一种携带去优化M基因和两个G基因的重组狂犬病病毒的制作方法

本发明属于病毒分子生物学
技术领域：
。更具体地，涉及一种携带去优化m基因和两个g基因的重组狂犬病病毒。
背景技术：
：狂犬病(rabies)是由狂犬病病毒(rabiesvirus,rabv)引起的致死性、高度嗜神经性人兽共患烈性传染病。99％的人狂犬病感染都来自病犬，狂犬病通过感染家畜和野生动物经咬伤或抓伤(通常经由唾液)传播至人。全球每年约有60,000的人死于狂犬病，亚洲和非洲占95％以上，我国狂犬病发病人数仅次于印度，高居世界第二位。目前尚无有效的治疗方案，免疫预防是防控该病的主要措施。因此，探究狂犬病病毒的复制与致病机理、研发廉价高效的疫苗尤为重要。2015年12月，世卫组织等提出到2030年为止根除人类狂犬病。在我国，狂犬病病毒的主要带毒和传播宿主是犬，要想在我国根除人狂犬病，必须普及家养犬只的免疫，在动物间建立免疫壁垒，消灭动物狂犬病。我国目前的兽用灭活狂犬疫苗，因生产规模的限制、生产成本的偏高，国产兽用灭活疫苗尚未在国内大量施用。绝大部分经济发达的城市仍然首选进口灭活疫苗，这些灭活疫苗对于农村和经济落后地区来说价格太高，难以大规模推广使用，国产的灭活疫苗虽然价格便宜，但其免疫效果不佳。因此，有必要进一步降低研发成本，开发出价格低廉、安全、有效的人用及兽用狂犬病疫苗。技术实现要素：本发明要解决的技术问题是克服现有狂犬病疫苗的缺陷和不足，利用分子生物学手段，以狂犬病疫苗候选株hep-flury为骨架，将去优化的m基因以及额外一个狂犬病毒的g基因插入hep-flury；通过拯救获得携带去优化m基因且具有两个g的重组狂犬病毒株，其病毒的滴度显著升高，高感染复数时，g蛋白的表达量升高、病毒各基因的转录增强。本发明目的是提供一种携带去优化m基因和两个g基因的重组狂犬病病毒。本发明另一目的是提供所述重组狂犬病病毒的应用。本发明上述目的通过以下技术方案实现：本发明首先将m基因阅读框部分进行去优化，然后将去优化的m基因替换至hep-flury及g基因同时克隆至hep-flury的g和l假基因区，并拯救出重组病毒。并进一步对重组病毒的复制、转录及结构蛋白表达进行探究为临床应用提供理论依据。结果成功构建了一种携带去优化m基因和两个g基因的重组狂犬病病毒rhep-dg-mmin，该重组病毒rhep-dg-mmin携带两个g基因且m基因去优化，与亲本rhep-dg相比，病毒的滴度更高，高感染复数时能够表达更高水平的g蛋白且病毒的复制和各结构基因的转录都增高。m基因去优化后对病毒的复制、转录及蛋白表达产生一定的影响，更清楚地阐明m蛋白的调节功能。因此，以下内容均应在本发明的保护范围之内：去优化后m基因，其阅读框去优化的结果如表1所示，序列如seqidno.2所示。该基因的去优化是基于鼠源密码子库，利用其在翻译蛋白质时使用密码子的频率，将氨基酸的密码子去优化为使用频率较低的同义密码子，通过细胞内可用的trnas量的差异对翻译过程产生影响。增加病毒m基因cpg和upa二核苷酸的数量，对其翻译过程产生负面影响。所述去优化后m基因在构建重组狂犬病病毒或制备狂犬病疫苗方面的应用，也在本发明的保护范围之内。一种携带去优化m基因和两个g基因的重组狂犬病病毒，是以狂犬病病毒hep-flury株为骨架，将去优化后m基因替换hep-flury中的m基因，再插入额外一个狂犬病毒的g基因，得到携带去优化m基因和两个g基因的重组狂犬病病毒phep-dg-mmin质粒，最后拯救筛选获得重组狂犬病病毒株rhep-dg-mmin。具体地优选，所述重组狂犬病病毒rhep-dg-mmin的构建方法为：首先将去优化的m基因替换至狂犬病病毒hep-flury株全长cdna克隆中，构建了携带去优化m基因的重组cdna克隆质粒phep-3.0-mmin；在获得phep-3.0-mmin重组质粒的基础上，在其基因组g和l基因之间再插入一个拷贝的g基因，成功构建携带去优化m基因和两个g基因的感染性重组质粒phep-dg-mmin；最后将cdna克隆phep-dg-mmin和表达狂犬病病毒n、p、g和l蛋白的辅助质粒共转染bhk-21细胞，拯救获得携带去优化m基因和两个g基因的一株嵌合狂犬病病毒rhep-dg-mmin。