一种聚磷菌印迹生物炭的制备方法及应用与流程

本发明涉及一种聚磷菌印迹生物炭的制备方法，特别涉及一种聚磷菌印迹生物炭的制备方法及应用。

背景技术：

我国每年有大量的锯末、秸杆等生物质遭到焚烧浪费，这不仅会给环境带来污染危害，还会造成生物能源的浪费和损失。如何充分而又合理地利用这类“废料”，使其变废为宝，这是需要人们亟待解决的问题。通过热解、改性制得的生物炭具有一定的吸附重金属作用，能降低环境重金属的迁移性、生物有效性，被广泛研究，然而，单一的生物炭由于本身表面吸附位点非常有限，其吸附性能和稳定性受到很大限制。因此，研究开发新型的具有高吸附容量、钝化性质稳定和廉价实用的吸附剂，是其进一步发展和应用的关键，具有重要意义。

聚磷类菌种是矿渣/土壤中常见的一类微生物，其可作为环境载体吸持包括cr、u等在内的污染物，或通过矿化沉淀等作用改变cr、pb的形态将其吸附固定，进而降低废水中重金属的含量或土壤中重金属的迁移性、生物有效性和毒性。为了使聚磷菌固定在生物炭的表面，增加聚磷菌附着吸附点位及稳定性，以期在载体的保护下提高细胞对重金属的耐受性，增加单位体积内的生物量，协同生物炭的作用提高对重金属的吸附效率。

技术实现要素：

本发明目的在于针对现有技术存在的技术问题，开发一种高吸附容量、性质稳定和廉价实用的可用于吸附处理重金属离子的固定化微生物印迹生物炭。

为实现上述目的，本发明提供的技术方案包括以下步骤：

(1)取5-10g锯末，在200-700℃温度下进行厌氧恒温热解4h；完全炭化后冷却至室温取出，得生物炭，将生物炭混匀研磨，过100目筛，于干燥器中保存备用；

(2)取10g活性污泥加入90ml无菌水中混匀，室温静置10min，取上清液通过10倍稀释法将其制成浓度分别为10^-1到10^-6的6种菌悬液，分别取0.2ml不同浓度的菌液均匀涂布到固体富磷平板上，于30℃培养箱培养24h，在出现明显单菌落的梯度平板中，挑取单菌落转接到富磷培养基上反复纯化至平板上的单菌落形态一致，得初纯菌株，接于lb固体培养基斜面上，4℃保存备用；

(3)将一部分初纯菌株接入驯化培养基三角瓶中，瓶口用八层纱布封口，置于恒温培养摇床以温度为30℃、转速为150r/min条件下进行好氧培养24h，显微镜观察好氧培养条件下菌体积累聚磷颗粒的情况；另外，将另一部初纯菌株接入另一驯化培养基三角瓶中，随后将瓶中充入氮气使瓶内处于厌氧状态，用橡胶塞密封进行好氧培养24h，显微镜观察厌氧培养条件下菌体内积累phb颗粒的情况；分别对好氧培养中菌体积累的聚磷颗粒和厌氧培养条件下菌体内积累的phb颗粒进行染色，选取在两种染色方法中都呈阳性的菌体为初筛菌；

(4)将初筛菌株接入聚磷培养液中，在30℃、转速为150r/min摇床振荡培养12h，然后在10000r/min转速下-30℃冷冻离心10min，取上清液稀释，用钼锑抗分光光度法，在700nm处测量其吸光度，计算磷的去除率，取菌体聚磷率大于60％的菌株为复筛菌；

(5)步骤1)中得到的磷基生物炭和复筛菌按照质量比20:1的比例，分别加入固定化培养基中，固定化培养基包括：蔗糖10g/l，牛肉膏6g/l，酵母粉1.5g/l，ph7.0，将固定化培养基在温度30℃、160r/min的恒温摇床中震荡培养18h，然后用30目的筛子过滤出吸附好菌体的磷基生物炭，即聚磷菌印迹生物炭。

优选的，制备生物炭厌氧恒温热解温度为400-500℃。

优选的，所述的富磷培养基包括：牛肉膏3g/l，蛋白胨10g/l，氯化钠5g/l，磷酸二氢钾0.2g/l，琼脂18g/l，富磷培养基ph为7.0。

优选的，所述的驯化培养基包括：乙酸钠0.34g/l，氯化铵0.076g/l，硫酸镁0.02g/l，氯化钙0.01g/l，磷酸二氢钾0.09g/l，碳酸氢钠0.3g/l，微量元素混合液1ml，驯化培养基ph7.5。

