本发明属于生物工程技术领域，尤其涉及一种日本医蛭唾液腺细胞的原代培养方法。
背景技术：
随着生命科学的迅速发展，不论对于整个生物工程技术，还是其中之一的生物克隆技术来说，细胞培养都是一个必不可少的过程，并推动着细胞生物学、分子生物学、生物化学等领域的发展。日本医蛭(hirudonipponia)属环节动物门，有环带亚门，蛭纲，无吻蛭目，医蛭科，医蛭属。据统计，分布在全世界的蛭类动物共有600多种，分布在我国的也有近100种。它们在江河、湿润的陆地以及田间生活，有的以取食鱼、蛙、水鸟及牛、马、人这样一些哺乳动物的血液为生，也有的靠取食蚯蚓、虾、螺、蚌之类的无脊椎动物的体液、组织以至整个身体而得以生存。以吸食哺乳动物血液为生，唾液腺分泌物中含有水蛭素等多种生物活性物质并且在医药上具有广阔应用前景的蛭类动物在国际上被统称为医学蛭类。研究发现，医学蛭类唾液腺分泌物中含有多种活性物质：水蛭素、水蛭透明质酸酶、安替斯塔辛、麻醉剂、血管扩张剂、前列腺素等。而日本医蛭作为天然水蛭素的重要来源之一，具有降血脂、保护心脑血管、抗凝血和抗肿瘤等功效，具有“软黄金”之称，更是具有重要的研究意义。目前国内国际上获取水蛭素的方法主要有两种，一种是直接从医蛭的唾液腺部位分离提取出天然水蛭素或者用精氨酸等刺激医蛭使其分泌唾液腺分泌，再使用特殊装置收集唾液，通过这种方法得到的天然水蛭素产量极小，耗费成本较高；另一种是通过基因工程的方法合成重组水蛭素，虽然在临床上与天然水蛭素的差异并不大，但是抗凝活性低，抗凝血作用的特异性会受到重组水蛭素浓度的影响，纯度高抗凝血作用也相应较高，因此，临床上对天然水蛭素需求很大。
综上所述，现有技术存在的问题是：目前获取水蛭素的方法存在水蛭素产量极小，耗费成本较高，抗凝活性低的缺点。
技术实现要素：
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种日本医蛭唾液腺细胞的原代培养方法。
本发明是这样实现的，一种日本医蛭唾液腺细胞的原代培养方法，所述日本医蛭唾液腺细胞的原代培养方法包括将剪碎后的组织块接种于25cm2的细胞封闭培养瓶中，加入5mlsfx-inscet昆虫细胞培养基，置于生化培养箱中29℃静止培养。
进一步，所述接种之前需要：
步骤一，用水去除日本医蛭身体表面的粘稠状分泌物。清除干净之后，先放于0.3％高锰酸钾溶液中浸泡，再放入酒精溶液中浸泡，对日本医蛭进行消毒处理；
步骤二，在超净工作台内，将经过体表灭菌的日本医蛭转移到装有pbs缓冲液的一次性无菌培养皿中，pbs缓冲液浸没日本医蛭，用经过高温高压灭菌处理的手术剪刀和镊子取下日本医蛭的前端头部；
步骤三，将头部转移到另一个装有pbs缓冲液的一次性无菌培养皿内，pbs缓冲液将其浸没，将日本医蛭的前端头部沿着口咽中部剪开，去除咽壁内表皮和外部皮肤，并用pbs漂洗；
步骤四，将唾液腺置于酒精溶液中浸泡后，迅速将其转移至三个各装有pbs缓冲液(含800u/ml的青霉素/链霉素/两性霉素混合溶液)的器皿中各浸泡，并在第三个装有pbs缓冲液(含800u/ml的青霉素/链霉素/两性霉素混合溶液)的培养皿中，将其剪成组织块。
进一步，所述步骤一中先放于0.3％高锰酸钾溶液中浸泡10min，再放入10％酒精溶液中浸泡10min，对日本医蛭进行消毒处理。
进一步，所述步骤四中将唾液腺置于75％酒精溶液中浸泡5-7s后，迅速将其转移至三个各装有1mlpbs缓冲液(含800u/ml的青霉素/链霉素/两性霉素混合溶液)的器皿中各浸泡5min。
