人支气管上皮细胞分化培养及鉴定方法与流程

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种人支气管上皮细胞分化培养及鉴定方法。

背景技术：

人支气管上皮细胞主要功能：(1)支气管表面的上皮细胞构成了基底柱状结构，清除粘液纤毛。(2)由纤毛、无纤毛和能分泌黏液的细胞等混合细胞群组成物理屏障，可有效防止多种有毒物质。(3)产生和分泌大量化学介质和细胞因子形成高度复杂的宿主防御系统。人支气管上皮细胞与主要病理生理疾病有关，如支气管肺癌(多简称为肺癌)、慢性支气管炎、支气管扩张、支气管狭窄。为了获得体外稳定传代的人正常支气管上皮细胞，使人们可以更全面地研究细胞的正常功能，疾病发病机理，组织器官功能重建或再造，以及测定药物对正常细胞的毒性，研究人员做出了大量的工作。目前，传统培养方法主要为：原代细胞的分离培养、ali培养基添加成分、预铺胶原类型的选择、细胞的接种密度等各不相同。传统培养方法缺陷在于：体外培养人支气管细胞存活率低、获取的原代细胞不纯，有混杂细胞干扰，传统培养方法获取的细胞在细胞形态、功能等方面，都与体内支气管上皮细胞差别很大。

因此，非常有必要提供一种人支气管上皮细胞分化培养及鉴定方法，获得存活率高、少混杂细胞干扰的原代细胞，以建立并优化人支气管上皮细胞体外培养模型。

技术实现要素：

针对现有技术中的缺陷，本发明提供人支气管上皮细胞分化培养及鉴定方法，以获得少混杂细胞干扰的原代细胞。

第一方面，本发明提供人支气管上皮细胞分化培养方法，包括如下步骤：

s1、将人原代支气管上皮细胞在普通细胞培养板上培养8-15天后，用胰蛋白酶-edta消化液消化细胞孔3-7min；

s2、将步骤s1得到的料液离心机离心处理3-7min，除去上清液后，首次加入begm培养基，混匀，再利用离心机离心3-7min，再次加入begm培养基，吹打均匀，获得可接种细胞；

s3、将步骤s2得到的可接种细胞接种到培养板上，接种以后，顶部加含begm培养基，基底部加含begm培养基，培养3-5天，细胞贴壁以后，顶部和基底部再次加入bebm培养基，并分别添加500nm维甲酸，培养45-50小时，然后吸出培养基；

s4、只向步骤s3得到的培养细胞的基底部添加加有100nm维甲酸的培养基，隔天换液，培养9天以后，得到体外培养的人支气管上皮细胞。

本发明中，作为一种优选的技术方案，步骤s1中，所述胰蛋白酶-edta消化液的质量分数为0.25％。

本发明中，作为一种优选的技术方案，步骤s2中，再次加入begm培养基与首次加入begm培养基的体积比为4：1。

本发明中，作为一种优选的技术方案，步骤s3中，含begm培养基包括begm培养基、牛垂体分泌物、bsa和抗菌素。

本发明中，作为一种优选的技术方案，步骤s3中，所述培养板采用直径12mm、孔径0.4um的transwell培养板。

本发明中，作为一种优选的技术方案，步骤s3中，细胞接种密度10万/孔。

本发明中，作为一种优选的技术方案，步骤s3中，顶部加含begm培养基与基底部加含begm培养基的体积比为1：2。

本发明中，作为一种优选的技术方案，人支气管上皮细胞分化培养方法的详细步骤为：

将人原代支气管上皮细胞在普通细胞培养板上培养10天后，用0.25wt％胰蛋白酶-edta消化液消化细胞孔5min，离心机离心5min，去上清后加入1mlbegm培养基，混匀，离心机离心5min，加入begm培养基，吹打均匀，获得可接种的细胞；采用直径12mm、孔径0.4um的transwell培养板，细胞接种密度10万/孔，接种以后，顶部加0.5ml含begm培养基，基底部加1ml含begm培养基，培养3天，细胞贴壁以后，顶部和基底部加入bebm培养基，并分别添加500nm维甲酸，培养48h；然后吸出培养基，以后只向基底部添加加有100nm维甲酸的培养基，隔天换液，培养9天以后，得到体外培养的人支气管上皮细胞。

begm培养基和bebm培养基均为市售，例如begm培养基为clonetics,cc-3170；bebm培养基为clonetics,cc-3171；bsa为integren,3310-80。

