一种含血清的角膜上皮细胞培养液的制作方法

本发明涉及生物医学领域，尤其涉及一种含血清的角膜上皮细胞培养液。

背景技术：

角膜由外而内依次包括：上皮层、前弹力层(bowman膜)、基质层、后弹力层(decemet膜)和内皮层。角膜上皮层厚约50～60μm，占整个角膜厚度的10%，角膜上皮细胞间以桥粒相互连接，构成致密坚固的质膜，成为角膜的第一道屏障。角膜上皮层具有保护眼球，稳定泪膜，维持角膜透明性等功能，是一种不断自我更新的组织。角膜上皮细胞的体外培养对研究角膜的生理学、病理学、免疫学以及分子生物学都是极为重要的手段，常用于细胞代谢产物、病毒感染、各种生长因子和药物对细胞生长的影响的研究。角膜上皮细胞的培养成功也为多种眼部疾病如眼表泪液病、无虹膜、化学和热烧伤、辐射损害、stevens-johnson综合征、眼瘢痕性天疱疮等的移植治疗开拓了广阔前景。另外，近年来随着体外器官培养技术的发展，利用体外培养的角膜上皮细胞来构建三维角膜模型，从而应用到体外化学品的眼刺激潜在危害性的评估，与其他的体外替代眼刺激评估方法相比，基于体外细胞培养构建的3d重组角膜上皮模型的眼刺激风险评价表现出特有的优势，首先体外构建的3d角膜模型更类似于人体角膜上皮的细胞三维结构，不仅可以更为真实的反映人体对化学物的响应，准确给出化学物刺激性的预测，而且化合物筛选的种类也具有更宽的应用范畴，不仅适用于化妆品原料的危害评价，还可以用于不同剂型的化妆品成品的危害评估。目前，角膜上皮细胞是构建体外三维角膜上皮组织模型最理想的种子细胞，构建的三维角膜模型的生物学特性更能反映真实的角膜组织。然而由于分化后的角膜上皮细胞体外生长的生命周期很短，只能传2～3代，获得的细胞数量少，花费较高，限制了角膜组织的研究和组织工程化角膜的构建。因此如何改进体外培养技术，培养出分裂增殖能力强、能不断分裂生长的角膜上皮细胞，以补充细胞的不断更新，成为获得角膜上皮种子细胞的首要任务。

现如今，角膜上皮细胞的体外培养方法有组织块法和细胞悬液法。组织块法是直接将取到的角膜缘剪成大小均匀的组织块，上皮面朝下培养在载体膜表面，培养的角膜缘上皮细胞就会向外迁移扩增，最后形成一个组织薄片，它的优点在于培养出的细胞可以较好的保持其自身生物学特性，细胞生长旺盛；缺点在于培养过程中杂质细胞尤其是成纤维细胞的污染率较高。细胞悬液法是将取自角膜缘的组织经过消化酶如胰酶、dispaseⅱ酶等消化成单个细胞，配成细胞悬液，然后以3t3作为滋养层的技术来进行的，但由于滋养细胞的存在干扰检测试验结果的分析。而且，许多研究者相信3t3细胞和人细胞共同培养有可能引起突变或异种蛋白对人角质形成细胞（keratinocyte,kc）的转染，强调在移植手术中尽量不用滋养层培养上皮细胞。为了避免使用滋养层，人们开发了多种方法：如培养皿表面涂细胞基质成份；不同浓度的钙和各种生物提取物的添加；促分裂物和微量元素的添加。