优选的，所述的微量元素混合液包括：乙二酸四乙胺10g/l，硫酸亚铁1.54g/l，硼酸0.15g/l，五水硫酸铜0.03g/l，氯化锰0.12g/l，碘化钾0.18g/l，钼酸钠0.06g/l，七水硫酸锌0.12g/l，六水合二氯化钴0.15g/l。

优选的，所述的聚磷培养液包括：牛肉膏0.22g/l，乙酸钠0.5g/l，硫酸镁0.4g/l，硫酸亚铁0.002g/l，硫酸铜0.08g/l，硫酸铵0.2g/l，磷酸氢二钾0.0147g/l，聚磷培养液ph7.0。

本发明还提供了一种聚磷菌印迹生物炭的应用，所述的聚磷菌印迹生物炭由上述的一种聚磷菌印迹生物炭吸附剂的制备方法制得，其应用于重金属废水的处理。

优选的，聚磷菌印迹生物炭在重金属废水中用量为0.3～0.6g/l。

优选的，聚磷菌印迹生物炭在重金属废水中反应条件为：重金属废水ph值5～7，反应时间为3～6小时。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明所公开的生物质炭在优选温度400-500℃范围内制备，最大限度降低制备过程有机碳的损失，又尽可能提高了所形成高度芳香化有机化合物的稳定性；然后将培养至对数生长期的假单胞菌接种到发酵罐中，并加入生物炭，将聚磷菌进行固定化处理，得到聚磷菌印迹生物炭吸附剂。

利用本发明方法制备得到的负载聚磷菌的生物炭对于重金属废水处理有特别优良的效果，以重金属cr及金属u离子为例，将负载聚磷菌的生物炭投加到含cr及u溶液中，经聚磷菌与生物炭协同作用，吸附很快达到平衡，它可使废水中的铬、金属铀含量分别下降80.2-82.1％与78.9-82.7％。

本发明使用主要原料锯末来源广泛，制备生物炭使其变废为宝，其它的诸如浓硝酸，磷酸钙是常用的化工产品；聚磷菌常见于城市生活污水处理的剩余污泥中，分离，提取方便。

与现有生物炭或类生物炭吸附剂技术相比，本发明提供的负载聚磷菌的生物炭可以为微生物提供了一个良好的生存环境，而且还可以帮助聚磷菌提高抵御高盐度和重金属的能力，同时吸附位点增多，且具有相当的稳定性，对重金属的吸附性能大大提高；产品无毒，对环境友好，本发明提供的制备方法简易，易于工业化生产。

附图说明

下面结合附图对本发明作进一步说明：

图1聚磷菌印迹生物炭的扫描电镜图；

图2聚磷菌印迹生物炭的放大扫描电镜图；

图3聚磷菌印迹生物炭的能谱图；

图4普通生物炭的扫描电镜图；

图5普通生物炭的放大扫描电镜图；

图6普通生物炭的能谱图；

图7普通生物炭与聚磷菌印迹生物炭的红外光谱测试图。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

实施例1：

(1)取5～10g锯末，200-700℃温度下进行厌氧恒温热解4h；完全炭化后冷却至室温取出，得生物炭，将生物炭混匀研磨，过100目筛，于干燥器中保存备用；

(2)取10g活性污泥加入90ml无菌水中混匀，室温静置10min，取上清液通过10倍稀释法将其制成浓度分别为10^-1到10^-6的6种菌悬液，分别取0.2ml不同浓度的菌液均匀涂布到固体富磷平板上，于30℃培养箱培养24h，在出现明显单菌落的梯度平板中，挑取单菌落转接到富磷培养基上反复纯化至平板上的单菌落形态一致，得初纯菌株，接于lb固体培养基斜面上，4℃保存备用；

(3)将一部分初纯菌株接入驯化培养基三角瓶中，瓶口用八层纱布封口，置于恒温培养摇床以温度为30℃、转速为150r/min条件下进行好氧培养24h，显微镜观察好氧培养条件下菌体积累聚磷颗粒的情况；另外，将另一部分初纯菌株接入另一驯化培养基三角瓶中，随后将瓶中充入氮气使瓶内处于厌氧状态，用橡胶塞密封进行好氧培养24h，显微镜观察厌氧培养条件下菌体内积累phb颗粒的情况；分别对好氧培养中菌体积累的聚磷颗粒和厌氧培养条件下菌体内积累的phb颗粒进行染色，选取在两种染色方法中都呈阳性的菌体为初筛菌；