该重组狂犬病病毒rhep-dg-mmin携带去优化m基因和两个g基因，其m蛋白表达量降低而病毒滴度升高，高moi时病毒各结构基因的转录增强。具体地，所述重组狂犬病病毒rhep-dg-mmin中，构建后的两个g基因相邻。而且所述去优化m基因直接替换至hep-flury的m基因开放阅读框，构建策略如附图1所示。作为一种优选的可实施方案，所述的重组狂犬病病毒rhep-dg-mmin的构建方法包括如下步骤：s1.构建重组质粒phep-3.0-mmin：将去优化后m基因无缝克隆替换狂犬病病毒hep-flury株全长cdna中的m基因；s2.构建重组质粒phep-dg-mmin：在重组质粒phep-3.0-mmin基因组的g基因和l基因之间再插入一个拷贝的g基因；s3.利用重组质粒phep-dg-mmin进行拯救获得重组病毒rhep-dg-mmin。其中，优选地，步骤s1构建重组质粒phep-3.0-mmin的具体方法如下：s11.利用引物m-min-f/m-min-r扩增去优化后m基因，得到m-min片段；并利用引物vhep-3.0-f/vhep-3.0-r线性化载体phep-3.0；其中，引物m-min-f/m-min-r的序列分别如seqidno.3和4所示，引物vhep-3.0-f/vhep-3.0-r的序列分别如seqidno.5和6所示；s12.利用无缝克隆技术连接m-min片段与线性化载体phep-3.0，获得携带去优化m基因的狂犬全长cdna的重组质粒phep-3.0-mmin。优选地，步骤s11所述phep-3.0质粒是携带hep-flury毒株全长cdna的重组质粒。优选地，步骤s11所述扩增去优化后m基因的pcr体系如下：优选地，步骤s11所述扩增去优化后m基因的pcr反应条件为：98℃30s；98℃6s，60℃30s，72℃50s，运行40个循环；最后72℃延伸7min。优选地，步骤s11所述线性化载体phep-3.0是利用phusion超保真dna聚合酶进行线性化，pcr体系如下：优选地，步骤s11所述线性化载体phep-3.0是利用phusion超保真dna聚合酶进行线性化，pcr反应条件为：98℃30s；98℃6s，72℃15min，运行25个循环；最后72℃延伸10min。优选地，步骤s12中无缝克隆的体系为：优选地，步骤s12中无缝克隆体系置于37℃反应30min，待反应完成后，立即将反应管置于冰水浴中冷却5min。之后，反应产物可直接进行转化。另外，优选地，步骤s2构建重组质粒phep-dg-mmin的具体方法如下：s21.利用引物rv-g-f/rv-g-r对质粒phep-3.0进行pcr扩增，并且两端添加bsiwⅰ和nheⅰ酶切位点，得到狂犬病病毒g基因片段；其中，引物rv-g-f/rv-g-r的序列分别如seqidno.7和8所示；s22.将g基因片段和重组质粒phep-3.0-mmin分别利用bsiwⅰ和nheⅰ进行双酶切；两者的酶切产物连接获得重组质粒phep-dg-mmin。其中，优选地，步骤s21所述pcr扩增的反应条件：98℃30s；98℃6s，72℃1min30s，运行30个循环；最后72℃延伸7min。优选地，步骤s22所述双酶切的酶切体系如下：上述体系混匀后，在37℃水浴锅孵育3h。对g基因、phep-3.0-mmin酶切产物琼脂糖凝胶dna回收试剂盒清洗，回收纯化。回收产物用分光光度计测定浓度，按照分子量的比例为2:1至10:1(g基因：phep-3.0-mmin)进行连接，连接体系如下：上述体系混匀后，置于连接仪中，16℃连接过夜，连接产物直接用于转化。另外，所述重组狂犬病病毒rhep-dg-mmin在作为或制备狂犬病疫苗方面的应用，以及在去优化m基因对狂犬病毒复制与转录的机理研究中的应用，也在本发明的保护范围之内。本发明研究了rabv的m蛋白表达量降低以后对病毒的复制、转录的影响，在na细胞上病毒滴度的变化。本发明首先以狂犬病病毒疫苗株hep-flury为骨架，去优化m基因，通过酶切连接，构建含有两个g基因和去优化m基因(见表1)的重组狂犬病病毒rhep-dg-mmin，构建策略如附图1所示。