第二方面，本发明提供的对分化培养的人支气管上皮细胞的鉴定方法，包括免疫学鉴定法、试剂盒鉴定法和分子生物学鉴定法。

所述免疫学鉴定法为：分化培养过程中，可针对纤毛细胞特有的标记物β-tubuliniv做免疫组化来鉴定；所述试剂盒鉴定法为：用muc5ac检测试剂盒来鉴定分化出来的杯状细胞；所述分子生物学鉴定法为：采用qpcr技术检测分化培养为纤毛细胞和杯状细胞的能力。

由于采用以上技术方案，本发明具有如下有益效果：

本发明能够实现体外培养得到人支气管细胞，而且存活率高、减少混杂细胞干扰，建立并优化人支气管上皮细胞体外培养模型。

附图说明

图1为本发明分化培养的人支气管上皮细胞在显微镜下观察到的影像图；

图2为实施例3进行免疫鉴定法得到的影像图。

具体实施方式

下面将结合具体实施例对本发明技术方案进行详细的描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，因此只作为示例，而不能以此来限制本发明的保护范围。

实施例1

人支气管上皮细胞分化培养方法，包括如下步骤：

s1、将人原代支气管上皮细胞在普通细胞培养板上培养8天后，用胰蛋白酶-edta消化液消化细胞孔3min，所述胰蛋白酶-edta消化液的质量分数为0.25％；

s2、将步骤s1得到的料液离心机离心处理3min，除去上清液后，首次加入begm培养基，混匀，再利用离心机离心3min，再次加入begm培养基，吹打均匀，获得可接种细胞，其中，再次加入begm培养基与首次加入begm培养基的体积比为4：1；

s3、将步骤s2得到的可接种细胞接种到培养板上，采用直径12mm、孔径0.4um的transwell培养板，细胞接种密度10万/孔，接种以后，顶部加含begm培养基(含begm培养基包括begm培养基、牛垂体分泌物、bsa和抗菌素)，基底部加含begm培养基(含begm培养基包括begm培养基、牛垂体分泌物、bsa和抗菌素)，顶部加含begm培养基与基底部加含begm培养基的体积比为1：2，培养3天，细胞贴壁以后，顶部和基底部再次加入bebm培养基，并分别添加500nm维甲酸，培养45小时，然后吸出培养基；

s4、只向步骤s3得到的培养细胞的基底部添加加有100nm维甲酸的培养基，隔天换液，培养9天以后，得到体外培养的人支气管上皮细胞。

实施例2

人支气管上皮细胞分化培养方法，包括如下步骤：

s1、将人原代支气管上皮细胞在普通细胞培养板上培养15天后，用胰蛋白酶-edta消化液消化细胞孔7min，所述胰蛋白酶-edta消化液的质量分数为0.25％；

s2、将步骤s1得到的料液离心机离心处理7min，除去上清液后，首次加入begm培养基，混匀，再利用离心机离心7min，再次加入begm培养基，吹打均匀，获得可接种细胞，其中，再次加入begm培养基与首次加入begm培养基的体积比为4：1；

s3、将步骤s2得到的可接种细胞接种到培养板上，采用直径12mm、孔径0.4um的transwell培养板，细胞接种密度10万/孔，接种以后，顶部加含begm培养基，基底部加含begm培养基(含begm培养基包括begm培养基、牛垂体分泌物、bsa和抗菌素)，培养5天，细胞贴壁以后，顶部和基底部再次加入bebm培养基，顶部加begm培养基与基底部加begm培养基的体积比为1：2，并分别添加500nm维甲酸，培养50小时，然后吸出培养基；

s4、只向步骤s3得到的培养细胞的基底部添加加有100nm维甲酸的培养基，隔天换液，培养9天以后，得到体外培养的人支气管上皮细胞。

实施例3

人支气管上皮细胞分化培养方法的详细步骤为：将人原代支气管上皮细胞在普通细胞培养板上培养10天后，用0.25wt％胰蛋白酶-edta消化液消化细胞孔5min，离心机离心5min，去上清后加入1mlbegm培养基，混匀，离心机离心5min，加入begm培养基，吹打均匀，获得可接种的细胞；采用直径12mm、孔径0.4um的transwell培养板，细胞接种密度10万/孔，接种以后，顶部加0.5ml含begm培养基(含begm培养基包括begm培养基、牛垂体分泌物、bsa和抗菌素)，基底部加1ml含begm培养基(含begm培养基包括begm培养基、牛垂体分泌物、bsa和抗菌素)，培养3天，细胞贴壁以后，顶部和基底部加入bebm培养基，并分别添加500nm维甲酸，培养48h；然后吸出培养基，以后只向基底部添加加有100nm维甲酸的培养基，隔天换液，培养9天以后，得到体外培养的人支气管上皮细胞。

