涉及嵌入异源蛋白质支架中的功能性多肽的方法和组合物与流程

相关申请的交叉引用本专利申请要求美国临时专利申请号62/085,807(2014年12月1日提交)和62/222,384(2015年9月23日提交)的优先权。在先申请的全部公开内容以引用方式全文并入本文并用于全部目的。
背景技术：
：功能蛋白或多肽(例如，激素)通常需要修饰以便提供更加期望的生物学特性，例如改善的稳定性、药代动力学或药理学特性。基本上蛋白质可被认为是通过n-端连接和c-端连接彼此连接的二级结构折叠体的整体。由于蛋白质结构测定的先进性，所以现在存在蛋白质中二级结构折叠体的大型且不断增长的菜单。因此，新的功能性多肽可通过将这些二级结构元件(客体)中的一些插入新的蛋白质配偶体(宿主)来修饰。存在与此类设想的修饰功能蛋白的方法相关联的问题。例如，蛋白质的功能通常需要三个维度的近似性和二级结构元件的适当折叠，在混合蛋白中这不能由本领域目前可获得的知识和技术容易地实现。感兴趣的功能性多肽的一个示例为人松弛素-2(松弛素)。其为属于人胰岛素-松弛素超家族的53-残基肽激素，所述人胰岛素-松弛素超家族还包括胰岛素、igf1和igf2、以及松弛素-1和松弛素-3。该肽首先作为怀孕的激素被发现，这是由于其对耻骨韧带的松弛效应(因此得名)和软化子宫颈以促进分娩。据报道松弛素诱导心输出量增加20％、全身血管阻力降低30％、全身动脉顺应性增加30％和怀孕期间肾血流量增加45％。现在已知松弛素赋予男性和女性两者的心血管效应，从而展示在调节心血管和肾功能方面的潜在的药理实用性。松弛素的生理效应由其通过松弛素/胰岛素样家族肽受体1(rxfp1)的信号传导来介导，这导致几种信号转导途径的调节。通过松弛素激活rxfp1诱导：(1)导致血管舒张的内皮素系统的上调；(2)通过调节胶原沉积、基质金属蛋白酶和金属蛋白酶表达的组织抑制因子、和整体组织体内平衡重塑细胞外基质；(3)通过降低炎性细胞因子，诸如肿瘤坏死因子-α和转化生长因子β的水平减轻炎症反应；以及(4)通过激活血管内皮生长因子(vegf)的转录的血管生成。松弛素也已经在各种临床和非临床研究中被评价为用于治疗急性心力衰竭、先兆子痫、高血压疾病、硬皮病、子宫颈成熟、纤维肌痛和口腔正畸的药理学试剂。发现松弛素在例如用于治疗急性心力衰竭的临床研究中具有高特异性和优异的安全性特征。然而，松弛素肽不可口服并且具有在5-15分钟范围内的短血清半衰期。本领域中需要产生具有改善的生物学和药理学特性的衍生的或修饰的功能蛋白或多肽(例如松弛素衍生物)的有效且稳健的方法。本发明解决了本领域中的这种和其它未满足的需要。技术实现要素：在一个方面，本发明提供用于产生嵌入异源蛋白质支架中的功能性衍生效应多肽的方法。所述方法包括：(a)用n-端接头的组合库和c-端接头的组合库修饰靶效应多肽以产生经修饰效应多肽群，(b)将经修饰效应多肽插入异源蛋白质支架中以产生候选衍生效应多肽的组合库，(c)从候选衍生效应多肽的库中鉴定具有效应多肽的生物学功能或信号传导活性的一个或多个成员。所述方法因此允许形成并鉴定嵌入异源蛋白质支架中的功能衍生效应多肽。在本发明的一些方法中，采用的异源蛋白质支架是抗体支架。在这些方法的一些中，修饰效应多肽通过取代抗体支架的互补决定区(cdr)而插入抗体支架中。在一些方法中，n-端接头和c-端接头各自包含随机化肽序列。例如，n-端接头可包含氨基酸序列xa(gbsc)n(seqidno:86)或xa(scgb)n(seqidno:87)，并且c-端接头可包含氨基酸序列(gesf)mxd(seqidno:88)或(sfge)mxd(seqidno:89)。在这些序列中，x为任何氨基酸残基，g为甘氨酸，s为丝氨酸，m和n各自独立地介于1和6之间(包括1和6)；a和d各自独立地介于1和5之间(包括1和5)；b和e各自独立地介于0和6之间(包括0和6)；并且c和f各自独立地介于0和2之间(包括0和2)。此外，当n(或m)大于1时，任何富含gs的重复序列中的b(或e)和c(或f)可分别不同于其它富含gs的重复序列中的b(或e)和c(或f)。在本发明的方法的各种实施方案中，(a)和(b)各自重组地进行。在一些方法中，(c)经由其中表达候选衍生效应多肽的报告细胞的基于自分泌的表型筛选来进行。在这些方法的一些中，采用的效应多肽为细胞受体的配体，例如激素。在本发明的一些方法中，采用的效应多肽具有介于约5kda至约25kda之间的分子量。在一些实施方案中，在自分泌选择中采用的报告细胞响应于细胞中效应多肽的表达。在一些方法中，候选衍生效应多肽经由慢病毒载体在报告细胞中表达。在一些实施方案中，表达的候选衍生效应多肽的库连接至细胞膜。在一些其它实施方案中，表达的候选衍生效应多肽选自细胞。在本发明的各种实施方案中，用于嵌入效应多肽的抗体支架为单链抗体，例如单链可变区片段(scfv)。在一些实施方案中，抗体支架在插入修饰效应多肽时保留其抗原-结合活性。本发明的一些方法涉及产生和选择嵌入异源蛋白质支架中的瘦素或单链卵泡刺激激素(scfsh)的功能性衍生多肽。在这些方法的一些中，n-端接头和c-端接头各自包含(a)3至5个随机残基的序列和(b)ggggs(seqidno:4)的1至5个串联重复序列。在一些实施方案中，n-端接头包含xxx(ggggs)1～3(seqidno:35)的序列，并且c-端接头包含(ggggs)1～3xxx(seqidno:36)的序列。本发明的一些方法涉及产生和选择松弛素(screlaxin)分子(例如人松弛素-2)的单链变体的功能衍生多肽。在这些方法的一些中，松弛素分子的单链变体包括由具有(gs)n(seqidno:44)的序列的接头连接的a链和b链，其中n＝3-5。在一些方法中，n-端接头包含氨基酸序列xa(ggggs)b(gggs)c(ggs)d(seqidno:82)或xa(ggs)e(seqidno:83)，并且c-端接头包含氨基酸序列(sgggg)f(sg)gxa(seqidno:84)或(sgggg)fsgxa(seqidno:85)。在这些序列式中的每一个中，x为随机化氨基酸残基，a介于2和4之间(包括2和4)，b和f各自介于1和2之间(包括1和2)，e介于1和3之间(包括1和3)，并且c、d和g各自独立地介于0和2之间(包括0和2).在另一方面，本发明提供修饰效应多肽，其包括嵌入并取代抗体支架的互补决定区(cdr)的效应多肽，其中所述效应多肽通过n-端接头和c-端接头连接至抗体序列。在一些实施方案中，n-端接头包含氨基酸序列xa(gbsc)n(seqidno:86)或xa(scgb)n(seqidno:87)，并且c-端接头包含氨基酸序列(gesf)mxd(seqidno:88)或(sfge)mxd(seqidno:89)。在这些序列中，x为任何氨基酸残基，g为甘氨酸，s为丝氨酸，m和n各自独立地为1至6的随机数；a和d各自独立地为1至5的随机数；b和e各自独立地为0至6的随机数；并且c和f各自独立地为0至2的随机数。此外，当n(或m)大于1时，任何富含gs重复序列中的b(或e)和c(或f)可分别不同于其它富含gs重复序列中的b(或e)和c(或f)。本发明中还提供编码本文所述的修饰效应多肽的分离或重组多肽，以及包含此类多核苷酸序列的表达载体和宿主细胞。在本发明的修饰效应多肽的一些中，效应多肽为细胞受体的配体。例如，效应多肽可以为激素分子。在一些实施方案中，嵌入抗体支架中的效应多肽具有介于约5kda至约25kda之间的分子量。在一些实施方案中，用于容纳效应多肽的抗体支架为单链可变区片段(scfv)。在本发明的一些修饰效应多肽中，单链抗体支架具有以seqidno:l示出的氨基酸序列，并且抗体支架中的hcdr3(lgitktstcyt；seqidno:3)由效应多肽取代。在本发明的一些修饰效应多肽中，效应多肽为瘦素或scfsh。在这些实施方案中的一些中，n-端接头和c-端接头中的每一个包含随机化序列。在一些实施方案中，n-端接头序列包含序列xxx(ggggs)1～3(seqidno:35)，并且c-端接头序列包含序列(ggggs)1～3xxx(seqidno:36)。本发明的一些修饰效应多肽包含利用n-端接头和c-端接头嵌入fv支架中的人瘦素，所述n-端接头和c-端接头分别与下列基本上相同：(1)lgvggggs(seqidno:5)和ggggsert(seqidno:6)；(2)hltggggs(seqidno:7)和gsggsggggsdps(seqidno:8)；(3)pwaggggsggggsggggs(seqidno:9)和ggggsqpp(seqidno:10)；(4)ktsggggsggggs(seqidno:l1)和ggggssde(seqidno:12)；(5)kvtggggs(seqidno:13)和ggggsqle(seqidno:14)；或(6)rhmggggs(seqidno:37)和ggggsggggstdt(seqidno:38)。本发明的一些修饰效应多肽包含利用n-端接头和c-端接头嵌入scfv支架中的单链人fsh，所述n-端接头和c-端接头分别与下列基本上相同：(1)rshggggs(seqidno:15)和ggggsvnp(seqidno:16)；(2)qrvggggs(seqidno:17)和ggggsggggsrsa(seqidno:18)；或(3)rvlggggs(seqidno:19)和ggggsggggsqss(seqidno:20)。在本发明的一些其它修饰效应多肽中，嵌入效应多肽为单链人松弛素-2(screlaxin)。在这些分子的一些中，单链松弛素多肽包含由连接序列(gs)n(seqidno:44)连接的a链和b链，其中n＝3-5。在一些实施方案中，screlaxin利用n-端接头序列xxxggggsgggsggs(seqidno:78)或xxxggsggs(seqidno:79)，和c-端接头序列sggggsggggsgxxx(seqidno:80)或sggggsxxx(seqidno:81)嵌入宿主scfv抗体支架中，其中x为任何随机化残基。在一些实施方案中，用于嵌入screlaxin的n-端接头序列和c-端接头序列分别与下列所示的序列基本上相同：(1)rtrggsggs(seqidno:50)和sggggslms(seqidno:51)(克隆体a3)；(2)rtrggsggs(seqidno:50)和sggggskpp(seqidno:52)(克隆体a12-2)；(3)plnggsggs(seqidno:53)和sggggskpp(seqidno:52)(克隆体c12-1)；(4)lprggggsgggsggs(seqidno:54)和sggggslds(seqidno:55)；(5)qttggsggs(seqidno:56)和sggggskgt(seqidno:57)；(6)hmfggsggs(seqidno:58)和sggggskap(seqidno:59)；(7)qrgggsggs(seqidno:60)和sggggswsp(seqidno:61)；(8)rqrggggsgggsggs(seqidno:62)和sggggsvra(seqidno:63)；(9)rltggsggs(seqidno:64)和ssggwsagggsgvrs(seqidno:65)；或(10)rnrggggsggrsggs(seqidno:66)和sggggsggggsggrp(seqidno:67)。在一些实施方案中，用于将screlaxin嵌入scfv抗体支架中的n-端接头序列和c-端接头序列分别与下列中所示的序列相同：(1)rtrggsggs(seqidno:50)和sggggslms(seqidno:51)(clonea3)；(2)rtrggsggs(seqidno:50)和sggggskpp(seqidno:52)(clonea12-2)；或(3)plnggsggs(seqidno:53)和sggggskpp(seqidno:52)(clonec12-1)。在本发明的一些修饰松弛素分子中，嵌入并取代hcdr3环lgitktstcyt(seqidno:3)的screlaxin(包括接头序列)具有seqidno:69、seqidno:71或seqidno:72中所示的氨基酸序列。本发明的修饰人松弛素分子的一些具体示例包含与选自seqidno:68-77的序列基本上相同的氨基酸序列。在另一方面，本发明提供用于治疗或预防与受试者的瘦素缺乏相关联或由瘦素缺乏介导的疾病或病症的发展的方法。所述方法包括向受试者给药包含治疗有效量的本文所述的修饰或衍生瘦素多肽的药学组合物。这些方法中的一些涉及治疗患有肥胖症、脂肪代谢障碍、下丘脑性闭经或先天性瘦素缺乏症的受试者。在另一个方面，本发明提供用于治疗和预防与受试者的fsh缺乏相关或由fsh缺乏介导的疾病或病症发展的方法。这些方法包括向受试者给药包含治疗有效量的本发明的修饰或衍生scfsh多肽的药物组合物。这些方法中的一些涉及治疗患有性腺机能减退、多囊卵巢综合征、卡尔曼综合征、下丘脑抑制、垂体机能减退、高催乳素血症或性腺功能低下症的受试者。在另一个方面，本发明提供用于治疗或预防与受试者中的松弛素-2缺乏或受损的松弛素-2信号传导相关联或由此介导的疾病或病症发展的方法。所述方法包括向受试者给药包含治疗有效量的本发明的修饰或衍生松弛素分子的药物组合物。