后在115℃灭菌15-30min；
（4）将称取或量取的c组各组分在无菌条件下根据其溶解性用适量的溶剂溶解后无菌过滤，将所得滤液收集在一起，备用；
（5）在无菌条件下，将c组滤液加入到灭过菌的a+b组组分中，搅拌混合均匀即得所述生产纳豆激酶的培养基。
所述的生产纳豆激酶的培养基的制备方法的步骤（4）中的适量的溶剂是指能将所需组分溶解的最低量的溶剂。
本发明还提供了所述的生产纳豆激酶的培养基的属性及用途，该培养基可做为生产纳豆激酶的通用培养基，该培养基既可用于固态法生产纳豆激酶，又可用于液态法生产纳豆激酶，经过适当调整，该培养基还可用于实验室中纳豆激酶产生菌的富集和培养。
本发明还提供了所述的生产纳豆激酶的培养基的用法，该培养基在用于固态法生产纳豆激酶时是向其中加入无菌水至含水量达50-80%后直接使用，在用于液态法生产纳豆激酶时在无菌条件下用无菌水做10-30倍稀释后使用。
本发明与传统生产纳豆激酶所用的培养基相比，具有如下特点：
（1）根据纳豆激酶产生菌——纳豆菌或纳豆芽孢杆菌的生长生理学特性以及纳豆激酶的产生、分泌特性、分子组成和理化特性进行综合组方设计；
（2）通过巧妙的原料预处理，大豆原料的利用率明显提高；
（3）在培养基原料组分选择和含量配比上，基于安全性第一原则的考虑，本发明所用原料除了食用大豆外，其它全为食品级或医药级以上的生化类或医药级组分，所以，发酵后仅做简单后处理或不做任何处理即可作为产品使用；同时，利用该发明培养基得到的发酵产物还有利于后续健康无害化的不同类型不同级别的纳豆激酶制品的研发与生产；
（4）本发明基于营养要均衡全面、营养功效成分应多重交叉，同时，还有利于产物的形成和分泌才更为高效的原则，在原料组分选择上，本发明具有所选组分种类多且每一功效类组分大都是包含数种化合物；这些化合物有的功能相同或相近，有的功效多种且交叉互补，更有利于微生物的生长和繁殖以及纳豆激酶的产生和分泌；
（5）本发明培养基的制备方法为分类制备法，既有利于提高灭菌效果，还可降低养分的损失。
本发明具有如下有益效果：
（1）均衡全面的多组分培养基配方为纳豆激酶产生菌的生长提供了良好的物质基础；
（2）吐温-80等高效安全表面活性剂的采用，使纳豆激酶的产生与分泌明显提高；
（3）在适宜的发酵条件下，使纳豆激酶的产率提高5-48%；
（4）安全性高，适用面广。该培养基可做为生产纳豆激酶的通用培养基，该培养基既可用于固态法生产纳豆激酶，又可用于液态法生产纳豆激酶，经过适当调整，该培养基还可用于实验室中纳豆激酶产生菌的富集和培养。发酵后的产物既可直接应用，又可做进一步的深加工；
（5）使用方便，效果优良。该培养基在用于固态法生产纳豆激酶时是向其中加入无菌水至含水量达50-80%后直接使用，在用于液态法生产纳豆激酶时在无菌条件下用无菌水做10-30倍稀释后使用。
具体实施方式
以下介绍本发明的实施例。
实施例1：
生产纳豆激酶的培养基配方（g/l）：预处理大豆850、葡萄糖30、蔗糖25、多胨35、胰蛋白胨30、甘氨酸40、丙氨酸30、丝氨酸30、赖氨酸30、天门冬氨酸30、组氨酸30、亮氨酸28、大豆蛋白肽4.0、胶原蛋白肽4.0、生物素0.8、vc2.0、ve2.0、vb54.0、烟酸2.0、烟酰胺3.0、牛磺酸2.5、l-半胱氨酸或其盐酸盐2.5、l-胱氨酸2.5、肝素钠2.5、精氨酸2.5、谷氨酸2.5、吐温-802.5、酪蛋白酸钠10.0、烷基糖苷apg9.0、辅酶q102.5、mgso4·7h2o4.0、cacl22.5，ph值7.2。
制备方法步骤：