角膜上皮细胞的培养基包括含血清培养基和无血清培养基，对于无血清培养基，研究发现，尽管在无血清体系中添加多种类型的细胞生长因子如egf、胰岛素、牛垂体提取液、氢化泼尼松、转铁蛋白和霍乱毒素，但是远远不能满足血清中复杂的营养成份以及其比例，特别是对于原代角膜上皮细胞，在无饲养层无血清的条件下很难培养成功，对于传代细胞，无血清培养体系培养时生长缓慢，原有的干细胞特性下降，容易出现老化现象，很难大量扩增。细胞在体外的生长和增殖的环境应接近体内的生理环境，培养条件越接近组织赖以生存的自然环境，培养出的细胞就越近似于正常组织细胞。因此来自动物血液的血清是体外培养各类细胞的主要营养物质，血清为机体细胞提供了基本的营养成分、各种激素、生长因子和所需的结合蛋白。因此血清是角膜上皮体外培养中使用最广泛的天然培养基，大部分角膜上皮细胞的体外培养都要使用血清。1991年，kruse等的研究结果亦证实，角膜缘上皮细胞的增殖能力受血清的影响，具有血清浓度依赖性。血清的浓度对细胞的增殖也有较大的影响，一般在细胞培养液中添加5%～20%的血清。在角膜上皮细胞的原代培养中，在不添加其他营养物质和促细胞生长因子时，血清浓度过低时将很难促进细胞贴壁和增殖。然而又有研究发现，血清影响角膜上皮细胞的增殖分化，细胞传代培养过程出，细胞增殖率显著性地降低，主要原因是血清促进了细胞分化，从而抑制了细胞的增殖，例如2009年ma等比较了含胎牛血清与不含胎牛血清的低钙培养基对小鼠角膜上皮细胞生长与分化的影响，发现胎牛血清可抑制小鼠角膜上皮细胞增生。

技术实现要素：

在本发明实施例提供了一种含血清的角膜上皮细胞培养液，主要针对无血清培养体系下，角膜上皮细胞生长缓慢、原有的干细胞特性下降、容易出现老化现象、很难大量扩增和含10%血清的无滋养层培养方法培养角膜上皮细胞时出现细胞复层化等一系列问题，本发明实施例提供的含血清的角膜上皮细胞培养液通过添加血清、细胞生长所需的营养因子及细胞增殖分化的调节因子，既满足了原代角膜上皮细胞高密度增殖角膜上皮细胞的需要，又避免了上皮细胞传代培养中过度分化而导致的细胞增殖抑制现象，有效的平衡了体外角膜上皮细胞的增殖及分化速度，降低了细胞的倍增时间，从而满足大规模的组织工程模型构建的需求。

为达到上述目的，本发明实施例采用如下技术方案：

本发明实施例提供一种含血清的角膜上皮细胞培养液，含血清的角膜上皮细胞培养液包括培养液1和培养液2。

本发明提供一种用于角膜上皮细胞培养的含血清培养基体系，培养液1为在基础培养基的基础上，添加浓度为10%-20%的胎牛血清，以及浓度为1-10μm的细胞增殖分化调节因子维甲酸和甘醇酸。

本发明提供一种用于角膜上皮细胞培养的含血清培养基体系，培养液1用于培养原代角膜上皮细胞。

本发明提供一种用于角膜上皮细胞培养的含血清培养基体系，培养液2为在基础培养基的基础上，添加浓度为1%-5%的胎牛血清，浓度为1-5μm细胞增殖分化调节因子维甲酸、甘醇酸、rock抑制剂y27632和cacl2；浓度为5-15μg/ml的胰岛素和转铁蛋白；浓度为5-20ng/ml的表皮生长因子egf、胰岛素生长因子igf-i、转化生长因子tgfβ、牛垂体提取物（bpe）、贴壁因子纤连蛋白。

本发明提供一种用于角膜上皮细胞培养的含血清培养基体系，培养液2用于培养传代角膜上皮细胞，从而保证角膜上皮细胞高密度地增殖，保持干细胞特性，同时避免细胞过度分化。

本发明提供一种用于角膜上皮细胞培养的含血清培养基体系，基础培养液均是k-sfm或mcdb153或体积比为1∶3的f12和dmem混合培养液。

优选的，培养液1中胎牛血清浓度为10%，培养液2中胎牛血清浓度为2.5%。

优选的，培养液1中细胞增殖分化的调节因子维甲酸和甘醇酸的浓度为5μm。

优选的，培养液2中细胞增殖分化的调节因子维甲酸、甘醇酸、rock抑制剂y27632和cacl2的浓度为5μm。优选的，培养液2中表皮生长因子egf、胰岛素生长因子igf-i、转化生长因子tgfβ、bpe和贴壁因子纤连蛋白的浓度为10ng/ml。