这些方法中的一些涉及治疗患有心力衰竭、纤维化、高血压、硬皮病或癌症的患者。本发明的另外的方面和实施方案，以及本发明的具体特性和优点描述于说明书的剩余部分和权利要求中。附图说明图1a-1e示出基于自分泌的稳定细胞系的构建。a，用于leprsie-bla细胞的自分泌细胞构建的元件的示意图。b，ha-标记的lepr在leprsie-bla细胞中的表达，用抗ha抗体检测。c，leprsie-bla对1ng/ml瘦素的应答。d，用于fshrcre-bla细胞的自分泌细胞构建的元件的示意图。e，fshrcre-bla细胞对1ng/mlfsh的应答。图2a-2c示出嵌入抗体支架中的瘦素或scfsh分子的体外活性。a，使用leprsie-bla细胞测量所选嵌入瘦素克隆体的瘦素ec50的fret测定。fab、igg和天然瘦素的ec50分别为118.3pm、58.7pm和313.4pm。b，使用baf3lepr细胞测量所选嵌入瘦素克隆体的ec50的增殖测定。fab、igg和天然瘦素的ec50分别为131.9pm、37.2pm和309.6pm。c，使用fshrcre-bla细胞测量所选嵌入fsh克隆体中的fsh的ec50的fret测定。igg-scfsh、scfsh和天然fsh的ec50分别为5.5pm、5.7pm和4.6pm。图3a-3c示出igg-瘦素调节体内代谢。a，igg-瘦素在体温下稳定并具有增加的循环半衰期。上半部分，将瘦素或igg-瘦素加载到渗透泵中，所述渗透泵被皮下植入。在植入之后3天通过elisa测量泵内的瘦素和igg-瘦素的浓度。下半部分，单剂量的瘦素或igg-瘦素经由颈静脉给药，并且血浆中的蛋白质浓度通过在不同时间点下的眼窝出血来测定。b，igg-瘦素激活下丘脑中的stat3。瘦素或igg-瘦素外周给药或中心给药，并且通过免疫组织化学检查下丘脑中stat3的神经元活化。c，igg-瘦素在体内实施代谢功能。将瘦素或igg-瘦素外周给药或中心给药于ob/ob小鼠，或外周给药于野生型小鼠。在治疗之前和之后的指定时间点下记录体重和摄食量。在食疗开始和结束时测量身体脂肪组成。图4示出igg-瘦素的代谢效应在db/db或dio小鼠中消除。将瘦素或igg-瘦素外周给药于db/db或dio小鼠。在治疗之前和之后的指定时间点下记录体重和摄食量。在治疗开始和结束时测量身体脂肪组成。图5示出9个抗体支架screlaxin克隆体的激动剂活性及其在细胞培养上清液中的表达水平。图6示出10个鉴定的抗体嵌入screlaxin-h2克隆体的氨基酸序列(分别为seqidno:68-77)。还示出了末端接头、松弛素-h2的a链和b链、以及链间连接子的序列。图7示出在考马斯蓝染色的sds-page凝胶中纯化的抗体嵌入screlaxin激动剂分子，a3、c12-2和c12-1。图8示出纯化的抗体嵌入screlaxin激动剂分子a3、c12-2和c12-1的体外活性。图9示出scfv抗体支架和其上的五个位点的结构，其用于取代短的随机肽以研究抗体支架的cdr区外客体序列插入的耐受性。具体实施方式i.概述本发明部分地依据由发明人进行的研究以产生修饰或衍生的功能性多肽(例如，瘦素、卵泡刺激激素(fsh)和松弛素分子)，其插入异源蛋白质支架(例如，抗体支架)中并且保留了初始功能性多肽的全部信号传递或生物学活性。具体地讲，发明人研究其中插入功能性多肽分子的抗体是否可被选择用于在基于自分泌的表型筛选中起作用。优选地，宿主蛋白质支架为人抗体支架，诸如本文所述的scfv人抗体。作为示例，客体抗体支架中的cdr环(例如，hcdr3蛋白质环)分别用激素瘦素、单链fsh或单链松弛素-h2的全长序列取代。这些筛选允许发明人从用于将客体多肽序列连接至宿主支架的连接序列的组合库中实验性选择。通过测试非常大量的不同连接，确定允许客体元件的适当功能的连接。在选择嵌入另一蛋白质支架的功能性多肽时，发明人首先生成用于将客体二级或三级结构(客体多肽或蛋白质)结合到异源宿主蛋白质支架中的不同连接序列的库。具体地，将功能性多肽插入约107个不同n-端和c-端连接的大组合库之间。然后在基于自分泌的表型筛选中选择允许起作用的连接。因为研究非常大量的候选者，所以将稳健的自分泌报告体系用于选择允许连接。利用此类自分泌选择体系，数百万潜在的激动剂及其受体在细胞中表达，使得每个细胞具有同源受体和潜在激动剂库中的一个成员。使用现代细胞分选方法，可每小时筛选约2千万个组合连接以获得允许起作用的那些。如本文所例示的，将组合连接用于插入客体多肽和自分泌选择形式使得发明人能够鉴定嵌入抗体支架中的功能性衍生瘦素、scfsh和screlaxin分子。根据这些研究，本发明提供用于生成嵌入另一蛋白质支架(例如，抗体支架)中的效应多肽的功能性衍生物的方法。本文所述的大多样性体系和稳健的选择方案适用于例如在用于设计和选择具有改善的药代动力学特性的重组治疗多肽的方法中，由已知的治疗多肽或蛋白质试剂构建新的衍生治疗蛋白质。本发明的方法还可用于解决一般的蛋白质折叠问题，其中可研究插入蛋白质的任何位置中的哪些新序列使得折叠路径沿天然或甚至新的途径进行。本发明另外提供嵌入抗体支架中的特异性功能瘦素、scfsh或screlaxin多肽。由于其改善的生物学和/或药理学特性(例如，稳定性和体内半衰期)，本发明的衍生效应多肽(例如，本文所例示的瘦素、scfsh或screlaxin衍生多肽)可用于各种治疗或其它工业应用中。以下部分为实施本发明提供了更详细的指导。ii.定义除非另有限定，本文使用的所有技术和科学术语均具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解相同的含义。以下参考文献向技术人员提供了用于本发明的许多术语的一般定义：academicpressdictionaryofscienceandtechnology，morris(编辑)，academicpress(第一版，1992)；oxforddictionaryofbiochemistryandmolecularbiology，smith等人(编辑)，oxforduniversitypress(修订版，2000)；encyclopaedicdictionaryofchemistry，kumar(编辑)，anmolpublicationspvt.ltd.(2002)；dictionaryofmicrobiologyandmolecularbiology，singleton等人(编辑)，johnwiley&sons(第3版，2002)；dictionaryofchemistry，hunt(编辑)，routledge(第1版，1999)；dictionaryofpharmaceuticalmedicin，nahler(编辑)，springer-verlagtelos(1994)；dictionaryoforganicchemistry，kumar和anandand(编辑)，anmolpublicationspvt.ltd.(2002)；和adictionaryofbiology(oxfordpaperbackreference)，martin和hine(编辑)，oxforduniversitypress(第4版，2000)。另外，提供以下定义以帮助读者实施本发明。标准技术用于本发明实践中所使用的分子、遗传和生物化学方法。参见，一般来讲，sambrook等人，molecularcloning：alaboratorymanual，coldspringharborpress，n.y.(第3版，2000)；brent等人，currentprotocolsinmolecularbiology，johnwiley&sons,inc.(ringbou编辑，2003)；guthrie等人，guidetoyeastgeneticsandmolecularbiology，academicpress,inc.(2002)；white等人，pcrprotocols，academicpress,inc.(1990)；freshney，cultureofanimalcells，wiley-liss(2005)；以及murray等人，genetransferandexpressionprotocols，thehumanapressinc.(1991)。术语“抗体”或“抗原-结合片段”是指一个或多个多肽链，其表现出对给定抗原、表位或多个表位的强一价、二价或多价键合。除非另有说明，用于本发明的抗体或抗原-结合片段可具有衍生自任何脊椎动物、骆驼科动物、鸟类或鱼纲物种的序列。它们可使用任何合适的技术，例如，杂交瘤技术、核糖体展示、噬菌体展示、基因重排库、半合成或全合成库或它们组合来生成。除非另有说明，如本发明所用的，术语“抗体”包括完整抗体、抗原-结合多肽片段和下文所述或本领域所熟知的其它设计抗体(参见，例如，serafmi,jnucl.med.34:533-6,1993)。完整“抗体”通常包括由二硫键互相连接的至少两个重(h)链(约50-70kd)和两个轻(l)链(约25kd)。编码抗体链的公认的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定区基因、以及无数个免疫球蛋白可变区基因。轻链分类为κ或λ。重链分为γ、μ、α、δ或ε，这继而限定免疫球蛋白类型，分别为igg、igm、iga、igd和ige。抗体的每个重链由重链可变区(vh)和重链恒定区组成。重链恒定区由三个结构域ch1、ch2、和ch3组成。每个轻链由轻链可变区(vl)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域，cl组成。重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子(包括免疫系统的各种细胞和经典补体系统的第一组分(clq))的结合。抗体的vh和vl区可进一步细分为高变区域，也称为互补决定区(cdr)，其穿插有更保守的框架区(fr)。每个vh和vl由以下顺序从氨基端到羧基端布置的三个cdr和四个fr组成：fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3、fr4。cdr和fr区的位置和编号系统已经由例如kabat等人，sequencesofproteinsofimmunologicalinterest，u.s.departmentofhealthandhumanservices，u.s.governmentprintingoffice(1987和1991)来定义。用于本发明的抗体还包括抗体片段或抗原-结合片段，其包含保留结合同源抗原能力的完整抗体的抗原-结合部分。此类抗体片段的示例包括(i)fab片段，由vl、vh、cl和ch1结构域组成的一价片段；(ii)f(ab')2片段，包含由铰链区处的二硫桥连接的两个fab片段的二价片段；(iii)由vh和ch1结构域构成的fd片段；(iv)由完整抗体的单臂的vl和vh结构域构成的fv片段；(v)二硫稳定化fvs(dsfvs)，其具有在结构保守的框架区之间工程化的链间二硫键；(vi)单结构域抗体(dab)，其由vh结构域构成(参见，例如，ward等人，nature341：544-546,1989)；和(vii)分离的互补决定区(cdr)。在本发明的一些实施方案中，抗体支架具有嵌入效应多肽但保留其对同源抗原的结合活性。适用于实施本发明的抗体还包括单链抗体。术语“单链抗体”是指包含以多肽连接的vh结构域和vl结构域的多肽，其一般经由间隔肽连接，并且其可包含在氨基端和/或羧基端处的附加结构域或氨基酸序列。例如，单链抗体可包含用于连接至编码多核苷酸的连接链段。例如，单链可变区片段(scfv)是单链抗体。与由独立的基因编码的fv片段的vl和vh结构域相比，scfv具有由合成接头连接(例如，经由重组方法)的两个结构域。这使得其形成为单蛋白链，其中vl和vh区成对以形成一价分子。在一些优选的实施方案中，用于本发明的单链抗体为人抗体。可用于实施本发明的抗体还包括单链抗原-结合单元，其具有骆驼支架。骆驼族中的动物包括骆驼、美洲驼和羊驼。骆驼产生没有轻链的功能性抗体。重链可变(vh)结构域自主折叠并独立地用作抗原-结合单元。与经典抗原-结合分子(fab)或单链可变片段(scfv)中的六个cdr相比，其结合表面仅包括三个cdr。骆驼抗体能够获得与那些常规抗体相当的结合亲和力。本文所述的各种抗体或抗原-结合片段可通过完整抗体的酶促修饰或化学修饰来制备，或使用重组dna方法从头合成，或使用噬菌体展示库鉴定。用于生成这些抗体或抗原-结合分子的方法全部是本领域所熟知的。例如，单链抗体可使用噬菌体展示库或核糖体展示库、基因重组库来鉴定(参见，例如，mccafferty等人，nature348:552-554,1990；和美国专利4,946,778)。具体地讲，scfv抗体可使用bird等人，science242:423-426，1988；和huston等人，proc.natl.acad.sci.usa85:5879-5883，1988中所述的方法来获得。fv抗体片段可如skerra和pliickthun，science240:1038-41，1988中所述生成。