（1）按本专利所述的配方和配方量分别称取或量取各组分并将其按对温度的敏感性分为3组：a组（耐高温——包括配方中的预处理大豆、大豆蛋白肽、蛋白胨、氨基酸和无机盐），b组（较耐高温——包括配方中的2种糖、吐温-80和酪蛋白酸钠）和c组（敏感组分——包括配方中的全部维生素），备用；
（2）将称取或量取的a组各组分在无菌条件下混合在一起，混合均匀后在121℃灭菌20-30min；
（3）将称取或量取的b组各组分在无菌条件下混合在一起，混合均匀后在115℃灭菌15-30min；
（4）将称取或量取的c组各组分在无菌条件下根据其溶解性用适量的溶剂溶解后无菌过滤，将所得滤液收集在一起，备用；
（5）在无菌条件下，将c组滤液加入到灭过菌的a+b组组分中，搅拌混合均匀即得所述生产纳豆激酶的培养基。
其中，培养基中的预处理大豆的预处理方法步骤为：
a.称量
根据生产所需，称取所用量的无病虫害的干大豆；
b.雾水润豆
将上述大豆原料置于容器中，然后用喷雾水雾化大豆，翻拌均匀；
c.适度破碎
将上述润湿的大豆采用一定的破碎工具对大豆进行适度破碎，使破碎度达到每个大豆碎裂为6-10片或米粒大小即可；
d.加水浸泡
将上述适度破碎的大豆置于消过毒的密闭浸泡罐中，按质量比加入3-8倍的无菌水搅拌均匀后静置12-24h；
e.捞豆备用
将上述适度破碎的浸泡好的大豆去水留（或取）豆，将大豆吸水膨胀用不完的多余水放出，导入它罐以备重复利用。
用途用法：纳豆激酶的固态发酵：按上述制备方法制备需用量的培养基，向其中加入无菌水至含水量达65%后接种发酵即可。
纳豆菌发酵试验结果：向上述培养基中接入适量纳豆菌进行固态发酵，可得纳豆激酶酶活比传统培养基高48%的制品。
实施例2：
与实施例1的步骤相同，所不同的是：
⑴生产纳豆激酶的培养基配方（g/l）：预处理大豆990、葡萄糖50、蔗糖1、多胨1、胰蛋白胨1、甘氨酸1、丙氨酸1、丝氨酸1、赖氨酸1、天门冬氨酸1、组氨酸1、亮氨酸1、大豆蛋白肽0.01、胶原蛋白肽0.01、生物素0.001、vc0.01、ve0.01、vb50.01、烟酸0.01、烟酰胺0.01、牛磺酸0.01、l-半胱氨酸或其盐酸盐0.01、l-胱氨酸0.01、肝素钠0.01、精氨酸0.01、谷氨酸0.01、吐温-800.01、酪蛋白酸钠0.5、烷基糖苷apg0.5、辅酶q100.01、mgso4·7h2o0.1、cacl20.1，ph值6.8。
⑵用途用法为：纳豆激酶的固态发酵：按上述制备方法制备需用量的培养基，向其中加入无菌水至含水量达50%后接种发酵即可。
纳豆菌发酵试验结果：向上述培养基中接入适量纳豆菌进行固态发酵，可得纳豆激酶酶活比传统培养基高5%的制品。
实施例3：
与实施例1的步骤相同，所不同的是：
⑴生产纳豆激酶的培养基配方（g/l）：预处理大豆600、葡萄糖1、蔗糖50、多胨70、胰蛋白胨60、甘氨酸80、丙氨酸60、丝氨酸60、赖氨酸60、天门冬氨酸60、组氨酸60、亮氨酸58、大豆蛋白肽8.0、胶原蛋白肽8.0、生物素2.0、vc5.0、ve5.0、vb58.0、烟酸5.0、烟酰胺5.0、牛磺酸5.0、l-半胱氨酸或其盐酸盐5.0、l-胱氨酸5.0、肝素钠5.0、精氨酸5.0、谷氨酸5.0、吐温-805.0、酪蛋白酸钠20.0、烷基糖苷apg18.0、辅酶q105.0、mgso4·7h2o8、cacl25，ph值7.6。
⑵用途用法为：纳豆激酶的固态发酵：按上述制备方法制备需用量的培养基，向其中加入无菌水至含水量达80%后接种发酵即可。
纳豆菌发酵试验结果：向上述培养基中接入适量纳豆菌进行固态发酵，可得纳豆激酶酶活比传统培养基高32%左右的制品。
实施例4：
与实施例1的步骤相同，所不同的是：