优选的，培养液2中胰岛素和转铁蛋白的浓度为10μg/ml。

本发明进一步提供一种含血清的角膜上皮细胞培养基体系的配制方法，包括以下步骤：

培养液1的配制方法：

在k-sfm或mcdb153或体积比为1∶3混合的f12和dmem三种培养液中的任意一种中，添加浓度为1-10μm的细胞增殖分化调节因子维甲酸和甘醇酸，再再添加浓度为5%~20%的胎牛血清后形成的。

培养液2的配制方法：

在k-sfm或mcdb153或体积比为1∶3混合的f12和dmem三种培养液中的任意一种中，添加浓度为1-5μm的细胞增殖分化调节因子维甲酸、甘醇酸、rock抑制剂y27632和cacl2，浓度为5-15μg/ml的胰岛素和转铁蛋白，以及浓度为5-20ng/ml的表皮生长因子egf、胰岛素生长因子igf-i、转化生长因子tgfβ、bpe和贴壁因子纤连蛋白，再添加浓度为0.5%~5%的胎牛血清后形成的。

本发明提供的的含血清培养基体系的主要特色在于：

（1）开发两个系列的含血清角膜上皮细胞的培养液

基于原代角膜上皮细胞在无血清培养体系中很难培养成功和传代细胞在高浓度血清体系下复层化等问题，开发含低浓度血清和高浓度血清两个系列的含血清培养基体系，用于角膜上皮细胞的体外扩增培养，从而满足角膜上皮细胞在体外的大规模培养的需求。

（2）不同浓度血清和细胞营养因子的协同营养作用

在两个系列的含血清培养体系中，通过调整血清含量和细胞营养因子含量，从而实现血清和其他细胞营养因子协同作用，为细胞生长提供营养，促进角膜上皮细胞的生长及增殖。；

（3）补充多种细胞增殖分化的调节剂

本发明采用这两种细胞增殖分化调节因子的共协同作用来实现细胞增殖分化的调节，从而使得细胞保持原有的特性，避免过度分化。

附图说明

图1为本发明实施例提供的不同培养体系培养原代角膜上皮细胞时，细胞数的变化情况比较；

图2为本发明实施例提供的不同培养基体系下培养角膜上皮细胞时传代细胞代次的比较结果。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行详细地描述。

需要说明的是，本发明实施例中使用的k-sfm、f12/dmem、mcdb153均购自gibco公司，胰岛素、转铁蛋白、表皮生长因子egf、胰岛素生长因子igf-i、转化生长因子tgfβ、贴壁因子纤连蛋白、cacl2、甘醇酸、维甲酸以及rock抑制剂y27632均购自sigma公司，牛垂体提取物（bpe）为本公司自行提取的。

实施例1

本发明实施例提供一种含血清的角膜上皮细胞培养液，含血清的角膜上皮细胞培养液包括培养液1和培养液2；

其中，培养液1包括基础培养基、浓度为10%-20%的胎牛血清，以及浓度为1-10μm的细胞增殖分化调节因子维甲酸和甘醇酸，培养液1用于培养原代角膜上皮细胞；

培养液2包括基础培养基、浓度为1%-5%的胎牛血清，浓度为1-5μm的细胞增殖分化的调节因子维甲酸、甘醇酸、rock抑制剂y27632和cacl2，浓度为5-15μg/ml的胰岛素和转铁蛋白，以及浓度为5-20ng/ml的表皮生长因子egf、胰岛素生长因子igf-i、转化生长因子tgfβ、牛垂体提取物bpe和贴壁因子纤连蛋白，培养液2用于培养经过培养液1培养后的传代角膜上皮细胞。

需要说明的是，基础培养液为k-sfm培养液或者mcdb153培养液或者f12/dmem培养液，其中，f12/dmem培养液是f12培养液和dmem培养液以体积比1:3的比例混合的。