二硫稳定化fv片段(dsfvs)可使用例如reiter等人，int.j.cancer67:113-23，1996中所述的方法来制备。类似地，单结构域抗体(dabs)可通过描述于例如，ward等人，nature341:544-546，1989；和cai和garen，proc.natl.acad.sci.usa93:6280-85，1996中的各种方法来制备。骆驼单结构域抗体可使用本领域中熟知的方法来制备，例如，dumoulin等人，naturestruct.biol.11:500-515，2002；ghahroudi等人，febsletters414:521-526，1997；和bond等人，jmolbiol.332:643-55，2003。其它类型的抗原-结合片段(例如，fab、f(ab')2或fd片段)还可利用常规实施的免疫学方法容易地制备。参见，例如，harlow和lane，usingantibodies，alaboratorymanual，coldspringharborlaboratorypress，coldspringharbor，newyork，1998。结合亲和力通常根据平衡缔合常数或解离常数(分别为k或kd)表示，它们继而是解离速率常数和缔合速率常数(分别为kd和ka)的倒数比。因此，同等亲和力可对应于不同的速率常数，只要速率常数的比例保持相同即可。如本文所用，术语“包括”或“包含”在提及本发明所必要的组合物、方法、和相应组分时使用，但开放以纳入未指定的元素，无论其是否必要。如本文所用，术语“基本上由……构成”是指给定实施方案所需要的那些元素。所述术语允许存在实质上不影响本发明的该实施方案的基本的和新的或功能性特征的元素。术语“由……构成”是指如本文所述的组合物、方法及其相应组分，其不包括在实施方案的所述描述中未列出的任何元素。术语“接触”具有其正常含义并且是指将两种或更多种试剂(例如，效应多肽试剂和受体蛋白质)组合或将试剂和细胞组合。如本文所用，接触可在体外进行，例如在试管或其它容器中将多肽库与细胞群混合。接触也可在体内进行，例如在多肽和另一分子(诸如宿主细胞内或受试者体内的受体蛋白)之间进行。“嵌入抗体支架中的受体多肽的衍生物”或“嵌入效应多肽衍生物的抗体支架”是指融合多肽，其中效应多肽(客体多肽)插入抗体序列(例如，宿主支架)的特异性表位或结构域中并取代所述特异性表位或结构域。通常，效应多肽经由n-端接头序列和/或c-端接头序列插入宿主支架中。如本文所用，效应多肽或功能性多肽是指具有细胞(例如，信号传导)或生物化学(例如，酶)功能的任何多肽、寡肽或短肽。在一些实施方案中，待用于实施本发明的效应多肽或功能多肽能够通过选择性结合到宿主细胞中的受体分子来调节细胞应答或引发信号传导事件。待通过效应多肽调节的细胞活性可以为例如酶活性、基因表达、或细胞信号传导。效应多肽的示例包括但不限于细胞因子、生长因子、神经营养因子、整合素、细胞粘附分子、酶底物、其它激素和细胞表面受体的多肽配体。“融合”蛋白质或多肽是指由至少两个多肽和将两个多肽可操作地连接成一个连续多肽的连接序列或连接组成的多肽。在融合多肽中连接的两个多肽通常衍生自两个独立的源，因此融合多肽包括在自然界中通常不连接地存在的两个连接的多肽。fsh是在人类和其它动物中发现的激素。其由垂体前叶的促性腺激素合成和分泌。fsh调节身体的发育、生长、青春期成熟和生殖过程。人fsh是包含α和β亚基的35.5kd糖蛋白二聚体。α亚基(fshα)包含92个氨基酸，然而β亚基(fshβ)具有111个氨基酸。β亚基赋予其特异性生物学作用并负责与fsh-受体相互作用。在两个或更多个核酸或多肽序列的情况下，术语“相同”或百分比“同一性”是指两个或更多个序列或子序列相同。如使用以下序列比较算法中的一个或通过手动比对和目视检测所测量的，在比较窗或指定区域范围内比较和比对最大对应性时，如果两个序列具有特定百分比的相同氨基酸残基或核苷酸(即，在指定区域内，或者，当未指定时，在整个序列内的60％同一性，另选地65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同一性)，则两个序列是“基本上相同的”。同一性存在于至少约50个核苷酸(或10个氨基酸)长度的区域内，或更优选地存在于100至500个或1000或更多个核苷酸(或20、50、200或更多个氨基酸)长度的区域内。术语“分离”是指将分子从其天然环境中移除。然而，与其一起发现的一些组分可继续与“分离的”蛋白质一起存在。因此，“分离的多肽”不像其在自然界中呈现的那样，而是可能显著小于100％纯蛋白。用于比较的序列比对方法在本领域中为人们所熟知。用于比较的最佳序列比对可通过以下方法进行：局部同源算法(smith和waterman，adv.appl.math.2:482c，1970)；同源比对算法(needleman和wunsch，j.mol.biol.48:443，1970)；搜索相似性法(pearson和lipman，proc.nat'l.acad.sci.usa85:2444，1988)；这些算法的计算机化实施(wisconsin遗传软件包(geneticscomputergroup，madison，wi)中的gap、bestfit、fasta和tfasta)；手动比对和视觉检测(参见，例如，brent等人，currentprotocolsinmolecularbiology，johnwiley&sons,inc.(ringbou编辑，2003))。适用于测定百分比序列同一性和序列相似性的算法的两个示例为blast和blast2.0算法，其分别描述于altschul等人，nuc.acidsres.25:3389-3402，1977；和altschul等人，j.mol.biol.215:403-410，1990中。除了上述序列同一性的百分比之外，两种核酸序列或多肽基本上相同的另一个指示是由第一核酸编码的多肽与针对由第二核酸编码的多肽产生的抗体具有免疫交叉反应性，如下所述的。因此，多肽通常与第二多肽基本上相同，例如，在两种肽仅在保守取代上不同的情况下。两个核酸序列基本上相同的另一个指示是两个分子或其互补物在严格条件下彼此杂交，如下所述。两个核酸序列基本上相同的另一个指示是相同的引物可用于扩增序列。瘦素，饱腹激素，是由脂肪细胞制成的激素，其调节储存在体内的脂肪量。其通过调节饥饿的感觉和调节能量消耗来实现。当储存的脂肪量达到某个水平时，抑制饥饿(饱腹感)。然后瘦素分泌并通过身体循环，最终激活下丘脑弓形核中的瘦素受体。能量消耗通过对大脑发信号和直接经由外周靶上的瘦素受体两者来增加。瘦素的作用与胃饥饿素(“饥饿激素”)的作用相反。胃饥饿素受体与瘦素受体位于同一脑细胞上，所以这些细胞接受竞争性饱腹感和饥饿信号。瘦素和胃饥饿素连同许多其它激素一起参与能量平衡的复杂过程。“连接”是指可操作地或功能性连接两个生物分子(例如，多肽或编码两个多肽的多核苷酸)的方式，其包括但不限于重组融合、共价键、二硫键、离子键、氢键和静电键。“熔合”是指通过共价键连接。“接头”或“间隔段”是指连接两个生物分子并且用于以具有最小空间位阻的优选构型放置两个分子的分子或分子组。当涉及核酸时，术语“可操作地连接”是指多核苷酸元素以功能性关系连接。当核酸放置成与其它核酸序列成功能性关系时，核酸“可操作地连接”。例如，如果启动子或增强子影响编码序列的转录，则其可操作地连接至编码序列。可操作地连接是指被连接的dna序列通常是连续的，并且在必须接合两个蛋白质编码区的情况下是连续的并且在阅读框中。如本文所用，术语“多核苷酸”或“核酸”是指任何长度的核苷酸(核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸)的聚合物形式，其包含嘌呤和嘧啶碱基或其它天然、化学或生物化学修饰的、非天然或衍生化核苷酸碱基。本发明实施方案的多核苷酸包括可以从天然源分离、重组产生或人工合成的脱氧核糖核苷酸(dna)、核糖核苷酸(rna)或核糖多核苷酸(cdna)的dna拷贝的序列。多核苷酸的另一示例为聚酰胺多核苷酸(pna)。多核苷酸和核酸可以单链或双链形式存在。多核苷酸的主链可包括糖和磷酸根基团，如通常可存在于rna或dna中的，或经修饰或取代的糖或磷酸根基团。多核苷酸可包括经修饰的核苷酸，诸如甲基化核苷酸和核苷酸类似物。核苷酸的序列可由非核苷酸组分中断。由核苷酸如核酸、多核苷酸制成的聚合物在本文中也可称为核苷酸聚合物。多核苷酸为由通过酰胺键(肽键)连接在一起的氨基酸残基单体组成的聚合物链。氨基酸可以为l-旋光异构体或d-旋光异构体。一般来讲，多肽是指氨基酸残基的长聚合物，例如由至少多于10、20、50、100、200、500或更多个氨基酸残基单体构成的那些。然而，除非另有说明，如本文所用，术语多肽还包括短肽，其通常包含两个或更多个氨基酸单体但通常不超多10、15、或20个氨基酸单体。蛋白质为经由肽键连接的氨基酸的长聚合物，并且其可由两个或更多个多肽链组成。更具体地，术语“蛋白质”是指以特定顺序由一个或多个氨基酸链组成的分子；例如，如由编码该蛋白质的基因中的核苷酸的碱基序列确定的顺序。蛋白质对于身体的细胞、组织和器官的结构、功能和调节是必需的，并且每种蛋白质具有独特的功能。示例为激素、酶和抗体。在一些实施方案中，术语多肽和蛋白质可以互换使用。术语“参考多肽”或“靶多肽”在本文中还用于指可用于本发明方法中以产生嵌入另一蛋白质支架(例如，抗体支架)中的衍生多肽的感兴趣的分子。优选地，用于实施本发明的靶多肽是可以调节或引起宿主细胞中细胞应答的信号传递分子。天然功能性松弛素分子通常包含a链和b链。如同胰岛素，松弛素最初在核糖体上合成，作为未成熟的前激素原、松弛素原，作为附接到n-端信号序列的单链结构。信号序列指导肽从核糖体泛素转运。信号肽丢失之后，通过共翻译修饰将松弛素原转化为激素原。蛋白水解激素原以除去c-链，然后产生a和b链组合，从而形成成熟的活性2-链异二聚体肽。在该双链结构中，a链和b链通过三个二硫键交联，其中连接a链和b链的两个二硫键和a链中的链内二硫键。在人松弛素-2的情况下，其a链和b链分别包含24个氨基酸(qlysalankcchvgctkrslarfc)(seqidno:42)和29个氨基酸(dswmeeviklcgrelvraqiaicgmstws)(seqidno:43)，其通过三个二硫键交联。当此类多核苷酸已被引入细胞内时，细胞已由外源或异源多核苷酸“转化”。转化的多核苷酸可以或可以不整合(共价连接)到细胞的基因组中。例如，在原核生物、酵母和哺乳动物细胞中，转化的多核苷酸可保留在附加体元件诸如质粒上。关于真核细胞，稳定转化的细胞是其中转化的多核苷酸已整合到染色体中使得其通过染色体复制由子细胞遗传的细胞。该稳定性由真核细胞建立细胞系或克隆体的能力来展示，所述细胞系或克隆体由包含转化的多核苷酸的子细胞群组成。“克隆体”是通过有丝分裂衍生自单细胞或共同祖先的细胞群。“细胞系”是能够在体外稳定生长多代的原代细胞的克隆体。参考多肽的“变体”是指具有衍生自或类似于参考多肽的结构的分子。通常，变体以可控方式或随机方式通过参考多台的化学或生物学修饰来获得。用于进行多肽的重组修饰的方法是本领域所熟知的，例如位点特异性诱变、易错pcr、限制性消化和降解以及多核苷酸重组。“载体”或“构建体”是复制子，诸如质粒、噬菌体或粘粒，另一个多核苷酸段可对其附接以便引起附接段的复制。能够指导编码一种或多种多肽的基因表达的载体称为“表达载体”。iii.用于生成嵌入另一蛋白质中的功能性多肽的一般方案本发明提供用于产生和选择功能性衍生蛋白质或多肽的方法，其中效应多肽(或“客体多肽”)嵌入不同的或异源蛋白质支架中。异源蛋白质支架可以为在天然或野生型环境中不连接至效应多肽的任何蛋白质序列或多肽序列。在一些实施方案中，异源支架(“宿主蛋白质”或“受体支架”)为抗体支架。各种效应多肽或效应分子可用于实施本发明。虽然本文定义了效应多肽，但适用于本发明的效应多肽还包括短功能性肽，例如，包含少至10个氨基酸残基的肽。考虑其生物学活性，效应多肽可具有任何生物化学性质。这些包括例如细胞因子、激素、生长因子和激素、细胞受体的肽或多肽配体。可用于本发明以生成嵌入另一蛋白质中的衍生多肽的效应多肽或肽的具体示例包括例如瘦素、胃饥饿素、fsh、松弛素、促甲状腺激素(tsh)、人绒毛膜促性腺激素(hcg)、白细胞介素、干扰素和tnfα。虽然本发明由几个功能性多肽(例如，瘦素、fsh、松弛素和其它免疫或信号传导调节子)作为效应多肽的示例在本文中相当详细地进行了说明，但其它效应多肽或功能蛋白还可用于实施本发明。除了其生物学功能或细胞功能的多样性之外，适用于本发明的效应多肽还可在其尺寸和天然结构方面具有显著差异。在一些实施方案中，效应多肽是野生型单链蛋白。在一些实施方案中，效应多肽是衍生自多链蛋白的单链分子。通常，效应多肽可以是包含至少约10个氨基酸残基的任何功能性多肽或肽。在一些实施方案中，效应多肽包含长度介于约10至约10,000个之间的氨基酸残基。在一些实施方案中，效应多肽包含长度介于约25至约1000个之间的氨基酸残基。在一些实施方案中，效应多肽包含长度介于约50至约250个之间的氨基酸残基。因此，适用于本发明的多肽或蛋白质可具有约1kda至约1,000kda，并且优选约2.5kda至约250kda的分子量。