进一步，所述步骤四中剪成0.5mm3-1mm3大小的组织块。
本发明的另一目的在于提供一种利用所述日本医蛭唾液腺细胞的原代培养方法培养的日本医蛭。
本发明的优点及积极效果为：进行日本医蛭唾液腺细胞原代培养方法、培养基种类、抗生素种类和浓度等的选择筛选试验，建立日本医蛭原代细胞培养体系，实现医学蛭类唾液腺细胞的原代培养，以进一步实现传代培养。若日本医蛭唾液腺细胞体外培养能够实现，并且能够达到传代培养，天然水蛭素获取方式——从体外培养的日本医蛭唾液腺细胞中直接提取分离，始终维持较高水平的抗凝活性，并且大大提高天然水蛭素的产量，其产量明显高于直接从医蛭的唾液腺部位分离提取天然水蛭素以及用精氨酸等刺激医蛭使其分泌唾液腺分泌再收集唾液的现有方法。极少量的野生日本医蛭唾液腺细胞进行体外细胞培养后就能得到大量的唾液腺细胞，分离提取出大量天然水蛭素，有利于野生日本医蛭种群的保护，达到既深度开发利用又大力保护动物种质资源的目标。采用本发明对日本医蛭唾液腺细胞进行了原代培养，取得了较好的培养效果。
本发明快速、有效、重复性强，是对蛭类细胞培养的完善，为蛭类细胞原代培养的研究提供可靠的试验数据与基础。
附图说明
图1是本发明实施例提供的日本医蛭唾液腺细胞的原代培养方法流程图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
下面结合附图对本发明的应用原理作详细的描述。
本发明从rpmi1640培养基、sfx-inscet昆虫细胞培养基、m199培养基这3种培养基中筛选出最合适的培养基sfx-inscet昆虫细胞培养基；从卡那霉素、新霉素、链霉素、硫酸庆大霉素、青霉素/链霉素/两性霉素b混合溶液、氨苄青霉素6种抗生素中筛选出最适合的抗生素青霉素/链霉素/两性霉素b混合溶液；对青霉素/链霉素/两性霉素b进行浓度梯度试验，筛选出最适合的浓度800u/ml；从而初步筛选出最适合日本医蛭细胞原代培养的培养体系。
如图1所示，本发明实施例提供的日本医蛭唾液腺细胞的原代培养方法包括以下步骤：
s101：用水去除日本医蛭身体表面的粘稠状分泌物。清除干净之后，先放于0.3％高锰酸钾溶液中浸泡10min，再放入10％酒精溶液中浸泡10min，对日本医蛭进行消毒处理；
s102：在超净工作台内，将经过体表灭菌的日本医蛭转移到装有pbs缓冲液的一次性无菌培养皿中，pbs缓冲液浸没日本医蛭，用经过高温高压灭菌处理的手术剪刀和镊子取下日本医蛭的前端头部；
s103：将头部转移到另一个装有pbs缓冲液的一次性无菌培养皿内，pbs缓冲液将其浸没，将日本医蛭的前端头部沿着口咽中部剪开，去除咽壁内表皮和外部皮肤，并用pbs漂洗；
s104：将唾液腺置于75％酒精溶液中浸泡5-7s后，迅速将其转移至三个各装有1mlpbs缓冲液(含800u/ml的青霉素/链霉素/两性霉素混合溶液)的器皿中各浸泡5min，并在第三个装有pbs缓冲液(含800u/ml的青霉素/链霉素/两性霉素混合溶液)的培养皿中，将其剪成0.5mm3-1mm3大小左右的组织块；
s105：将剪碎后的组织块接种于25cm2的细胞封闭培养瓶中，加入sfx-inscet昆虫细胞培养液，置于生化培养箱中29℃静止培养。
下面结合试验对本发明的应用效果作详细的描述。
试验具体的步骤如下：
步骤一，用水去除日本医蛭身体表面的粘稠状分泌物。清除干净之后，先放于0.3％高锰酸钾溶液中浸泡10min，再放入10％酒精溶液中浸泡10min，对日本医蛭进行消毒处理；