示例性的，在第一种可能的实现方式中，本发明实施例提供的含血清的角膜上皮细胞培养液可以包括：

培养液1的配制：

以体积比为1:3的f12/dmem混合液作为基础培养基，配制1l含高浓度血清、细胞增殖分化调节因子的培养体系，具体配制过程如下：

（1）在超净工作台中用无菌去离子水配制10mm的甘醇酸和维甲酸的母液；

（2）将购自gibco的f12/dmem（1:3）粉末培养基倒入装有800ml去离子水的2l烧杯中，然后将烧杯置于搅拌机上，搅拌2h待溶解后，用0.22μm的过滤器过滤除菌，得基础培养液；

（3）在超净工作台中向上述步骤2所得基础培养液中添加步骤1甘醇酸和维甲酸的母液，使得甘醇酸和维甲酸的浓度为1μm；

（4）最后，在超净工作台中添加浓度为10%的胎牛血清，密封好后放置于4℃冰箱中备用。

培养液2的配制：

以mcdb153作为基础培养基配制1l含低浓度血清、多种细胞营养因子和细胞增殖分化调节因子的培养体系，具体配制过程如下：

（1）在超净工作台中用无菌去离子水配制各种细胞营养因子和细胞增殖分化调节因子的母液，其中胰岛素和转铁蛋白的母液浓度均为10mg/ml，表皮生长因子egf、胰岛素生长因子igf-i、转化生长因子tgfβ、bpe和贴壁因子纤连蛋白的母液浓度均为10mg/ml，细胞增殖分化调节因子维甲酸、甘醇酸、rock抑制剂y27632和cacl2的母液浓度为10mm；

（2）将购自gibco的mcdb153粉末培养基倒入装有800ml去离子水的2l烧杯中，然后将烧杯置于搅拌机上，搅拌2h待溶解后，用0.22μm的过滤器过滤除菌，得基础培养液；

（3）在超净工作台中向上述步骤2所得基础培养液中添加步骤1所得细胞营养因子和增殖分化调节因子母液，使得维甲酸、甘醇酸、rock抑制剂y27632的浓度为2.5μm；cacl2的浓度为1μm；胰岛素和转铁蛋白浓度为15μg/ml；表皮生长因子egf、胰岛素生长因子igf-i、转化生长因子tgfβ、bpe和贴壁因子纤连蛋白的浓度为20ng/ml，搅拌均匀；

（4）最后，在超净工作台中添加浓度为1%的胎牛血清，密封好后放置于4℃冰箱中备用。

示例性的，在第二种可能的实现方式中，本发明实施例提供的含血清的角膜上皮细胞培养液可以包括：

培养液1的配制：

以k-sfm作为基础培养基，配制1l含高浓度血清、细胞增殖分化调节因子的培养体系，具体配制过程如下：

（1）先在超净工作台中用无菌去离子水配制10mm的维甲酸和甘醇酸的母液；

（2）将购自gibco的k-sfm粉末培养基倒入装有800ml去离子水的2l烧杯中，然后将烧杯置于搅拌机上，搅拌2h待溶解后，用0.22μm的过滤器过滤除菌，得基础培养液；

（3）在超净工作台中向在上述步骤2所得基础培养液中添加步骤1维甲酸和甘醇酸的母液，使得维甲酸和甘醇酸的浓度为10μm；

（4）最后，在超净工作台添加浓度为20%的胎牛血清，密封好后放置于4℃冰箱中备用。

培养液2的配制：

以mcdb153作为基础培养基配制1l含低浓度血清、多种细胞营养因子和细胞增殖分化调节因子的培养体系，具体配制过程如下：

（1）在超净工作台中用无菌去离子水配制各种细胞营养因子和细胞增殖分化调节因子的母液，其中胰岛素和转铁蛋白的母液浓度均为10mg/ml，表皮生长因子egf、胰岛素生长因子igf-i、转化生长因子tgfβ、bpe和贴壁因子纤连蛋白的母液浓度均为10mg/ml，细胞增殖分化调节因子维甲酸、甘醇酸、rock抑制剂y27632和cacl2的母液浓度为10mm；

（2）将购自gibco的mcdb153粉末培养基倒入装有800ml去离子水的2l烧杯中，然后将烧杯置于搅拌机上，搅拌2h待溶解后，用0.22μm的过滤器过滤除菌，得基础培养液；