然后对成功拯救的重组狂犬病病毒进行pcr、测序、免疫荧光鉴定正确。本发明还对重组病毒进行生长曲线、各结构基因的转录与复制、各结构蛋白的表达量差异等生物学特性研究。结果显示，重组狂犬病病毒rhep-dg-mmin在na细胞上的滴度比亲本株rhep-dg高，高moi时重组狂犬病病毒rhep-dg-mmin的g蛋白表达量和各结构基因的转录及病毒基因组的复制均增加。具体研究方法方面，本发明利用分子生物学手段构建携带双g和去优化m基因的具有感染性的全长狂犬病毒cdna，通过细胞生物技术拯救出携带双g且m表达量降低的重组狂犬病毒rhep-dg-mmin。利用分子生物学手段，以狂犬病疫苗候选株hep-flury为骨架，将去优化m基因替换m基因以及额外一个狂犬病毒的g基因插入hep-flury；通过拯救获得携带两个g且m表达量降低的重组狂犬病毒rhep-dg-mmin，并在体外培养细胞对重组狂犬病毒的生物学特性进行研究。本发明对携带双g和去优化m基因的重组狂犬病病毒进行鉴定和在na细胞上传代及rt-pcr鉴定。经免疫荧光试验证实，重组病毒rhep-dg-mmin拯救成功。通过western-blot鉴定重组病毒rhep-dg-mmin的各结构蛋白不同时间点表达量的差异，结果显示，m蛋白的表达量降低；当moi＝3时，感染48h后g蛋白的表达量显著增加。将rhep-dg-mmin在na细胞中连续传代9次，通过rt-pcr方法可检测到rhep-dg-mmin存在双g基因和去优化m基因，进行序列测定，没有发现任何突变。本发明对rhep-dg-mmin重组病毒在na细胞上的体外生长曲线进行了研究。病毒的生长曲线表明rhep-dg-mmin与亲本株rhep-dg相比较生长特性基本一致，并且rhep-dg-mmin的滴度均高于亲本株。通过荧光定量实验发现，在moi＝3时，rhep-dg-mmin感染na细胞后转录和复制增强；moi＝0.01时，rhep-dg-mmin株的基因组rna复制水平低于亲本株，感染48h后，各基因的转录逐渐增高。本发明具有以下有益效果：本发明科学地构建了携带去优化m基因和双g基因的重组狂犬病病毒rhep-dg-mmin。重组狂犬病病毒相比亲本株rhep-dg具有更高的病毒滴度，可以降低犬用疫苗的成本。本发明同时阐述了m基因去优化后对狂犬病病毒的免疫原性蛋白g蛋白的表达量增高，可以为进一步提高疫苗的免疫效果提供理论依据。本发明同时阐述了m基因去优化后对狂犬病病毒的各结构基因的复制、转录的影响及病毒生长曲线的影响。附图说明图1为构建重组狂犬病病毒rhep-dg-mmin的基因重组策略。图2为m-min片段扩增电泳图；泳道1、2为m-min片段，泳道3为阴性对照，m为dl2000的dnamarker。图3为phep-3.0载体线性化电泳图：泳道1、2为质粒phep-3.0，泳道3为阴性对照，m为dl15000的dnamarker。图4为phep-dg-mmin质粒的构建示意图。图5为g片段电泳图：泳道1为g片段，泳道2为阴性对照，m为dl2000的dnamarker。图6为phep-dg-mmin质粒鉴定电泳图；泳道1、2位phep-dg-mmin菌液，m为dl2000的dnamarker。图7为携带双g和去优化m基因的重组病毒rhep-dg-mmin拯救后免疫荧光鉴定结果；a：重组狂犬病毒rhep-dg-mmin抗n蛋白的荧光抗体染色，b：重组毒rhep-gfp对照。图8为rt-pcr检测重组病毒rhep-dg-mmin的双g基因电泳图；泳道1、2位重组病毒rhep-dg-mmin，可以扩增出744bp的片段，m为markerdl2000的dnamarker。图9为携带双g和去优化m基因的重组病毒rhep-dg-mmin及亲本株rhep-dg在na细胞上的生长曲线。图10为携带双g和去优化m基因的重组病毒rhep-dg-mmin及亲本株rhep-dg的各病毒结构蛋白表达量的差异(moi＝0.01)。图11为携带双g和去优化m基因的重组病毒rhep-dg-mmin及亲本株rhep-dg的各病毒结构蛋白表达量的差异(moi＝3)。图12为携带双g和去优化m基因的重组病毒rhep-dg-mmin及亲本株rhep-dg的病毒基因复制及转录水平的检测。具体实施方式以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本