⑴生产纳豆激酶的培养基配方（g/l）：预处理大豆900、葡萄糖1、蔗糖50、多胨70、胰蛋白胨60、甘氨酸80、丙氨酸60、丝氨酸60、赖氨酸60、天门冬氨酸60、组氨酸60、亮氨酸58、大豆蛋白肽8.0、胶原蛋白肽8.0、生物素2.0、vc5.0、ve5.0、vb58.0、烟酸5.0、烟酰胺5.0、牛磺酸5.0、l-半胱氨酸或其盐酸盐5.0、l-胱氨酸5.0、肝素钠5.0、精氨酸5.0、谷氨酸5.0、吐温-805.0、酪蛋白酸钠20.0、烷基糖苷apg18.0、辅酶q105.0、mgso4·7h2o8、cacl25，ph值7.6。
⑵用途用法为：纳豆激酶的液态发酵：按上述制备方法制备需用量的固态培养基，在无菌条件下用无菌水将其稀释30倍后接种发酵即可。
纳豆菌发酵试验结果：向上述培养基中接入适量纳豆菌进行液态发酵，可得纳豆激酶酶活比传统培养基高18%的制品。
实施例5：
与实施例1的步骤相同，所不同的是：
⑴生产纳豆激酶的培养基配方（g/l）：预处理大豆600、葡萄糖1、蔗糖50、多胨70、胰蛋白胨60、甘氨酸80、丙氨酸60、丝氨酸60、赖氨酸60、天门冬氨酸60、组氨酸60、亮氨酸58、大豆蛋白肽8.0、胶原蛋白肽8.0、生物素2.0、vc5.0、ve5.0、vb58.0、烟酸5.0、烟酰胺5.0、牛磺酸5.0、l-半胱氨酸或其盐酸盐5.0、l-胱氨酸5.0、肝素钠5.0、精氨酸5.0、谷氨酸5.0、吐温-805.0、酪蛋白酸钠20.0、烷基糖苷apg18.0、辅酶q105.0、mgso4·7h2o8、cacl25，ph值7.4。
⑵用途用法为：纳豆激酶的液态发酵：按上述制备方法制备需用量的固态培养基，在无菌条件下用无菌水将其稀释10倍后接种发酵即可。
纳豆菌发酵试验结果：向上述培养基中接入适量纳豆菌进行液态发酵，可得纳豆激酶酶活比传统培养基高47.8%的制品。
实施例6：
与实施例1的步骤相同，所不同的是：
⑴生产纳豆激酶的培养基配方（g/l）：预处理大豆600、葡萄糖1、蔗糖50、多胨70、胰蛋白胨60、甘氨酸80、丙氨酸60、丝氨酸60、赖氨酸60、天门冬氨酸60、组氨酸60、亮氨酸58、大豆蛋白肽8.0、胶原蛋白肽8.0、生物素2.0、vc5.0、ve5.0、vb58.0、烟酸5.0、烟酰胺5.0、牛磺酸5.0、l-半胱氨酸或其盐酸盐5.0、l-胱氨酸5.0、肝素钠5.0、精氨酸5.0、谷氨酸5.0、吐温-805.0、酪蛋白酸钠20.0、烷基糖苷apg18.0、辅酶q105.0、mgso4·7h2o8、cacl25，ph值7.6。
⑵用途用法为：纳豆激酶的液态发酵：按上述制备方法制备需用量的固态培养基，在无菌条件下用无菌水将其稀释20倍后接种发酵即可。
纳豆菌发酵试验结果：向上述培养基中接入适量纳豆菌进行液态发酵，可得纳豆激酶酶活比传统培养基高26%的制品。
实施例7：
与实施例1的步骤相同，所不同的是：
⑴培养基配方（g/l）：预处理大豆850、葡萄糖1、蔗糖50、多胨70、胰蛋白胨60、甘氨酸80、丙氨酸60、丝氨酸60、赖氨酸60、天门冬氨酸60、组氨酸60、亮氨酸58、大豆蛋白肽8.0、胶原蛋白肽8.0、生物素2.0、vc5.0、ve5.0、vb58.0、烟酸5.0、烟酰胺5.0、牛磺酸5.0、l-半胱氨酸或其盐酸盐5.0、l-胱氨酸5.0、肝素钠5.0、精氨酸5.0、谷氨酸5.0、吐温-805.0、酪蛋白酸钠20.0、烷基糖苷apg18.0、辅酶q105.0、mgso4·7h2o8、cacl25，ph值7.2。
⑵用途用法为：实验室中纳豆激酶产生菌的富集和培养：按上述制备方法制备需用量的培养基，向其中加入无菌水至含水量达60%后接种发酵即可；或按上述制备方法制备需用量的固态培养基，在无菌条件下用无菌水将其稀释20倍后接种发酵即可。