在一些更优选的实施方案中，采用的效应多肽具有约5kda至约25kda或50kda的分子量。为了选择嵌入另一蛋白质支架(例如，抗体支架)中的功能性衍生多肽，可在有助于维持或增强效应多肽的功能和稳定性的任何位置处，将天然效应多肽(或其功能片段)插入宿主支架中。这是指选择的插入位点理想地应当不会不利地影响效应物多肽的生物化学功能或其它生物学特性。在一些优选的实施方案中，所得的嵌合或融合分子应该保留至少25％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或更多的天然客体多肽的细胞活性或生物化学活性。在一些实施方案中，通过取代宿主蛋白的特异性表位，例如cdr环，将效应多肽插入宿主支架中。在各种实施方案中，插入位点的选择可基于宿主支架的序列同源性分析以定位可适应插入序列的区域。在一些实施方案中，宿主支架是抗体或抗原-结合片段。抗体支架可以是单链抗体片段，诸如本文例示的scfv。抗体支架也可以是完整抗体，例如igg分子。当使用多链抗体分子时，效应多肽序列通常插入一个免疫球蛋白链(例如轻链或重链)中。在这些实施方案中，用于表达衍生多肽(和/或用于功能选择)的宿主细胞通常也表达另一抗体链。另选地，表达衍生多肽的载体也可含有表达其它抗体链的第二开放阅读框。当抗体用作宿主支架时，由功能性多肽取代的表位可以是cdr或其部分，如本文所例示的。例如，通过取代受体支架的cdrh1环，可将效应多肽插入抗体支架中。在一些其它实施方案中，客体多肽可以在cdrh1和/或其它cdr区域外的位点处插入宿主支架中。如本文详述的(例如实施例9)，还发现在cdr环外部的几个位点处将短肽插入本文所例示的scfv抗体支架中是允许的。为有助于维持插入的客体效应多肽的天然生物化学功能或细胞功能，将n-端接头和c-端接头用于将天然效应多肽插入宿主支架中。为产生用于将天然多肽插入宿主支架的接合点的多样性，使用接头序列的组合库(“组合连接库”)产生包含具有嵌入的天然效应多肽的宿主蛋白质支架的杂交分子的组合库。通过在效应序列的n-端和c-端两者处加入连接点，效应多肽可产生大约105、106、107、108、109、1010或更高的衍生分子的多样性。接头序列的多样性使得能够从杂交分子库中选择包含接头序列的一个或多个成员，所述接头序列使得嵌入的天然多肽保留其生物学活性或信号传导活性中的一个或多个。取决于待嵌入宿主蛋白质支架中的特异性效应多肽，可将连接点的不同组合库用于本发明的选择方法中。在一些实施方案中，n-端接头和c-端接头包含相同的序列。在一些实施方案中，侧接效应序列的接头序列不同。在各种实施方案中，本发明的组合连接库的成员可包含长度至少4、5、6、8、10、15、20、25、30、40、50、75、100或更多个氨基酸残基。在一些优选的实施方案中，库的成员接头是短肽，例如，约5至约30个氨基酸的肽。所述肽可以为自然存在的蛋白质、随机肽或“偏性”随机肽的消化物。在一些实施方案中，随机化氨基酸序列用于接头中，例如，如本文所例示的用于选择功能性瘦素、scfsh或screlaxin衍生多肽。在一些实施方案中，组合库的成员接头是完全随机的，在任何位置处不具有序列偏好或恒定。在一些其它实施方案中，所述库可偏置，即序列内的一些位置保持恒定，或选自有限数量的可能性。例如，在一些情况下，氨基酸残基在以下物质的限定类型内随机化：例如疏水性氨基酸、亲水性残基、讽刺性地(satirically)偏性(小或大)残基、朝向半胱氨酸的形成、用于交联、sh-3结构域的脯氨酸、用于磷酸化位点的丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸或组氨酸、或嘌呤。在一些实施方案中，用于插入客体多肽的n-端接头和c-端接头中的每一个包含非随机化序列部分和随机化序列片段。在这些实施方案的一些中，n-端接头包含序列xa(gbsc)n(seqidno:86)或xa(scgb)n(seqidno:87)，并且c-端接头包含氨基酸序列(gesf)mxd(seqidno:88)or(sfge)mxd(seqidno:89)。在这些序列式中，x表示任何氨基酸残基，g为甘氨酸，s为丝氨酸，m和n各自独立地为1至6的随机数；a和d各自独立地为1至5的随机数；b和e各自独立地为0至6的随机数；并且c和f各自独立地为0至2的随机数。此外，当多个富含gs的重复序列或片段(gbsc、scgb、gesf或sfge)存在于接头序列中时(即，当n和/或m大于1时)，每个片段中的gly或ser残基数可独立地不同于其它片段中的gly或ser残基数。常规基因工程技术通常用于本发明中以产生接头序列并表达嵌入另一蛋白质支架中的衍生效应多肽的库。如本文所例示的，首先通过加入随机化n-端和c-端连接序列修饰编码效应多肽或变体的多核苷酸序列。然后，可将由连接序列的组合库侧接的效应序列克隆到宿主蛋白质支架(例如，抗体支架)中。为产生嵌入另一蛋白质支架中的候选功能性衍生多肽(例如，瘦素或其它激素)的库，可利用编码参考效应多肽(例如，瘦素)的基因或cdna序列中的任一种。除了全长序列之外，还可采用参考效应多肽的功能性活性变体或片段。在一些实施方案中，可使用来自各种物种的参考效应多肽的变体。在一些实施方案中，变体为编码参考效应多肽但由于遗传密码的简并性而保守地不同的序列。它们还包括与编码参考多肽的野生型序列基本上相同的序列。因此，合适的变体包括天然等位基因变体，例如由于导致编码蛋白质的氨基酸序列变化的序列多态性。此类变体可存在于群体，例如人群中的个体中。为实施本发明，所用序列的核苷酸序列多态性或氨基酸序列变化不应改变编码的效应多肽(例如瘦素或松弛素)的功能活性。参考效应多肽的适宜变体还包括例如已经使用定点诱变产生但仍然包含如本文所公开的参考效应多肽的生物学活性或信号传导活性的合成衍生核苷酸序列。这些包括，例如在不导致生物学活性或信号传导活性改变的一个或多个非必要残基处具有保守氨基酸取代基的变体。一旦将由组合连接序列的库侧接的效应序列插入宿主支架中，就可将嵌入宿主支架中的候选衍生效应分子的库引入用于表达和功能性选择的适当系统中。首先，将编码候选衍生多肽或修饰效应多肽的多核苷酸插入适宜的表达系统中以产生候选效应多肽的库。在一些实施方案中，表达载体可结合蛋白质收率参数从而能够选择具有改善的蛋白质生产的克隆体。例如，如本文所例示的，载体可包含编码融合到scfv支架的c-端的mcherry的序列。这允许通过在经由功能性测定(例如，本文所例示的fret测定)选择之前使用高mcherry信号的附加门来选择高表达克隆体。在表达时，各种候选衍生多肽可接触用于功能性选择的适当宿主细胞群或引入所述宿主细胞群中。在一些实施方案中，基于自分泌的选择系统用于功能性选择，如本文所例示的，用于选择功能性瘦素、fsh和松弛素多肽。就通过细胞受体(例如激素、细胞因子或其它类型的信号传导介质或受体配体)介导信号传导通路的效应多肽而言，宿主细胞通常表达效应多肽的相应细胞受体。在一些实施方案中，用于选择的所选宿主细胞不内生地表达效应多肽的细胞受体。在这些方法中，用于候选效应多肽的功能性选择的宿主细胞也可工程化以表达受体。就其它生物化学性质的效应多肽而言，例如，酶，可以容易地开发出响应由细胞表达的效应多肽的酶活性的适当报告系统。例如，可以采用许多众所周知的用于监测受体信号传导活性或酶活性的高通量形式的报告基因测定法并适应本发明的实施。参见，例如，andricopulo等人，curr.top.med.chem.，2009，9，771；dailey等人，exp.mol.pathol.，2009，86，141；lee等人，j.nat.prod.，2010，73，500；li等人，science，2009，325，161。可由本领域中熟知的标准程序或本文所述的具体示例进行用于表达和/或选择本发明的候选效应多肽库的细胞系的构建。用于表达多肽库的适宜宿主细胞或细胞系包括本文所例示的hek293t细胞和本领域中所熟知的许多其它细胞系，例如，hek293、cho、att20、bv2和n18细胞系。在一些实施方案中，嵌入抗体支架中的候选效应多肽由病毒载体，例如慢病毒载体表达。在这些方法中，可首先将编码候选效应多肽的组合库的载体(例如，慢病毒载体)的库引入病毒产生细胞系(例如，hek293t)中以提供编码多肽的病毒库。病毒产生细胞系可与用于选择功能性效应多肽的宿主细胞相同(例如，如本文所例示的hek293t细胞)或不同。在将病毒转染到表达效应多肽的受体的宿主细胞中时，候选多肽的库将在细胞中表达。在一些实施方案中，候选效应多肽的库表达为可溶性分子和分泌颗粒(例如，本文所例示的可溶性screlaxin分子)。在一些其它实施方案中，候选效应多肽表达为连接到细胞膜的分子的库。为表达候选效应多肽的膜连接库，抗体支架序列在n-端或c-端处可操作地连接至跨膜结构域。本发明的这些实施方案可使用本领域已知的任何跨膜蛋白质结构域，例如pdgfr跨膜结构域。参见，例如，remm等人，genomeres.10：1679-1689，2000；和hubert等人，celladh.migr.4：313-324，2010。在一些实施方案中，支架序列经由短接头肽或接头序列与跨膜结构域连接。例如，包含ggggs(seqidno:4)的串联重复序列的接头肽可用于连接跨膜结构域。为了鉴定嵌入宿主支架中的功能性多肽，可在每一轮选择之后，重复克隆和选择过程。一旦从报告基因测定法中鉴定候选功能性多肽(例如，激活同源受体)，编码候选多肽的相应多核苷酸序列就可分离、扩增和重新克隆到表达载体中以提供候选效应多肽的富集库。此类富候选效应子库可用于下一轮选择中，如本文所例示的，用于选择功能性screlaxin-h2激动剂多肽。在后续的选择轮次中，在先选择中鉴定的n-端接头或c-端接头可保持恒定并且其它接头可由先前所用的相同随机序列组成。本发明的多核苷酸和表达载体的构建可根据分子生物学的常规实施方法容易地进行。用于进行本发明所需步骤的一些具体方案也在本文中例示。多肽的表达可使用本领域已知的多种类型的适宜表达载体，包括例如，包含细菌、病毒、酵母、真菌、昆虫或哺乳动物表达系统的载体。如本文所示例的，用于产生本发明的融合多肽库的优选表达系统是基于慢病毒的。用于获得并使用此类表达载体的方法为人们所熟知。就用于本发明的组合物或方法的这种和其它分子生物学技术方面的指导而言，参见，例如，sambrook等人，olecularcloning，alaboratorymanual，当前版本，coldspringharborlaboratory，newyork；miller等人，geneticengineering，8:277-298(plenumpress，当前版本)，wu等人，methodsingenebiotechnology(crcpress，newyork，n.y.，当前版本)，recombinantgeneexpressionprotocols，inmethodsinmolecularbiology，第62卷(tuan编辑，humanapress，totowa，n.j.，当前版本)，和currentprotocolsinmolecularbiology(ausabel等人编辑)johnwiley&sons，ny(当前版本)，及其中引用的参考文献。可进一步检测嵌入宿主支架中的所选功能性效应多肽的体外和体内生物学或信号传导活性。取决于用于选择的特异性效应多肽，各种方法可用于确定鉴定的衍生多肽具有所需的特性。例如，如本文所例示的，为选择功能性瘦素衍生多肽，可经由fret测定或本文所详述的正交增殖测定来检测嵌入抗体支架中的经鉴定功能性瘦素分子的体外活性。还可进行经鉴定分子的体内研究来检测它们的体内活性，例如稳定性和其它生物活性，诸如穿过血脑屏障的能力和引发代谢反应。还可设计相似的研究来检查嵌入异源蛋白质支架中的任何其它经鉴定效应多肽的体外和体内活性，如本文对于多种嵌入特应性抗体的screlaxin-h2激动剂所例示的。iv.选择嵌入功能性瘦素或scfsh多肽的抗体如例示的，将多种特异性功能性多肽插入scfv抗体支架中，并根据上述方案选择所得融合多肽库的功能性。这些包括，例如在下文示例中所详述的瘦素和fsh。在本领域中已经分离并表征了来自人类和许多非人物种的瘦素基因。这些瘦素序列中的任一种可容易地用于本发明的实施中。参见，例如，zhang等人，nature372：425-32，1994；isse等人，j.biol.chem.270(46)，27728-27733，1995；iwase等人，res.vet.sci.68(2)，109-114，2000；konfortov等人，mamm.genome10，1142-1145，1999；和murakami等人，biochem.biophys.res.commun.209(3)，944-952，1995。此外，各种瘦素类似物还可用于构建本发明的瘦素融合分子。示例包括美曲普汀、peg-瘦素类似物和各种其它瘦素类似物。参见，例如muller等人，j.pept.sci.18：383-93，2012；salomon等人，prot.exp.purif.47：128-136，2006。美曲普汀(商品名myalept)为人瘦素的类似物。该化合物已经在日本被批准用于代谢紊乱，包括脂肪代谢障碍，并且还在美国被批准作为在先天性全身性或获得性全身性脂肪代谢障碍的人中的瘦素缺乏症(包括糖尿病和高甘油三酯血症)的并发症的治疗剂。