（3）在超净工作台中向在上述步骤2所得基础培养液中添加步骤1所得细胞营养因子和增殖分化调节因子母液，使得维甲酸、甘醇酸、rock抑制剂y27632的浓度为1μm；cacl2的浓度为2.5μm；胰岛素和转铁蛋白浓度为5μg/ml；表皮生长因子egf、胰岛素生长因子igf-i、转化生长因子tgfβ、bpe和贴壁因子纤连蛋白的浓度为5ng/ml，搅拌混匀；

（4）最后，在超净工作台中添加浓度为5%的胎牛血清，密封好后放置于4℃冰箱中备用。

示例性的，在第三种可能的实现方式中，本发明实施例提供的含血清的角膜上皮细胞培养液可以包括：

培养液1的配制：

以mcdb153作为基础培养基，配制1l含高浓度血清、细胞增殖分化调节因子的培养体系，具体配制过程如下：

（1）先在超净工作台中用无菌去离子水配制10mm的甘醇酸和维甲酸的母液；

（2）在超净工作台中向将购自gibco的mcdb153粉末培养基倒入装有800ml去离子水的2l烧杯中，然后将烧杯置于搅拌机上，搅拌2h待所有成份溶解后，用0.22μm的过滤器过滤除菌，得基础培养液；

（3）在超净工作台中向上述步骤2所得基础培养液中添加步骤1维甲酸和甘醇酸的母液，使得维甲酸、甘醇酸浓度为5μm；

（4）最后，在超净工作台中添加浓度为15%的胎牛血清，密封好后放置于4℃冰箱中备用。

培养液2的配制：

以f12/dmem（1:3）作为基础培养基配制1l含低浓度血清、多种细胞营养因子和细胞增殖分化调节因子的培养体系，具体配制过程如下：

（1）在超净工作台中用无菌去离子水配制各种细胞营养因子和细胞增殖分化调节因子的母液，其中胰岛素和转铁蛋白的母液浓度均为10mg/ml，表皮生长因子egf、胰岛素生长因子igf-i、转化生长因子tgfβ和贴壁因子纤连蛋白的母液浓度均为10mg/ml，细胞增殖分化调节因子维甲酸、甘醇酸、rock抑制剂y27632和cacl2的母液浓度为10mm；

（2）将购自gibco的f12/dmem（1:3）粉末培养基倒入装有800ml去离子水的2l烧杯中，然后将烧杯置于搅拌机上，搅拌2h待溶解后，用0.22μm的过滤器过滤除菌，得基础培养液；

（3）在超净工作台中向上述步骤2所得基础培养液中添加步骤1所得细胞营养因子和增殖分化调节因子母液，使得维甲酸、甘醇酸、rock抑制剂y27632的浓度为5μm；cacl2的浓度为5μm；胰岛素和转铁蛋白的浓度为10μg/ml；表皮生长因子egf、胰岛素生长因子igf-i、转化生长因子tgfβ、bpe和贴壁因子纤连蛋白的浓度为10ng/ml，搅拌混匀；

（4）最后，在超净工作台中添加浓度为2.5%的胎牛血清，密封好后放置于4℃冰箱中备用。

需要补充的是，采用上述实施例任一实现方式中培养液，其中培养液1用于培养原代角膜上皮细胞，培养液2用于经过培养液1培养后的传代角膜上皮细胞的培养。即将第二代的角膜上皮细胞从培养液1转入培养液2中进行培养。

实施例2

采用无血清培养基、含10%血清培养基和本发明的培养液培养原代角膜上皮细胞的比较研究：

实验操作方法：

在超净工作台上将获得的兔眼球用pbs冲洗2～3次，沿角膜缘取下完整角膜，用dmem/f12培养液冲洗1～2次；在50mm培养皿中加1ml的4mg/mldispaseⅱ，将上述处理过的兔眼角膜上皮面朝下置于消化液中，培养箱中消化15min后翻转角膜片，然后分离上皮层。pbs轻轻冲洗上皮层后，置于0.25%胰蛋白酶中，37℃消化约20min，终止消化，吹打成单细胞悬液，离心弃掉上清后，分别用加了多种营养因子的无血清培养基、只含10%血清的培养基和本发明提供的培养液1重悬细胞，然后按照3e4个/孔的细胞密度接种与6孔板中，置于37℃，5%co2培养箱培养，每2d更换1次培养液。培养至第6天时观察细胞状态，培养过程中每隔2天消化细胞形成细胞悬液，进行细胞计数分析。