聚磷颗粒异染粒染色方法：

(1)染色液

甲液：体积分数95％乙醇2ml、甲苯胺蓝0.15g、冰醋酸1ml、孔雀绿0.2g、蒸馏水100ml。先将染料溶于乙醇中，向其中加入事先混合的冰醋酸和蒸馏水，放置24h后过滤备用；

乙液：碘2g、碘化钾3g、蒸馏水100ml。

(2)染色步骤

滴一滴无菌水于载玻片上，用接菌环蘸取少量菌落于无菌水中，风干固定；用甲液染5min，倾去甲液，用乙液冲去甲液，并染色1min，用蒸馏水冲洗后吸干；聚磷菌体内有异染色颗粒，阳性会有黑色物质，其他部分为深绿色或浅绿色。

phb颗粒染色

(1)染色液

苏丹黑3g/l：苏丹黑0.3g，体积分数70％乙醇100ml，混合用力振荡，放置过夜备用。

二甲苯：褪色剂蕃红水溶液50g/l：复染液

(2)染色步骤

按常规染色制成涂片，用甲液染色5min，倾去甲液，用乙液冲去甲液，并染1min，水洗，吸干，镜检，phb在染色后，阳性会变为蓝黑色，其他部分为红色。

(4)将初筛菌株分别接入装有50ml聚磷培养液的三角瓶中，在30℃、转速为150r/min摇床振荡培养12h，然后在10000r/min转速下离心10min，倾出上清液，移取2ml稀释至50ml，与未接种菌的聚磷培养液做对照，用钼锑抗分光光度法，在700nm处测量其吸光度，通过标准曲线查得磷浓度，计算磷的去除率，取菌体聚磷率大于60％的菌株为复筛菌；

(5)称取4g步骤1)中得到的磷基生物炭，同时配置固定化培养基，固定化培养基包括：蔗糖10g/l，牛肉膏6g/l，酵母粉1.5g/l，ph7.0；按5％质量浓度接种量接入活化后的复筛菌，加入称量好的磷基生物炭，放入30℃、160r/min的恒温摇床中震荡培养18h，然后用30目的筛子过滤出吸附好菌体的磷基生物炭，即聚磷菌印迹生物炭。

上述步骤制得的聚磷菌印迹生物炭外观呈黑色，比表面积在25.42-56.27m²/g之间，将其置于扫描电镜下观察，其结构如图1-3所示，通过与图4-6(普通生物炭)sem-eds对比可以看出聚磷菌印迹生物炭表面0.16％的磷元素，说明其表面含有一定比例的含磷菌株，即聚磷菌。

实施例2

本发明的聚磷菌印迹生物炭应用于处理废水中的cr离子，包括以下步骤：取100ml初始浓度为10～100mg/l的cr⁶⁺溶液，调节溶液的ph值为6.0，加入实施例1制得的聚磷菌印迹生物炭吸附剂，该吸附剂的用量为0.25g/l，在30℃恒温振荡器进行吸附反应3小时，再将该吸附剂从废水中分离，用aas测定废水中剩余的cr⁶⁺的含量，计算的吸附量结果如表1所示：

表1：聚磷菌印迹生物炭对不同cr⁶⁺初始浓度废水的吸附量

由表1可知，在初始浓度为10.01mg/l的条件下该吸附剂具有8.75mg/g的吸附量，并随cr6+初始浓度的增加而增加，到一定值后25.44mg/g基本达到稳定。

实施例3

本发明的聚磷菌印迹生物炭用于处理废水中的放射性金属uo²⁺离子，包括以下步骤：取100ml初始浓度为10～100mg/l的uo²⁺溶液，调节溶液的ph值为6.0，加入实施例1制得的聚磷菌印迹生物炭吸附剂，该吸附剂的用量为0.25g/l，在30℃恒温振荡器进行吸附反应3小时，再将该吸附剂从废水中分离，用aas测定废水中剩余的uo²⁺的含量，计算的吸附量结果如表1所示：

表2：聚磷菌印迹生物炭对不同cr⁶⁺初始浓度废水的吸附量

由表2可知，在初始浓度为10.03mg/l的条件下该吸附剂具有17.13mg/g的吸附量，并随uo²⁺初始浓度的增加而增加，到一定值后26.52mg/g基本达到稳定。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进，这些改进应视为本发明的保护范围。