可由本发明的方法产生并选择的这些瘦素类似物的功能性衍生物提供具有改善的活性的治疗试剂。人fsh的α和β亚基的核苷酸和氨基酸序列和来自许多其它非人种类的同源序列也是本领域已知的。参见，例如，saxena等人，j.biol.chem.251，993-1005，1976；watkins等人，dna6，205-212，1987；shome等人，j.proteinchem.7，325-339，1988；strausberg等人，proc.natl.acad.sci.u.s.a.99，16899-16903，2002；kumar等人，gene166，333-334，1995；mountford等人，nucleicacidsres.17，6391，1989；noguchi等人，gen.comp.endocrinol.147，231-235，2006；和shen等人，gen.comp.endocrinol.125，375-386，2002。除了这些特异性瘦素和fsh序列之外，具有瘦素(例如人瘦素)或fsh(例如人fsh)的基本上相同序列的变体或功能性片段也可用于本发明以产生嵌入抗体支架的衍生分子。如本文所展示的，天然二聚体fsh可转化为单链分子，以便插入宿主支架中用于选择功能性衍生分子。为确保单链fhs分子的生物学功能，可使用连接子或接头。如本文所例示的，可通过经由具有ggatcaggatcgaacgcgacggggtcaggttctaatgcaacttcaggatcgactagt序列(seqidno:2)的连接子(其编码gsgsnatgsgsnatsgsts(seqidno:33)肽接头)连接编码α和β亚基的序列，将天然人fsh二聚体转换成单链分子。然后还可由本文所述的n-端接头序列和c-端接头序列的库修饰连接的单链分子。然后可将所得的衍生scfsh分子的库重组克隆到宿主支架中。用于将瘦素或scfsh插入scfv支架中的接头的组合库可使用上述连接序列来制备。无规化接头序列对效应多肽的融合可利用本文所例示的标准dna克隆技术容易地进行。在表达嵌入瘦素或scfsh的抗体的候选融合分子的库时，则可进行功能划分。具体地讲，本发明的一些实施方案涉及选择功能性瘦素衍生物。在这些实施方案中，可使用报告基因细胞系，其响应于由瘦素受体介导的信号传导活性来表达可检测的报告基因分子(例如β-内酰胺酶)。例如，报告基因细胞系可在sis诱导元件(sie)的控制下表达β-内酰胺酶报告基因，如本文所例示的。在将报告基因细胞系与衍生或融合瘦素分子的库接触时，可使用facs容易地分离具有报告分子(例如，β-内酰胺酶)的最强表达的细胞。类似地，为选择功能性fsh衍生分子，宿主细胞(例如，hek293t细胞)可在环状amp响应元件(cre)的控制下表达fsh受体和报告分子(例如，β-内酰胺酶)。然后，对于提供最强响应的fsh衍生物提供衍生或融合scfsh分子的库。为选择嵌入抗体支架中的功能性瘦素或scfsh分子，首先如上文所讨论的生成侧接瘦素或scfsh多肽的连接接头的库。n-端和c-端随机接头序列可包含2、3、4、5、6或更多个随机残基的肽片段。接头序列另外还可包含一个或多个富gly/ser肽段。在一些实施方案中，接头包含相同富gly/ser肽段(例如，ggggs序列)的2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个串联重复序列。在其它实施方案中，多个不同富gly/ser肽段中每一个的一个或多个拷贝存在于随机接头序列中。作为具体示例，接头可包含随机3-残基基序和ggggs(seqidno:4)序列的多个拷贝，如本文对于插入瘦素和scfsh所例示的。为从候选融合分子的库中鉴定功能性瘦素或scfsh多肽，在一些实施方案中将基于自分泌的报告系统用于检测证明由效应多肽信号传导的表型。利用报告系统，可将表达效应多肽的受体(例如，瘦素受体)和可检测报告基因(例如在响应效应多肽的信号传导的调节序列控制下的5-内酰胺酶)的载体引入宿主细胞中。如本文对于瘦素和fsh所例示的，待改变的特异性表型为由报告细胞群中的效应多肽介导的活性、信号传导途径或细胞过程。可造成感兴趣的表型的改变的候选多肽被鉴定为“嵌入抗体支架中的效应多肽的功能性衍生分子”(或“效应多肽的嵌入功能性衍生物的抗体”)。取决于特异性效应多肽及其细胞受体，待在所述方法中监测的表型或信号传导途径可以为由受体介导的细胞活性或生理功能。然而，在一些实施方案中，待在选择方法中监测的表型或信号传导途径是引入宿主细胞中的报告分子的应答(例如，报告基因的表达)。这允许从候选多肽库中自分泌选择一种或多种功能性衍生效应多肽，所述效应多肽可通过激活效应多肽的受体来诱导报告分子的表达。除了本文所例示的自分泌报告系统之外，取决于效应多肽的具体生物化学特性，在本发明的实施中还可开发并使用基于经典的内分泌、旁分泌或胞内分泌信号传导的其它报告系统。v.选择嵌入功能性screlaxin多肽的抗体作为本发明用于鉴定嵌入另一蛋白质支架中的功能性多肽的方法的一般适用性的另一例示，本发明还提供用于选择嵌入scfv的功能性松弛素激动剂的方法。本发明的功能性松弛素激动剂包含嵌入异源抗体支架(例如，scfv支架)中的单链松弛素相关多肽。胰岛素-松弛素超家族(尤其是人松弛素分子)的任何松弛素分子或其它成员及其直系同源物或变体可用于构建本发明的功能性单链抗体-松弛素衍生物融合体。为构建松弛素衍生物，首先优选通过重组法产生包含天然松弛素分子的a链和b链的单链多肽。为确保单链松弛素分子的生物学功能，可将环序列(连接子或接头)用于连接两个链。在本发明的一些实施方案中，天然松弛素链可以经由具有(gs)n(seqidno:44)序列的连接子连接，其中n＝3-5。如本文所例示的，一些嵌入功能性screlaxin-h2激动剂的抗体具有通过gsgsgsgs(seqidno:45)的环序列连接的a链和b链。然后可以利用本文所述的n-端接头序列和c-端接头序列的库进一步修饰连接的单链分子。然后，所得的衍生screlaxin分子库可重组克隆到宿主支架中。任何天然松弛素分子的a链和b链可用于本发明中以产生嵌入蛋白质支架中的候选功能性screlaxin衍生物。在一些优选实施方案中，本发明的候选功能性松弛素衍生物包含由人松弛素-2(h2)的a链和b链构成的单链多肽。人松弛素-2是与许多治疗相关的生理作用(包括调节胶原代谢和多种血管控制途径)相关联的肽激素。松弛素-h2的两个链的序列为本领域所熟知并被表征。人松弛素原-2氨基酸序列(和编码核苷酸序列)记录为登录号p04090、np_604390.1(nmj34441.2)、np_005050.2(n_005059.3)、和np_604390(nm_134441.2)。松弛素-h2的人松弛素-2的a链和b链可经由重组技术容易地获得。除了人松弛素-2之外，其它天然松弛素分子和直系同源物的序列还可用于构建本发明的候选功能性松弛素衍生物。这些包括例如来自其它灵长类动物的人松弛素-1、人松弛素-3和松弛素-1和松弛素-2直系同源物，以及来自其它哺乳动物的松弛素分子。这些松弛素分子的序列也是本领域所熟知的。这些包括人松弛素1序列(p04808，np_008842.1，nm_006911)、人松弛素-3(q8wxf3，np543140，nm_080864)、黑猩猩松弛素原-2(eu437442.1)、猴松弛素原(aca13574.1，eu437443)、小鼠松弛素原(aai32657.1，bc132656)、斑马鱼松弛素原(ael22115.1，jn215212)、狼松弛素原(aaf60302.1，af233687)、以及猪松弛素原(k01088，aaa31114.1)。参见，例如crawford等人，emboj.3：2341-2345，1984；stults等人，biomed.environ.massspectrom.19：655-664，1990；hudson等人，emboj.3，2333-2339，1984；itoh等人，j.biol.chem.263，6656-6664，1988；以及bathgate等人，j.biol.chem.277，1148-1157，2002。这些松弛素序列中的任一种可容易地用于构建本发明的候选松弛素融合分子。除了天然松弛素分子之外，衍生自天然松弛素分子的其它变体和类似物也可用于构建用于实施本发明的候选screlaxin衍生多肽。这些包括，例如包含与天然松弛素肽(例如，人松弛素2)基本上相同(例如，至少90％或95％相同)的序列的松弛素变体和类似物。在一些实施方案中，变体为编码参考松弛素多肽但由于遗传密码简并性而保守地不同的序列。它们还包括在对松弛素的生物学功能不是必要的一个或多个位点处具有结构改变的功能性衍生物。因此，在一些实施方案中，适用于本发明的松弛素变体或功能性衍生物的包括肽，所述肽相对于天然松弛素分子(例如人松弛素-2)，包含对其结合或信号传导活性必要的的保守残基但具有其它序列变化，例如在非保守位置处取代或在a链的n-端处缺失。例如，用于实施本发明的嵌入screlaxin-h2的功能性抗体包括具有a链中的a21s取代和/或b链中的a21v取代的分子。为设计适用于激动剂选择的松弛素变体，应当保留已知对受体相互作用而言重要的任何结构基序或残基。例如，已知人松弛素-2的活性位点由b链螺旋的中区和a链的c-端区组成。参见，例如，park等人，j.biol.chem.283，32099-32109，2008；和hossain等人，curr.proteinpept.sci.11，719-724，2010。具体地讲，人松弛素-2一级结构与来自不同物种的松弛素肽的比较揭示了b链中区显著的序列相似性，其中两个精氨酸残基位于α-螺旋的相同表面上。这两种精氨酸(a13和a17)均通过正电荷并通过由每个arg侧链中的胍基产生的氢键网络结合到rxfp1受体。另外，还报道了b链中的第三氨基酸，ileb20对于结合到rxfp1是必需的。除了b链中的该基序之外，人松弛素-2的a链中的残基thr16、lys17和phe23也涉及与rxfp1或rxfp2受体的相互作用。另外，报道了人松弛素-2a链的n端不具有功能性作用，并且将a链的n端缩短至多四个残基对rxfp1和rxfp2的结合或激活没有影响。参见，例如，bullesbach等人，biochemistry25，5998-6004，1986；bullesbach等人，j.biol.chem.262，12496-12501，1987；和hossain等人，j.biol.chem.283，17287-17297，2008。可以根据上述方案设计用于将单链松弛素多肽插入宿主支架中的n-端和c-端接头的库。在一些实施方案中，接头可以包含3-5个随机化残基和一个或多个附加的富gs段的随机基序。如本文对于松弛素-h2所例示的，编码screlaxin多肽或变体的多核苷酸序列通过添加分别编码具有序列xa(ggggs)b(gggs)c(ggs)d(seqidno:82)或xa(ggs)e(seqidno:83)的n-端接头，和具有序列(sgggg)f(sg)gxa(seqidno:84)或(sgggg)fsgxa(seqidno:85)的c-端接头的连接序列来修饰。在这些序列式的每一个中，x为随机化氨基酸残基，a为2至4的随机数，b和f各自独立地为1至2的随机数，e为1至3的随机数，并且c、d和g各自独立地为0至2的随机数。在一些实施方案中，除了随机化残基之外，n-端接头包含ggggsgggsggs(seqidno:46)或ggsggs(seqidno:47)的序列，并且c-端接头包含sggggsggggsg(seqidno:48)或sggggs(seqidno:49)的序列。可将末端接头修饰的screlaxin多肽插入和/或代替抗体序列的任何部分，只要所述插入不抑制客体分子的功能或基本上不损坏所得融合多肽的结构完整性即可。在一些实施方案中，修饰的screlaxin序列可插入互补决定区(cdr)中。通常，插入位点的选择可基于宿主支架的序列同源性分析以定位可适应插入序列的区域。如本文对于人松弛素-2所例示的，可通过取代抗体的hcdr3区(seqidno:3)将末端接头-修饰的screlaxin-h2序列(例如，对于克隆体a3、c12-2和c12-1而言，分别为seqidno:69、71和72)插入scfv宿主序列(seqidno:1)中来产生嵌入screlaxin多肽的候选抗体。将侧接screlaxin序列的接头插入scfv支架中和所得的嵌入宿主支架中的候选screlaxin分子库在宿主细胞中的表达可如上所述进行。在表达时，可将嵌入screlaxin多肽的各种候选抗体接触或插入适当的细胞群中用于功能性选择。这些细胞通常表达松弛素多肽的相应细胞受体(例如rxfp1、rxfp2、rxfp3或rxfp4)。在一些实施方案中，用于选择的所选宿主细胞不内生地表达松弛素多肽的细胞受体。在这些方法中，用于功能性选择候选screlaxin多肽的宿主细胞还可工程化以表达受体，例如如本文所列示的，表达人rxfp1的hek293t细胞。为了从所述库鉴定功能性screlaxin多肽，将报告系统用于检测由证明由松弛素多肽信号传导的表型。在人松弛素-2的情况下，报告基因细胞系可以是表达rxfp1受体的报告基因细胞系，并且还可以是报告分子(例如β-内酰胺酶)。