技术领域：
常规试剂、方法和设备。除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。本发明构建重组狂犬病病毒rhep-dg-mmin的基因重组策略如图1所示。实施例1m基因基于鼠源密码子偏嗜性的优化通过参考codonusagedatabase数据库，综合考虑优化前后核酸序列的协调、优化后cpg和upa的的比例及au富集序列，对rabv的m基因进行了基于鼠源密码子反偏嗜性优化(underrepresented)，将反偏嗜性优化的m基因命名为m-min。m基因去优化的结果如表1所示。表1rabvm基因密码子偏嗜性优化rabv-mrabv-m-mincpg二核苷酸数量1638upa二核苷酸数量2329aaauu(au-rich)10突变碱基数(bp)：0/609154/609具体地，rabv的原m基因(rabv-m)的序列如seqidno.1所示，去优化后的m基因(rabv-m-min)序列如seqidno.2所示。实施例2m-min片段与phep-3.0质粒的同源重组无缝克隆1、构建重组质粒phep-3.0-mmin(1)利用引物m-min-f/m-min-r(表2)扩增m基因，并利用引物vhep-3.0-f/vhep-3.0-r线性化载体phep-3.0。表2重组狂犬病病毒基因cdna克隆引物(2)反应结束后，取5μlpcr产物于1.0％琼脂糖凝胶进行电泳检测。m-min扩增pcr获得一条特异的dna电泳带，大小约为644bp，与试验预期相符，见图2所示。载体phep-3.0线性化获得一条特异性dna电泳带，大约为16088bp，与试验预期相符，见图3所示.(3)将pcr扩增产物进行凝胶dna回收，将回收的m-min片段和载体phep-3.0(携带hep-flury毒株全长cdna的重组质粒)用无缝克隆技术进行连接。37℃反应30min，待反应完成后，立即将反应管置于冰水浴中冷却5min。之后，反应产物可直接进行转化，也可储存于-20℃。(4)无缝克隆获得的连接产物转化xl10-gold感受态细胞，筛选阳性克隆。取待检菌液作为模板进行菌液pcr初步鉴定。鉴定引物为表2中的m-min-f/r，连接成功的阳性重组质粒pcr产物长度为644bp，扩增体系如下表3所示：表3扩增体系2×taqmastermix12.5μl菌液模板2μlm-min-f1μlm-min-r1μlddh2o8.5μltotal25μl扩增的pcr反应条件为：94℃5min；94℃30s，60℃30s，72℃50s，运行35个循环；最后72℃延伸7min。扩增产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳，选取能扩出强且特异性条带的对应菌液按照magen质粒小提试剂盒说明书进行质粒小提。将鉴定正确的质粒送上海英骏生物工程有限公司进行序列测定，正确，质粒命名为phep-3.0-mmin。实施例3利用重组质粒phep-3.0-mmin构建重组质粒phep-dg-mmin1、利用实施例2中构建的重组质粒phep-3.0-mmin构建phep-dg-mmin，构建方案见图4。(1)以phep-3.0质粒为模板，利用引物rv-g-f/rv-g-r对重组质粒phep-3.0进行pcr扩增，并且两端添加bsiwⅰ和nheⅰ酶切位点，得到含有狂犬病病毒g基因的完整开放阅读框，扩增长度为1575bp。以phep-3.0质粒为模板进行g基因的扩增，反应体系如下表4所示：表4反应体系5×phusionhfbuffer10.0μldntps(10mm)6μlmgcl2(10mm)3.5μlphep-3.0质粒5.5ngrv-g-f(10μm)2.5μlrv-g-r(10μm)2.5μlphusion聚合酶(2u/μl)0.5μlddh2o补足至50μltotal50.0μlpcr反应条件：98℃30s；98℃6s，72℃1min30s，运行30个循环；72℃延伸7min。