步骤二，在超净工作台内，将经过体表灭菌的日本医蛭转移到装有pbs缓冲液的一次性无菌培养皿中，pbs缓冲液浸没日本医蛭，用经过高温高压灭菌处理的手术剪刀和镊子取下日本医蛭的前端头部；
步骤三，将头部转移到另一个装有pbs缓冲液的一次性无菌培养皿内，pbs缓冲液将其浸没，将日本医蛭的前端头部沿着口咽中部剪开，去除咽壁内表皮和外部皮肤，并用pbs漂洗；
步骤四，将唾液腺置于75％酒精溶液中浸泡5-7s后，迅速将其转移至三个各装有1mlpbs缓冲液(含800u/ml的青霉素/链霉素/两性霉素混合溶液)的器皿中各浸泡5min，并在第三个装有pbs缓冲液(含800u/ml的青霉素/链霉素/两性霉素混合溶液)的培养皿中，将其剪成0.5mm3-1mm3大小左右的组织块；
步骤五，原代培养培养基种类的筛选：将剪碎后的组织块接种于25cm2的细胞封闭培养瓶中，分三组，分别加入不同种类的培养基(培养基体积5ml)，置于生化培养箱中29℃静止培养，7d后更换一半的培养液，并添加20％的灭活标准胎牛血清；结果在rpmi1640培养基中进行的原代细胞培养，接种培养第2天，肉眼观察到组织块多贴附于壁底，在显微镜下可以看到剪碎的组织块大小不一，形态多样，边缘呈现为较为明亮的亮带，培养液澄清没有杂质；接种培养第3-4天，肉眼观察到组织块贴附于壁底，培养液澄清，显微镜下观察到培养液中有少量黑色杂质；接种培养第5天，肉眼观察培养液浑浊，白色透明培养基略微变黄，污染物呈点状分布，倒置显微镜下观察到大量黑色细沙状杂质污染，细胞无生长迹象。在m199培养基中进行的原代细胞培养，接种培养第2-3天，肉眼观察组织块一半未贴壁，培养液澄清，倒置显微镜下观察到组织大小不一，形态多样，边缘呈现为较为明亮的亮带，培养液没有杂质；接种培养4-5天，大半组织块仍未贴壁，倒置显微镜下观察培养液澄清，细胞无生长迹象；接种培养第6-7天左右，培养基颜色变淡浑浊，肉眼观察到培养液中浮起一层白色的网纱状的污染物。在sfx-inscet昆虫细胞培养基中进行原代细胞培养，接种培养第2-3天，肉眼观察到组织块多贴附于壁底，倒置显微镜下观察到组织大小不一，形态多样，边缘呈现为较为明亮的亮带，接种培养第3-4天，倒置显微镜下观察培养液依旧澄清，细胞暂无生长迹象；接种培养第5-6天，从组织块周缘游离出少量细胞，细胞形态为圆形，透明。
步骤六，原代培养抗生素种类的筛选：将剪碎后的组织块接种于25cm2的细胞封闭培养瓶中，加入步骤s105中最优的培养基后，分成六组，分别加入不同种类相同浓度(200u/ml)的抗生素/pbs缓冲液的混合溶液，置于生化培养箱中29℃静止培养；结果比较在同一种培养基(即sfx-inscet昆虫细胞培养基)中经过同一浓度200u/ml不同抗生素种类的处理后的原代细胞生长存活及污染状态，发现在经过青霉素/链霉素/两性霉素b混合溶液浸泡处理过后的组织块原代培养时存活时间最长，保持培养液不被污染的时间也最长。
步骤七，原代培养抗生素浓度的筛选：将剪碎后的组织块接种于25cm2的细胞封闭培养瓶中，加入步骤s105中最优的培养基后，分成六组，分别加入不用浓度、步骤s106中最优的抗生素，置于生化培养箱中29℃静止培养；结果比较在同一种培养基中经过同一种抗生素溶液(即“三抗”溶液)浸泡处理但是抗生素浓度不同的原代细胞生长存活及污染状态，发现在经过抗生素浓度为800u/ml(即抗生素：pbs缓冲液＝800u：1ml)的浓度下，细胞污染状态最小，细胞存活时间最长，并观察到有新细胞生长的情况。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。