报告细胞可以为如本文所例示的hek293t细胞系或本领域所熟知的任何其它细胞或细胞系。将hek293t细胞用作示例，可将rxfp1受体(或rxfp2、rxfp3、rxfp4)的表达置于适当的启动子序列(例如，ef-1α启动子)的控制下，并且报告分子如β-内酰胺酶可在环状amp响应元件(cre)的控制下表达。当报告基因细胞系与嵌入screlaxin的抗体分子库接触时，可例如使用facs容易地选择报告分子(例如β-内酰胺酶)的表达最强的细胞。然后可从所选的细胞中分离功能性screlaxin激动剂多肽或衍生物。vi.嵌入抗体支架中的经修饰效应多肽本发明提供嵌入异源蛋白质支架中的衍生或经修饰效应多肽。这些经修饰效应多肽中的一些基本上保持了嵌入多肽的天然生物化学活性或细胞活性。如上所述，根据本文所述的方法，任何效应多肽(例如激素、受体配体或酶)均可用于构建此类功能性衍生分子。因此，本发明的修饰效应多肽中的一些衍生自细胞受体的配体。本发明的一些经修饰效应多肽是嵌入不同蛋白质支架中的激素分子。在一些实施方案中，嵌入异源支架中的效应多肽具有约5kda至约25kda的分子量。在一些实施方案中，衍生效应多肽中的宿主蛋白支架是抗体支架。例如，本发明的一些优选实施方案将scfv抗体用于嵌入客体效应多肽。在这些修饰效应多肽中的一些中，抗体支架的互补决定区(cdr)由效应多肽取代。例如，本发明的一些修饰效应多肽包括通过置换抗体序列的hcdr3环(lgitktstcyt；seqidno：3)嵌入seqidno：1的scfv抗体支架中的客体多肽。通常，效应多肽利用n-端接头和c-端接头连接到抗体序列以保持插入的客体多肽的适当结构和生物化学功能或细胞功能。在各种实施方案中，n-端接头可包含氨基酸序列xa(gbsc)n(seqidno:86)或xa(scgb)n(seqidno:87)，并且c-端接头可包含氨基酸酸序列(gesf)mxd(seqidno:88)或(sfge)mxd(seqidno:89)。在这些序列中，x为任何氨基酸残基，g为甘氨酸，s为丝氨酸，m和n各自独立地为1至6的随机数，包括1和6；a和d各自独立地为1至5的随机数；b和e各自独立地为0至6的随机数；并且c和f各自独立地为0至2的随机数。此外，当存在富gs段的多个拷贝时(即，当n和/或m大于1时)，每个gs重复序列中的b、c、e或f可分别与其它gs重复序列中的b、c、e或f不同。本发明还提供嵌入抗体支架中的特异性功能瘦素激素分子或修饰衍生物。类似地，本发明还提供嵌入抗体支架中的修饰的fsh激素分子。本发明还提供嵌入抗体支架中的特异性功能单链人松弛素-2(screlaxin-h2)激动剂分子或修饰的衍生物。抗体支架可以为可以如本文所述或本领域中所述的的单链形式产生的任何抗体片段。在一些实施方案中，用于构建松弛素衍生融合物的抗体支架为scfv序列。所述scfv序列可以为任何已知的scfv抗体序列(例如，已知的人scfv)或可由其它免疫球蛋白分子的可变片段容易地产生的scfv序列。示例性人scfv支架抗体序列以seqidno:1示出。在这些分子中的一些中，screlaxin-h2多肽在抗体支架的hcdr3环处嵌入并取代所述hcdr3环。如本文实施例中所详述的，本发明的嵌入瘦素或scfsh分子的特异性抗体支架通过基于自分泌的功能性选择来鉴定。这些特异性功能瘦素或fsh衍生物具有相对于天然激素的相似或更好的生物学和/或药学活性。除了宿主抗体序列和天然激素多肽序列之外，这些功能分子还包含连接插入的天然激素序列和宿主抗体序列的特异性n-端和c-端接头序列。这些接头序列旨在确保适当的折叠并维持生物学活性。例如，嵌入瘦素分子的一些抗体支架包含与下列所示的序列分别相同或基本上相同的n-端接头序列和c-端接头序列：(1)lgvggggs(seqidno:5)和ggggsert(seqidno:6)；(2)hltggggs(seqidno:7)和gsggsggggsdps(seqidno:8)；(3)pwaggggsggggsggggs(seqidno:9)和ggggsqpp(seqidno:10)；(4)ktsggggsggggs(seqidno:11)和ggggssde(seqidno:12)；或(5)vtggggs(seqidno:13)和ggggsqle(seqidno:14)。类似地，本发明的一些嵌入scfsh分子的抗体支架包含与下列所示的序列分别相同或基本上相同的n-端接头序列和c-端接头序列：(1)rshggggs(seqidno:15)和ggggsvnp(seqidno:16)；(2)qrvggggs(seqidno:17)和ggggsggggsrsa(seqidno:18)；或(3)rvlggggs(seqidno:19)和ggggsggggsqss(seqidno:20)。类似地，本发明的嵌入screlaxin-h2分子的特异性抗体支架还通过功能性选择来鉴定。这些特异性功能松弛素衍生物具有相对于天然松弛素-h2分子相似或更好的生物学和/或药学活性。除了宿主抗体序列和天然松弛素多肽序列的a链和b链序列之外，这些功能分子还包含连接插入的天然激素序列和宿主抗体序列的特异性n-端和c-端接头序列。插入这些接头序列以确保适当的折叠并维持screlaxin-h2多肽的生物学活性。在本发明的一些实施方案中，screlaxin激动剂包含如seqidno:1所示的scfv抗体支架序列，不同的是hcdr3中的lgitktstcyt(seqidno:3)由screlaxin多肽取代。在这些实施方案的一些中，n-端接头序列包含(包括或由其组成)序列xxxggggsgggsggs(seqidno:78)或xxxggsggs(seqidno:79)，并且c-端接头序列包含(包括或由其组成)序列sggggsggggsgxxx(seqidno:80)或sggggsxxx(seqidno:81)，其中x为随机化氨基酸残基。本发明的一些特异性松弛素激动剂多肽具有利用本文所例示的一对接头序列插入scfv抗体支架中的screlaxin-h2序列。这些包括与下列所示的序列分别相同或基本上形同的n-端接头序列和c-端接头序列：(1)rtrggsggs(seqidno:50)和sggggslms(seqidno:51)(克隆体a3)；(2)rtrggsggs(seqidno:50)和sggggskpp(seqidno:52)(克隆体a12-2)；(3)plnggsggs(seqidno:53)和sggggskpp(seqidno:52)(克隆体ci2-1)；(4)lprggggsgggsggs(seqidno:54)和sggggslds(seqidno:55)；(5)qttggsggs(seqidno:56)和sggggskgt(seqidno:57)；(6)hmfggsggs(seqidno:58)和sggggskap(seqidno:59)；(7)qrgggsggs(seqidno:60)和sggggswsp(seqidno:61)；(8)rqrggggsgggsggs(seqidno:62)和sggggsvra(seqidno:63)；(9)rltggsggs(seqidno:64)和ssggwsagggsgvrs(seqidno:65)；或(10)rnrggggsggrsggs(seqidno:66)和sggggsggggsggrp(seqidno:67)。本文所例示的嵌入screlaxin-h2激动剂的多个功能性抗体支架中的侧接接头的screlaxin-h2系列的全长序列分别以seqidno:68-77示出。除了本文所例示的特异性抗体嵌入screlaxin多肽之外，本发明的人松弛素-2激动剂还包括具有与例示的激动剂分子中任一个的序列基本上相同(例如，至少85％、90％、95％、99％或更高)的氨基酸序列的抗体嵌入松弛素多肽。本发明的激动剂还包括抗体嵌入松弛素分子，其具有与本文所例示的接头序列基本上相同的末端接头序列，以及抗体嵌入分子，其具有与本文所列示的经末端接头修饰screlaxin-h2序列的序列基本上相同的插入的经末端接头修饰的screlaxin序列。本发明的抗体支架嵌入效应多肽还可包括用于纯化的肽序列。可使用的用于纯化的肽序列也是本领域所已知的。用于纯化的肽序列的示例包括具有其中至少四个，并且优选地至少六个为连续的组氨酸残基的氨基酸序列的组氨酸标签序列，以及谷胱甘肽s-转移酶中的谷胱甘肽结合结构域的氨基酸序列。如本文所述，嵌入抗体支架中的功能性效应(例如，瘦素、scfsh和screlaxin)多肽可由常规实施的重组方法制成。此类方法描述于例如，sambrook等人，molecularcloning:alaboratorymanual，coldspringharborpress,n.y.(第3版，2000)；和brent等人，currentprotocolsinmolecularbiology，johnwiley&sons,inc.(ringbou编辑，2003)中。如本文所详述的，衍生多肽可通过将编码融合蛋白质的多核苷酸(例如，dna)插入适当载体中并且将表达载体引入合适的表达系统中产生。vii.用于表达嵌入功能性多肽的抗体的载体和宿主细胞本发明提供编码如本文所述的嵌入抗体支架中的功能性多肽(瘦素、fsh和松弛素)的多核苷酸序列，包含所述多核苷酸序列的表达载体，以及包含多核苷酸或表达构建体的宿主细胞。所述细胞可以为例如真核细胞或原核细胞，诸如动物细胞、植物细胞、细菌或酵母。各种表达载体/宿主系统适用于表达本发明的融合多肽。示例包括例如微生物，如由重组噬菌体转化的细菌、质粒或粘粒dna表达载体；用酵母表达载体转化的酵母；用病毒表达载体(例如杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；用病毒表达载体(例如花椰菜花叶病毒，camv；烟草花叶病毒，tmv)转染或用细菌表达载体(例如，ti或pbr322质粒)转化的植物细胞系统；或动物细胞系统。特定载体的选择取决于融合多肽的预期用途。例如，所选择的载体必须能够驱动融合多肽在期望的细胞类型中的表达，无论所述细胞类型是原核还是真核的。许多载体包含允许可操作连接的基因序列的原核载体复制和真核表达的序列。可用于本发明的载体可以是自主复制的，即载体在染色体外存在，并且其复制不一定与宿主细胞基因组的复制直接相关。另选地，载体的复制可以与宿主染色体dna的复制相关，例如，可将载体整合到宿主细胞的染色体中，如通过逆转录病毒载体和在稳定转染的细胞系中所实现的。可用于本发明的载体优选包含可操作地连接至融合多肽编码序列的序列，所述融合多肽编码序列允许编码多核苷酸序列的转录和翻译。允许连接的融合多肽编码序列的转录的序列包括启动子并且任选地还包括允许连接序列的强表达的一个或多个增强子元件。术语“转录调节序列”是指启动子和对可操作地连接的核酸序列赋予期望的表达特征(例如高水平表达、诱导表达、组织或细胞型特异性表达)的任何附加序列的组合。启动子序列可以为组成型或诱导型。组成型病毒启动子的示例包括hsv、tk、rsv、sv40和cmv启动子。适宜的诱导型启动子的示例包括来自诸如细胞色素p450基因、热休克蛋白基因、金属硫蛋白基因、激素诱导型基因(如雌激素基因启动子)等基因的启动子。启动子还可以为组织特异性的。可以与本发明的表达载体一起使用的此类启动子的示例包括来自下列基因的启动子：肝脂肪酸结合(fab)蛋白基因，对结肠上皮细胞具有特异性；胰岛素基因，对胰腺细胞具有特异性；转铁蛋白、α1-抗胰蛋白酶、纤溶酶原激活物抑制剂1型(pai-1)，载脂蛋白ai和ldl受体基因，对肝细胞具有特异性；髓磷脂碱性蛋(mbp)基因，对少突胶质细胞具有特异性；胶质纤维酸性蛋白(gfap)基因，对胶质细胞具有特异性；opsin，对靶向眼部具有特异性；和对神经细胞具有特异性的神经特异性烯醇化酶(nse)启动子。所选的启动子还可连接到其它序列，从而使得其是诱导特定性或组织特异性的。例如，在所选的启动子的上游添加组织特异性增强子元件可使得启动子在给定的组织或细胞类型中具有更多活性。除了启动子/增强子元件之外，本发明的表达载体还可包含合适的终止子。此类终止子包括，例如，人生长激素终止子，或就酵母或真菌宿主而言，tpi1(alber&kawasaki，jmolapplgenet.1：419-34，1982)或adh3终止子(mcknight等人，1985，emboj.4：2093-2099)。可用于本发明的载体还可包含聚腺苷酸化序列(例如，sv40或ad5e1bpoly(a)序列)和翻译增强子序列(例如来自腺病毒varna的那些)。此外，可用于本发明的载体可编码将融合多肽引导到特定细胞区室的信号序列，或者可编码指导融合多肽分泌的信号。在一些优选的实施方案中，表达本发明的融合多肽的载体为病毒载体，例如，逆转录病毒载体或腺病毒载体。允许在细胞中引入并表达编码融合多肽或其变体的序列的任何病毒载体适用于本发明的方法。可用于将外源核酸递送到细胞中的病毒载体包括但不限于逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺伴随病毒载体、疱疹病毒载体和semiliki森林病毒(α-病毒)载体。