反应结束后，取5μlpcr产物用1.0％的琼脂糖凝胶(含0.5μg/mleb)进行电泳检测，大小正确，见图5，产物命名为g片段。(2)产物g片段和phep-3.0-mmin质粒分别用bsiwⅰ和nheⅰ进行双酶切，将酶切产物连接，转化xl10-gold感受态细胞，筛选阳性克隆。以小量碱裂解法抽提质粒，进行初步鉴定，结果正确，见图6。(3)将鉴定正确的质粒送上海英骏生物工程有限公司进行序列测定，正确，质粒命名为phep-dg-mmin。将酶切鉴定和测序均正确的克隆参照qiagen公司质粒中量提取试剂盒说明书进行去内毒素中提重组质粒phep-dg-mmin。待拯救用。实施例4利用重组质粒phep-dg-mmin进行重组病毒rhep-dg-mmin的拯救及筛选1、转染和病毒筛选方法参照inoue(2003)和郭霄峰等(2006)的方法进行。转染：(1)准备bhk-21细胞：12孔细胞培养板细胞密度为1×105个/孔，培养液中含10％胎牛血清；37℃培养12～16h，至细胞50％-60％汇合。转染时用800μl1×pbs洗涤细胞一次。(2)取1.25μg重组质粒phep-dg-mmin，0.625μgph-n，0.3125μgph-p，0.125μgph-l和0.1875μgph-g混匀在1.5ml离心管中，添加灭菌去离子水至75μl，瞬时离心，使得管顶部的液滴进入溶液中。同时设立phep-gfp阳性对照。其中，ph-n、ph-p、ph-l和ph-g为辅助质粒，用以辅助拯救重组病毒。phep-gfp为本实验室刘晓慧博士构建的对照质粒。(3)添加7.5μl转染试剂，漩涡震荡器上震荡10s。(4)室温静置15min，添加400μl含10％胎牛血清和双抗(100iu/ml)的dmem于离心管中，上下颠倒管几次，混匀。(5)混匀的溶解液加入细胞(12孔培养板中的一孔)，37℃培养2.5～3h，靠板壁轻轻吸去dmem，用1×pbs洗涤细胞一次，重新添加dmem(含10％胎牛血清和双抗)。在37℃5％co2培养箱中培养48h，细胞95％长满后转入34℃培养96h。病毒筛选：(1)上述细胞板，-80℃反复冻融细胞3次，冷冻时间1h，室温溶解。取60μl上清液和60μl新鲜的bhk-21细胞(细胞密度为4×105个/ml)混合于96孔板，其后在37℃培养48h，34℃培养96h。(2)倾去细胞培养液，每孔加满80％预冷的丙酮，快速倾去丙酮，再次加满丙酮，置-20℃1h。弃去丙酮，轻微空干，每孔添加35μlfitc标记的抗狂犬病病毒n蛋白荧光抗体，用锡箔纸包好，37℃孵育1h，弃去溶解液，用1×pbs洗涤细胞两次，每次5min，再用去离子水快速洗涤细胞一次。自然干燥，荧光显微镜下观察，均可见大量绿色荧光斑点，见图7。拯救获得的病毒命名为rhep-dg-mmin。实施例5重组病毒rhep-dg-mmin的传代和鉴定1、成功拯救出来的重组病毒rhep-dg-mmin在na细胞上使用单层细胞接种培养法进行传代。在100mm细胞培养板中加入na细胞(2×106个)，培养12～16h后形成单层细胞，按照病毒液：培养液总体积＝1:10接种细胞，37℃吸附1h，更换新鲜配制的细胞维持液(含5％fbs的rpmi-1640培养液)，于37℃5％co2培养箱中培养约48h，再放入34℃5％co2中培养24h～48h后收毒。反复冻融3次，收集到无菌离心管中，12000r/min离心10min，取上清，混匀。取少量病毒液用于滴度测定，其余冻存于-80℃超低温冰箱中。其亲本毒株rhep-dg用同样的方法进行传代。用rt-pcr的方法鉴定重组病毒。rt-pcr检测双g检测、m基因检测，检测引物见表2。2、检测结果均正确，如图8所示。表明本发明的重组病毒rhep-dg-mmin可以稳定传代。实施例6重组病毒rhep-dg-mmin在na细胞上的体外生长曲线研究1、将rhep-dg-mmin和rhep-dg分别以相同的感染复数(moi＝0.01、moi＝3)感染细胞，接毒的具体步骤病毒传代。