实验结果显示，无血清体系下培养的原代角膜上皮细胞增殖速度很慢，而本发明的培养液1与含10%血清的培养基培养的原代角膜上皮细胞增殖速度很快，从第2天开始时，细胞呈现指数形式增殖（如图1所示）。

实施例3

采用含10%血清的培养基与本发明提供的培养液培养角膜上皮细胞的比较研究：

实验操作方法：

在超净工作台上将获得的兔眼球用pbs冲洗2～3次，沿角膜缘取下完整角膜，用dmem/f12培养液冲洗1～2次；在50mm培养皿中加1ml的4mg/mldispaseⅱ，将上述处理过的兔眼角膜上皮面朝下置于消化液中，培养箱中消化15min后翻转角膜片，然后分离上皮层。pbs轻轻冲洗上皮层后，置于0.25%胰蛋白酶中，37℃消化约20min，终止消化，吹打成单细胞悬液，离心弃掉上清后，分别接种于含10%血清培养基体系和本发明提供的培养液中，置于37℃，5%co2培养箱培养，每2d更换1次培养液，培养至细胞融合度达到80%-90%时，用胰蛋白酶消化进行传代培养，其中，原代培养时采用本发明提供的的培养液1，从第二代开始，采用本发明提供的培养液2进行传代培养，而另一组的原代和传代培养角膜上皮细胞的过程中均使用含10%血清的培养基培养。记录细胞最多的传代代数，并分析细胞状态。

结果显示，采用含10%血清的培养基体系培养原代细胞时，与本发明提供的培养液培养时的细胞增殖速度相似，细胞状态均良好；但在传代培养过程中，当传代培养至第5代时，含10%血清培养基体系的细胞增殖速度逐渐降低，细胞形态逐渐出现分支状，开始分化，而由于本发明提供的角膜上皮细胞已经转入了培养液2中进行培养，因此角膜上皮细胞传代至14代时细胞才开始出现分支状，增殖速度下降（如图2所示）。

本发明实施例提供一种含血清的角膜上皮细胞培养液，含血清的角膜上皮细胞培养液包括培养液1和培养液2；其中，培养液1包括基础培养基、浓度为10%-20%的胎牛血清，以及浓度为1-10μm的细胞增殖分化调节因子维甲酸和甘醇酸，培养液1用于培养原代角膜上皮细胞；培养液2包括基础培养基、浓度为1%-5%的胎牛血清，浓度为1-5μm的细胞增殖分化的调节因子维甲酸、甘醇酸、rock抑制剂y27632和cacl2，浓度为5-15μg/ml的胰岛素和转铁蛋白，以及浓度为5-20ng/ml的表皮生长因子egf、胰岛素生长因子igf-i、转化生长因子tgfβ、牛垂体提取物bpe和贴壁因子纤连蛋白，培养液2用于培养经过培养液1培养后的传代角膜上皮细胞。含血清的角膜上皮细胞培养液主要针对无血清培养体系下，角膜上皮细胞生长缓慢、原有的干细胞特性下降、容易出现老化现象、很难大量扩增和含10%血清的无滋养层培养方法培养角膜上皮细胞时出现细胞复层化等一系列问题，能够通过添加血清、细胞生长因子及细胞增殖分化的调节因子，既满足了原代角膜上皮细胞高密度增殖的需要，又避免了上皮细胞传代培养中过度分化而导致的细胞增殖抑制现象，有效的平衡了体外角膜上皮细胞的增殖及分化速度，降低了细胞的倍增时间，从而满足大规模的组织工程模型构建的需求。

以上所述，仅为本申请的具体实施方式，但本申请的保护范围并不局限于此，任何在本申请揭露的技术范围内的变化或替换，都应涵盖在本申请的保护范围之内。因此，本申请的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。