有缺陷的逆转录病毒的明显特征在于用于基因转移(综述参见miller,a.d.(1990)blood76:271)。适用于克隆和表达本发明的融合多肽的逆转录病毒载体的具体示例为如本文例示的慢病毒载体plv2。用于产生重组逆转录病毒和用于在体外或体内由此类病毒感染细胞的方案可见于brent等人(同上)和其它标准实验室手册中。除了逆转录病毒载体之外，可操纵腺病毒使得其编码并表达感兴趣的基因但由于其在正常裂解病毒生命周期中复制的能力而失活(参见，例如berkner等人，1988，biotechniques6:616；rosenfeld等人，1991，science252:431-434；和rosenfeld等人，1992，cell68:143-155)。源自腺病毒株5dl324或腺病毒的其它菌株(例如ad2、ad3、ad7等)的适宜腺病毒载体是本领域技术人员所熟知的。腺伴随病毒载体(aav)是天然存在的缺陷病毒，其需要另一病毒诸如腺病毒或疱疹病毒作为辅助病毒用于有效复制和增殖性生命周期。(综述例如参见muzyczka等人，1992，curr.topicsinmicro.&immunol.158:97-129)。诸如traschin等人(1985，mol.cell.biol.5:3251-3260)中所述的aav载体可用于将核酸引入细胞中。可使用aav载体将多种核酸引入不同细胞类型中(参见，例如hermonat等人，1984，proc.natl.acad.sci.usa81:6466-6470；和traschin等人，1985,mol.cell.biol.4:2072-2081)。取决于用于表达融合多肽的特异性载体，可将各种已知的细胞或细胞系用于实施本发明。宿主细胞可以为可在其中引入携带本发明的融合体的重组载体并且其中允许所述载体驱动可用于本发明的融合多肽的表达的任何细胞。它可以是原核的，诸如多种细菌菌株中的任一种，或者可以为真核的，诸如酵母或其它真菌细胞、昆虫或两栖动物细胞、或哺乳动物细胞，包括例如啮齿动物、猿猴或人细胞。表达本发明的融合多肽的细胞可以为原代培养的细胞，例如原代人成纤维细胞或角化细胞，或者可以是构建的细胞系，诸如nih3t3、he293、hek293thela、mdck、wi38或cho细胞。此外，可用于表达本发明的融合多肽的哺乳动物细胞可以是表型正常的或癌基因转化的。这些包括例如肿瘤细胞，诸如本文所例示的非小细胞肺癌(nsclc)细胞系a549或eμ-myc淋巴瘤细胞。任何其它的原代哺乳动物细胞或转化的肿瘤细胞也可用于实施本发明的报告融合多肽。技术人员可以容易地在培养物中构建和维持表达融合多肽的所选宿主细胞类型。可用于表达融合多肽的适宜细胞系的许多其它具体示例在本领域中描述。参见，例如，smith等人，1983.，j.virol46:584；engelhard等人，1994,procnatacadsci91:3224；logan和shenk，1984，procnatlacadsci，81:3655；scharf等人，1994，resultsproblcelldiffer，20:125；bittner等人，1987，methodsinenzymol，153:516；vanheeke和schuster，1989，jbiolchem264:5503；grant等人，1987，methodsinenzymology153:516；brisson等人，1984，nature310:511；takamatsu等人，1987，emboj6:307；coruzzi等人，1984，emboj3:1671；broglie等人，1984，science，224:838；winterjandsinibaldirm，1991，resultsproblcelldiffer，17:85；hobbss或murryle，mcgrawhillyearbook，scienceandtechnology(1992)mcgrawhillnewyorkn.y，第191-196页或weissbach和weissbach(1988)methodsforplantmolecularbiology，academicpress，newyork，第421-463页。可以通过本领域技术人员已知的多种适宜方法中的任一种将表达融合多肽的载体引入选定的宿主细胞中。例如，表达融合多肽的载体可在大肠杆菌噬菌体载体颗粒例如λ或m13的情况下，通过感染，或通过用于相容质粒载体或噬菌体dna的多种转化方法中的任一种，被引入适当的细菌细胞中。例如，标准氯化钙介导的细菌转化仍然通常被用于将裸dna引入细菌(sambrook等人,同上)，但还可以使用电穿孔(brent等人,同上)。为将融合基因共转化到大肠杆菌中，需要使用各自包含不同抗生素抗性基因的两种不同的相容质粒表达载体。为将表达嵌入多肽的抗体支架的构建体引入酵母或其它真菌细胞中，通常使用化学转化方法(例如，rose等人，1990，methodsinyeastgenetics，coldspringharborlaboratorypress，coldspringharbor，ny)。就酿酒酵母的转化而言，例如，用乙酸锂处理细胞以实现约104个菌落形成单元(转化细胞)/μg的dna转化效率。然后，在适于所用的可选择标记的选择性培养基上分离转化的细胞。另选地或此外，可扫描板或从板中提起的过滤器的荧光和荧光素酶介导的生物发光以鉴定具有编码融合多肽构建体的转化克隆体。为将编码融合多肽的载体引入哺乳动物细胞中，所用方法将取决于载体的形式。就质粒载体而言，编码融合多肽序列的dna可以通过多种转染方法中的任一种引入，包括例如脂质介导的转染(“脂转染”)、deae-葡聚糖介导的转染、电穿孔或磷酸钙沉淀。这些方法例如在brent等人(同上)中详述。适用于瞬时转染多种转化和非转化或原代细胞的脂质转染试剂和方法是普遍可用的，使得脂质转染成为将构建体引入真核细胞，并且具体地将培养物中的哺乳动物细胞的具有吸引力的方法。例如，lipofectaminetm(lifetechnologies)或lipotaxitm(stratagene)试剂盒是可用的。提供用于脂质转染的试剂和方法的其它公司包括bio-radlaboratories、clontech、glenresearch、invitrogen、jblscientific、mbifermentas、panvera、promega、quantumbiotechnologies、sigma-aldrich、和wakochemicalsusa。就重组融合多肽的长期高收率生产而言，优选稳定的表达。宿主细胞可利用由适当表达控制元件(例如启动子、增强子、序列、转录终止子、聚腺苷酸化位点等)和可选标记控制的融合多肽编码序列来转化，而不是使用包含病毒复制起点的表达载体。重组载体中的可选标记赋予对选择的抗性，并允许细胞将载体稳定整合到其染色体中。常用的可选标记包括neo，其赋予对氨基糖苷g-418的抗性(colberre-garapin等人，j.mol.biol.，150:1，1981)；以及hygro，其赋予对潮霉素的抗性(santerre等人，gene，30:147，1984)。通过适当的选择，转染的细胞可包含融合多肽编码序列的整合拷贝。还可使用多种其它选择系统，包括但不限于，单纯疱疹病毒胸苷激酶(wigler等人，cell，11:223，1977)、次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(szybalska和szybalski，proc，nati.acad.sci.usa，48:2026，1962)和腺嘌呤磷酸核糖基转移酶(lowy等人，cell，22:817，1980)基因。另外，抗代谢抗性可以用作对下列的选择基础：dhfr，其赋予对甲氨蝶呤的抗性(wigler等人，proc.natl.acad.sci.usa，77:3567，1980；o'hare等人，proc.natl.acad.sci.usa，8:1527，1981)；gpt，其赋予对霉酚酸的抗性(mulliganh和berg，proc.natl.acad.sci.usa，78:2072，1981)。另外，已经描述了附加的可选基因，即，trpb，其使得细胞利用吲哚代替色氨酸；hisd，其允许细胞利用组氨醇(histinnol)代替组氨酸(hartman和mulligan，proc.natl.acad.sci.usa，85:8047，1988)，和odc(鸟氨酸脱羧酶)，其赋予对鸟氨酸脱羧酶抑制剂2-(二氟甲基)-dl-鸟氨酸，dfmo的抗性(mcconloguel.，in：currentcommunicationsinmolecularbiology，coldspringharborlaboratory，编辑，1987)。viii.治疗应用和药物组合物嵌入本文所述的另一蛋白质支架中的功能效应多肽可发现许多治疗或预防应用。例如，本发明的功能性瘦素衍生物多肽可用于治疗和预防其中瘦素缺乏起作用的各种病症或疾病。这些包括与在调节能量平衡、体重、代谢和内分泌功能方向的瘦素活性不足或异常相关联或介导的许多失调(例如常见的肥胖症、脂肪代谢障碍、下丘脑性闭经和先天性瘦素缺乏)。类似地，如本文所述的嵌入宿主蛋白质支架中的功能性scfsh多肽可用于治疗与较低的或减少的fsh水平相关联的病症。fsh的分泌减少可导致性腺功能衰竭(性腺机能减退)。该病症通常表现在男性身上，因为不能产生正常精子数。在女性中，通常观察到生殖周期的停止。与低fsh水平相关联的病症的具体示例包括多囊卵巢综合征、卡尔曼综合征、下丘脑抑制症、垂体功能减退症、高催乳素血症和促性腺激素缺乏症。患有或有发展这些和其它病症风险的受试者适于用本发明的功能性scfsh衍生多肽进行治疗。类似地，也可发现嵌入本发明所述的另一蛋白质支架中的功能性screlaxin多肽的许多治疗或预防应用。例如，本文所例示的功能性人screlaxin-h2激动剂可用于治疗和预防需要增强的松弛素-2信号传导的各种病症或疾病。此类疾病或病症包括例如，急性心力衰竭、慢性心力衰竭、充血性心力衰竭、肺动脉高压、硬皮病、杜氏肌营养不良症、肝纤维化、肾纤维化、肺纤维化、非酒精性脂肪性肝炎(nash)，非酒精性脂肪性肝炎肝脏疾病(nafld)、骨骼肌损伤、外伤、烧伤、纤维肌痛、和实体或转移性肿瘤。适用于利用本发明的松弛素激动剂治疗的其它病症包括，例如骨代谢、关节疼痛、其它疼痛、阿尔茨海默病、2型糖尿病、多发性硬化、肾血管舒张和杜邦氏病。在一些实施方案中，本文所述的组合物和方法用于治疗癌症或肿瘤。这些包括贲门癌(例如肉瘤、粘液瘤、横纹肌瘤、纤维瘤、脂肪瘤和畸胎瘤)；肺癌(例如支气管癌、肺泡癌、支气管腺瘤、肉瘤、淋巴瘤、软骨瘤性错构瘤、间皮瘤)；各种胃肠癌(例如食道癌、胃癌、胰腺癌、结肠癌、小肠癌和大肠癌)；泌尿生殖道癌(例如肾癌、膀胱癌和尿道癌、前列腺癌、睾丸癌)；肝癌(例如肝细胞瘤、胆管癌、肝母细胞瘤、血管肉瘤、肝细胞性腺瘤、血管瘤)；骨癌(例如成骨肉瘤、纤维肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、软骨肉瘤、尤因氏肉瘤、恶性淋巴瘤、多发性骨髓瘤、恶性巨细胞瘤脊索瘤、骨质疏松、良性软骨瘤、软骨细胞瘤、软骨胶原纤维瘤、骨样骨瘤和巨细胞瘤)；神经系统的癌症(例如颅骨癌、脑膜癌、脑癌和脊髓癌)；妇科癌症(例如子宫癌、子宫颈癌、卵巢癌、外阴癌、阴道)；血液癌(例如与血液相关的癌症、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤)；皮肤癌(例如恶性黑素瘤、基底细胞癌、鳞状细胞癌、卡洛斯氏肉瘤、痣发育异常痣、脂肪瘤、血管瘤、皮肤纤维瘤、瘢痕瘤、牛皮癣)；以及肾上腺的癌症(例如神经母细胞瘤)。嵌入本文所述功能性多肽(例如，瘦素、scfsh或screlaxin)的抗体支架可用于预防或治疗应用。在预防应用中，将药物组合物或药物给药于易于发展或处于发展疾病或病症(即肥胖症、硬皮病或心力衰竭)风险的受试者，其量足以消除或降低风险、减少严重程度或延迟疾病的开始，包括所述疾病的生化、组织学和/或行为症状，其在疾病发展期间呈现的并发症和中期病理表型。在治疗应用中，将组合物或药物给药于疑似或已经患有该疾病的患者，其量足以治愈或至少部分地阻止该疾病的症状(生化、组织学和/或行为症状)，包括其在疾病发展时的并发症和中间病理表型。通常，如果有益效果开始减弱，则监测治疗有益效果并给予重复剂量。用于本发明方法的嵌入功能性多肽的抗体支架应当以足以实现期望的治疗有益效果(例如，消除或改善与相关病症相关联的症状)的量给药于受试者。足以完成治疗或预防治疗的量被定义为治疗或预防有效剂量。因此，功能性衍生效应多肽的治疗或预防有效剂量或有用剂量用于本发明的药物组合物。在预防或治疗方案中，试剂通常以多种剂量给药，直至实现足够的有益效果。可改变本发明药物组合物中的活性成分的实际剂量水平，以便获得一定量的活性成分，其有效地实现对于特定受试者、组合物和给药模式的所期望治疗响应，但对受试者没有毒性。所选的剂量水平取决于各种药代动力学因素，其包括所用的本发明特定组合物的活性、给药途径、给药时间和所用特定化合物的排泄速率。其还取决于治疗的持续时间，与所用的特定组合物组合使用的其它药物、化合物和/或材料，受治疗的受试者的年龄、性别、体重、病症、总体健康和先前病史等因素。