实施例4

人支气管上皮细胞分化培养方法，包括如下步骤：

s1、将人原代支气管上皮细胞在普通细胞培养板上培养10天后，用胰蛋白酶-edta消化液消化细胞孔4min，所述胰蛋白酶-edta消化液的质量分数为0.25％；

s2、将步骤s1得到的料液离心机离心处理6min，除去上清液后，首次加入begm培养基，混匀，再利用离心机离心4min，再次加入begm培养基，吹打均匀，获得可接种细胞，其中，再次加入begm培养基与首次加入begm培养基的体积比为4：1；

s3、将步骤s2得到的可接种细胞接种到培养板上，采用直径12mm、孔径0.4um的transwell培养板，细胞接种密度10万/孔，接种以后，顶部加含begm培养基，基底部加含begm培养基(含begm培养基包括begm培养基、牛垂体分泌物、bsa和抗菌素)，培养3天，细胞贴壁以后，顶部和基底部再次加入bebm培养基，顶部加begm培养基与基底部加begm培养基的体积比为1：2，并分别添加500nm维甲酸，培养48小时，然后吸出培养基；

s4、只向步骤s3得到的培养细胞的基底部添加加有100nm维甲酸的培养基，隔天换液，培养9天以后，得到体外培养的人支气管上皮细胞。

实施例5

人支气管上皮细胞分化培养方法，包括如下步骤：

s1、将人原代支气管上皮细胞在普通细胞培养板上培养14天后，用胰蛋白酶-edta消化液消化细胞孔6min，所述胰蛋白酶-edta消化液的质量分数为0.25％；

s2、将步骤s1得到的料液离心机离心处理4min，除去上清液后，首次加入begm培养基，混匀，再利用离心机离心6min，再次加入begm培养基，吹打均匀，获得可接种细胞，其中，再次加入begm培养基与首次加入begm培养基的体积比为4：1；

s3、将步骤s2得到的可接种细胞接种到培养板上，采用直径12mm、孔径0.4um的transwell培养板，细胞接种密度10万/孔，接种以后，顶部加含begm培养基，基底部加含begm培养基(含begm培养基包括begm培养基、牛垂体分泌物、bsa和抗菌素)，培养4天，细胞贴壁以后，顶部和基底部再次加入bebm培养基，顶部加begm培养基与基底部加begm培养基的体积比为1：2，并分别添加500nm维甲酸，培养45小时，然后吸出培养基；

s4、只向步骤s3得到的培养细胞的基底部添加加有100nm维甲酸的培养基，隔天换液，培养9天以后，得到体外培养的人支气管上皮细胞。

以上实施例中，begm培养基和bebm培养基均为市售，其中，begm培养基为clonetics,cc-3170；bebm培养基为clonetics,cc-3171；bsa为integren,3310-80。

形态学上，分化培养第9天及以后，可以在倒置相差显微镜下看到分化的纤毛细胞的纤毛摆动(如图1所示)；分化培养过程中，用共聚焦显微镜可以看到分化培养支气管上皮细胞的三维结构和分化形态，与原代支气管上皮细胞和人体的支气管上皮细胞做对比，可鉴别，其中鉴别方法包括免疫学鉴定法、试剂盒鉴定法和分子生物学鉴定法。所述免疫学鉴定法为：分化培养过程中，可针对纤毛细胞特有的标记物β-tubuliniv做免疫组化来鉴定；所述试剂盒鉴定法为：用muc5ac检测试剂盒来鉴定分化出来的杯状细胞；所述分子生物学鉴定法为：采用qpcr技术检测分化培养为纤毛细胞和杯状细胞的能力。

以下免疫学鉴定法的实施例。

实施例3得到的人支气管上皮细胞继续培养28d后，将上皮细胞连同transwell培养套皿固定于4％多聚甲醛中，固定20min；pbs洗涤3次后，用0.2％triton-100透化处理2h；5％bsa室温下封闭1h；加入小鼠抗β-tubulinⅳ抗体(1︰500稀释)或小鼠抗mucin5ac抗体(1︰200稀释)，4℃孵育过夜；加入羊抗小鼠tirtc或羊抗小鼠fitc(均1︰200稀释)，37℃避光孵育1h；阴性对照组只加一抗，不加二抗；dapi复染细胞核，将transwell培养皿底部支持膜切下，封片后，使用蔡司共聚焦显微镜观察，结果如图2所示。

由结果可以看到，实施例3体外培养得到的人支气管上皮细胞存活率高、混杂细胞极少。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围，其均应涵盖在本发明的权利要求和说明书的范围当中。