培养皿放置在37℃5％co2培养箱，待细胞长满单层移至34℃5％co2细胞培养箱中继续培养。分别在接毒后24h、48h、72h、96h及120h吸取120μl细胞上清培养液，冻存于-80℃超低温冰箱。测定的不同时间点的病毒滴度，绘制成生长曲线。2、结果显示，重组病毒滴度比亲本株滴度高，见图9。实施例7重组病毒各结构蛋白表达量的检测1、采用免疫印迹法(westernblot)检测重组狂犬病病毒各结构蛋白在宿主na细胞中的表达量。在6孔细胞板中rhep-dg-mmin和rhep-dg分别以相同的感染复数(moi＝0.01、moi＝3)感染细胞，接毒的具体步骤病毒传代。分别在接毒后12h、24h、48h、72h细胞蛋白样品，用于免疫印迹法(westernblot)检测。2、结果显示(见图10和图11)，重组病毒各结构蛋白的表达与亲本有差异。实施例8重组病毒感染na细胞后各基因的转录和复制水平1、采用实时荧光定量pcr(real-timequantitativepcr，q-pcr)的方法检测重组rabv感染na细胞后各基因的转录和复制水平。在6孔细胞板中rhep-dg-mmin和rhep-dg分别以相同的感染复数(moi＝0.01、moi＝3)感染细胞，接毒的具体步骤病毒传代。分别在接毒后6h、12h、24h、36h、48h、60h、72h后用trizol裂解细胞，细胞裂解液收集到对应编号的1.5ml灭菌离心管中，冻入-80℃超低温冰箱，待全部样品收取后统一用去除dna的方法抽提rna。2、使用bimake公司的2×sybrgreenqpcrmastermix荧光定量pcr试剂盒对将上一步反转获得的cdna进行荧光定量pcr。检测引物见表5，表5q-pcr检测用引物在96孔板(gunster)内配制以下表6所示反应液，每个样品设三个重复：表6反应液体系2×sybrgreenqpcrmastermix7μlcdna模板1μl(1:7稀释)上游引物0.5μl下游引物0.5μlddh2o1μltotal10μl将加完样的荧光定量pcr96孔板贴上膜，于甩板机中瞬时离心，使所有反应成分集中到管底，在bio-rad的cfxconnecttmreal-timepcr仪上运行如下表7所示程序：表7反应程序3、反应结束后，根据各样本靶基因的ct值，以gapdh基因ct为内参，采用2-△△ct(schmittgen,2001)法进行数据处理，得到各基因的相对表达水平。各个样本的靶基因表达差异的分析由graphpadprism6.0软件完成。4、结果显示，rhep-dg-mmin和rhep-dg各基因的转录与复制有显著差异，见图12。sequencelisting<110>华南农业大学<120>一种携带去优化m基因和两个g基因的重组狂犬病病毒<130><160>8<170>patentinversion3.3<210>1<211>609<212>dna<213>原m基因rabv-m<400>1atgaactttctatgtaagatagtgaaaaactgtagggatgaggacacccaaaagccctct60cccgcgtcagcccctccggatggcgatgacctgtggcttccacctccagaatatgtcccg120ctgaaagaactcacaagcaagaagaacatgaggaacttttgtatcaacggggaggttaaa180gtgtgcagtccgaacggttactcattcaggatcctgcggcatattctgagatcattcgac240gagatatactctgggaatcataggatgattgggttagtcaaagttgttgttggactagct300ttatcaggagctccagctcctgagggcatgaactgggtatacaaattgaggagaaccctt360attttccagtgggctgattccaggggccctcttgaaggggaggagttgga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