用于确定最佳剂量的方法在本领域中有所描述，例如，remington:thescienceandpracticeofpharmacy,mackpublishingco.，第20版，2000。通常，药学有效剂量可以为约0.001至100mg/kg待治疗受试者的体重。通常，以本文所公开的用于治疗或预防应用的药物组合物的形式配制本发明的嵌入功能性多肽的抗体支架。药物组合物可以各种形式制备，诸如颗粒剂、片剂、丸剂、栓剂、胶囊、悬浮液、药膏、洗剂等。药物组合物通常包含治疗有效量的活性效应多肽(例如本发明的瘦素、scfsh或screlaxin衍生多肽)。制剂中的治疗活性化合物的浓度可以在约0.1-100重量％变化。除了活性效应多肽之外，组合物还可包含药学上可接受的载体和已知有助于给药和/或增强摄取的其它成分。用于肠胃外给药的制剂可以例如包含赋形剂、无菌水或盐水、聚亚烷基二醇如聚乙二醇、植物来源的油或氢化萘。生物相容的、可生物降解的丙交酯聚合物、丙交酯/乙交酯共聚物、或聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物可用于控制化合物的释放。本发明分子的其它潜在有用的胃肠外递送系统包括乙烯-乙酸乙烯酯共聚物颗粒、渗透泵、植入式输液系统和脂质体。用于吸入的制剂可包含赋形剂，例如乳糖，或者可以为包含例如聚氧乙烯-9-月桂基醚、甘胆酸和脱氧胆酸盐的水溶液，或者可以为以滴鼻剂形式或以凝胶形式给药的油性溶液。治疗制剂通过药学领域所熟知的任何方法制备。治疗性制剂可通过可用于治疗的任何有效手段递送。参见，例如goodman&gilman'sthepharmacologicalbasesoftherapeutics，hardman等人编辑，mcgraw-hillprofessional(第10版，2001)；remington:thescienceandpracticeofpharmacy，gennaro(编辑)，lippincottwilliams&wilkins(第20版，2003)；和pharmaceuticaldosageformsanddrugdeliverysystems，ansel等人(编辑)，lippincottwilliams&wilkins(第7版，1999)。药物组合物优选在gmp条件下制备。药物组合物通常多次给药于受试者。单次剂量之间的间隔可以是每日、每周、每月或每年。间隔还可以是不规律的，如通过测量用于受试者的衍生效应多肽和其它治疗试剂的血液含量所指示的。在一些方法中，调节剂量以达到1-1000μg/ml的血浆浓度，并且在一些方法中为25-300μg/ml或10-100μg/ml。另选地，治疗试剂可以以持续释放制剂形式给药，在这种情况下需要较不频繁的给药。剂量和频率根据受试者中效应多肽和其它药物的半衰期而变化。给药的剂量和频率可根据治疗是预防性还是治疗性而变化。在预防性应用中，相对低的剂量长期以相对不频繁的间隔给药。一些受试者可在其余生中持续接受治疗。在治疗性施用中，有时需要在相对短间隔下的相对高剂量直至疾病的进展减少或终止，并且优选直至受试者示出部分或完全改善的疾病症状。此后，可以对受试者施用预防方案。本发明还提供用于实施本文所公开的治疗应用的试剂盒。例如，本发明提供用于治疗患有本文所述疾病(例如与瘦素、fsh或松弛素缺乏相关联的病症)的受试者的治疗试剂盒。本发明的治疗试剂盒通常包含一种或多种所述的功能性多肽作为活性剂。试剂盒可任选地包含适用于施用活性剂的药学上可接受的载体或赋形剂。适用于试剂盒的药学上可接受的载体或赋形剂可以为包衣、等渗和吸收延迟剂、结合剂、粘合剂、润滑剂、分解剂、着色剂、调味剂、甜味剂、吸收剂、洗涤剂和乳化剂。可包括在试剂盒中的其它试剂包括抗氧化剂、维生素、矿物质、蛋白质、脂肪和碳水化合物。治疗试剂盒还可包括用于包装试剂的包装材料和在包装材料中或上的通知。试剂盒还可包括适当的使用说明和指示试剂盒内容物的预期用途的标签。说明可存在于试剂盒上或随试剂盒提供或以其它形式伴随试剂盒的任何书面材料或记录材料上。本发明的治疗试剂盒可以单独用于治疗例示的功能性多肽(例如瘦素、fsh或松弛素)中每一种的所述疾病之一。其也可以与其它已知的治疗方法结合使用。例如，患有肥胖症的受试者可使用治疗试剂盒连同另一肥胖药物(例如xenical)。本发明的治疗组合物和其它已知的治疗方案可以依次或同时给药于受试者。本发明的这些治疗应用可全部在试剂盒的说明书中示出。实施例提供以下实施例以进一步说明本发明，但不限制其范围。实施例1.选择客体分子为确定将客体插入蛋白质宿主的组合过程是否可以是通用的，研究了两种非常不同的蛋白质激素，即瘦素和促卵泡激素(fsh)。选择激素作为测试对象，因为可容易地确定其在结合到宿主分子中时是否起作用。每种激素均对该问题带来特定优点和缺点。瘦素为折叠成紧凑的4-螺旋束的146个氨基酸长蛋白质(zhang等人，nature387，206-209，1997)。螺旋彼此的强结合能可使得连接的选择较不重要。但是，客体的这种相同刚度可干扰整个复合体折叠的途径。fsh具有203个氨基酸，其主要折叠成β-片层二级结构。就这些实验而言，fsh的特定问题在于其为异源二聚体。如果独立地处理fsh单体亚基，则所述过程成为四接头组合问题，然而如果异源二聚体的单体亚基共价连接，则所述过程降为三个接头组合问题。因此，通过使用gsgsnatgsgsnatsgsts(seqidno:33)肽接头连接两个亚基来构建单链fsh(scfsh)。最初，scfsh共价二聚体示为功能性的，其使用报告细胞系(参见下文)。实施例2.构建组合连接宿主支架是具有包含19个氨基酸残基(kabat编号)的cdrh3的抗体。为了保持抗体芯的适当折叠，同时最大化连接的灵活性，作为cdrh3芯的lgitktstcyt环(seqidno:3)由组合的n-端和c-末端连接库的成员取代以产生高度多样化的序列，所述序列侧接瘦素和scfsh客体。这种插入位点的选择基于亲本支架的同源性模型。在该构建体中，预期客体碱基中的一些紧贴宿主抗体的其它未改变cdr中的一些填充，其余部分延伸入溶剂中。组合连接库被设计成包含随机3-残基接头与瘦素和scfsh的n-端和c-端两者处的ggggs(seqidno:4)接头的1-3个拷贝的连接。n-端和c-端库的组合的蛋白质连接序列空间的多样性为2.88×107。为了构建所述库，使用三个正向引物的组合引导pcr，所述组合包含随机的xxx接头，之后是(ggggs)1～3(seqidno:34)接头和与客体激素互补的序列，以及三个反向引物，其包含与客体互补的序列，之后是(ggggs)1～3(seqidno:34)接头和xxx接头。扩增的pcr产物被消化并转移到亲本支架抗体中。两个库的质量和多样性都通过二十个克隆体的测序来确认。实施例3.构建报告细胞系由于其高精度和灵敏度，已经广泛使用基于自分泌的流式细胞仪分选，其中由各种细胞信号传导响应元件诱导β-内酰胺酶报告基因的表达。为了构建人瘦素受体(lepr)的此类报告细胞系，可用表达由延伸因子-1α(eflcc)启动子驱动的c-端ha标记的人lepr基因的慢病毒转导在sis-诱导元件(sie)控制下表达β-内酰胺酶报告基因的cellsensorsie-blahek293t细胞(lifetechnology)(图1a)。基于对人瘦素蛋白响应的分选之后测试单个克隆体，并且将具有最强响应的单克隆表示为leprsie-bla细胞并用于进一步研究。leprsie-bla细胞稳定表达ha标记的人瘦素受体(图1b)，并且在荧光共振能量转移(fret)测定时具有8.5的人瘦素响应比(图1c)。响应比是在leprsie-bla细胞中产生的信号除以不具有lepr的细胞的信号。为了构建人fshr的报告细胞系，利用稳定表达c-端ha标记的人scfsh基因的慢病毒共转导hek293t细胞，并且慢病毒在环状amp响应元件(cre)的控制下表达β-内酰胺酶基因(图id)。将转导的细胞暴露于重组人fsh蛋白质并且被分选以选择响应最佳的那些。在fret测定中，fshrcre-bla细胞对人fsh蛋白的响应比为6.4(图1e)。实施例4.功能连接点的基于自分泌的选择为分离功能性抗体克隆，使用严谨选通进行基于fret的facs分选。leprsie-bla和fshrcre-bla细胞以约2的多次感染利用相应的慢病毒组合连接库转导。在感染后5小时移除慢病毒，将甲基纤维素培养基置于细胞顶部，以限制分泌的抗体扩散到相邻细胞。慢病毒感染后二十小时，利用培养基洗涤甲基纤维素培养基，将细胞胰蛋白酶化，加载liveblazer-fretb/g底物并分选。就leprsie-bla细胞而言，在两轮分选之后，存在第一轮的仅0.06％阳性细胞到第二轮的3.30％阳性细胞的显著富集。就fshcre-bla细胞而言，一轮分选产生0.18％阳性细胞。在每轮分选后，将细胞裂解物作为模板通过pcr回收抗体基因片段，并且如果需要，将其重新插入慢病毒载体用于下一轮分选。就leprsie-bla细胞而言从第二轮中挑选出二十个克隆体，并就fshrcre-bla细胞而言在第一轮之后挑出二十个克隆体。从这些克隆体中提取质粒并转染到hek293t细胞中以表达分泌的抗体。在转染后两天测试来自瘦素和fsh分选的上清液以鉴定阳性克隆体。从其各自的细胞分选物中，14个中的六个克隆体能够激活leprsie-bla细胞，14个中的3个克隆体对fshrcre-bla细胞的活化是阳性的。对这些克隆体进行测序，并分析许可连接的序列(表1和2)。表1.lepr的活性激动剂克隆体克隆体n-接头(seqidno:)c-接头(seqidno:)ahltggggs(7)gsggsggggsdps(8)bpwaggggsggggsggggs(9)ggggsqpp(10)clgvggggs(5)ggggsert(6)dktsggggsggggs(11)ggggssde(12)elgvggggs(5)ggggsert(6)fkvtggggs(13)ggggsqle(14)表2.fshr的活性激动剂克隆体克隆体n-接头(seqidno:)c-接头(seqidno:)arshggggs(15)ggggsvnp(16)bqpvggggs(17)ggggsggggsrsa(18)crvlggggs(19)ggggsggggsqss(20)在包含瘦素客体的六个活性抗体克隆体之中，两个最具活性的克隆体(表1中的克隆体c和e)具有相同的n-端(lgvggggs)(seqidno:5)和c-端序列(ggggsert)(seqidno:6)。其它四个活性克隆体具有显然是随机的无关序列。有趣的是，该n-端连接序列(lgvggggs)与典型的富含甘氨酸的环高度相似。共有gxgxxg(seqidno:39)基序在天然蛋白质中出现，诸如nadh依赖性丁醇脱氢酶a中的lgvgggs(seqidno:40)(pdb代码：1vlj)和原核细胞分裂蛋白ftsz中的igvggggs(seqidno：41)中的(pdb代码：2r6r)，其之前为β-链，并且之后为α-螺旋。有趣的是，共有gxgxxg序列为磷酸结合基序，其中认为磷酸结合使螺旋稳定化。测试了三种活性scfsh克隆体的表达水平和针对fshr的激动活性。克隆体b是最具活性的。有趣的是，n-端连接序列(qrvggggs)(seqidno:17)包含序列(rvgggg)(seqidno:90)，所述序列存在于天然40s核糖体蛋白s5中，其中其形成β/β连接(pdb代码：1s1h，3jyv)。实施例5.改善的连接选择虽然第一选择产生功能蛋白，但它们的生产不是最佳的。在尝试选择具有改善的蛋白质生产的克隆体时，进行其中结合蛋白质收率参数的另一选择。为了实现这一点，使用了新的载体，其中编码mcherry的基因融合到scfv基因的c-端。这允许在fret通路之前使用高mcherry信号的附加通路选择高表达克隆体。研究了三个库。一个是原始库。在其它两个库中，n-端接头或c-端接头自先前的选择保持恒定，并且其他接头也是随机的。该选择产生在n-端处具有rhmggggs(seqidno:37)和在c-端处具有ggggsggggstdt(seqidno:38)的新克隆体(克隆体2)。该蛋白质比先前选择的克隆体更好地表达，同时保持完整的瘦素活性。实施例6.体外活性将包含瘦素客体的抗体的最具活性和最佳生产scfv克隆体转化为fab形式(fab-瘦素)或全igg形式(igg-瘦素)。将未改变的支架，fab-瘦素和igg-瘦素克隆到基于pfuse的载体(invivogen)中，并在freestyle293-f细胞(lifetechnologies)中表达。在一步亲和纯化后，将所有抗体纯化至高纯度。在两种不同的测定中测试纯化的抗体活性。在使用基于β-内酰胺酶的leprsie-bla细胞系的fret测定中，测量的fab-瘦素、igg-瘦素和天然瘦素的ec50分别为118.3pm、58.7pm和313.4pm(图2a)。在使用其生长依赖于il-3或瘦素的baf3lepr细胞系的增殖测定中，fab-瘦素、igg-瘦素和天然瘦素ec50分别为131.9pm、37.2pm和309.6pm(图2b)。为了测试包含scfsh的抗体的最具活性克隆体的活性，使用与igg-瘦素相同的策略将其转化为igg-scfsh。scfsh也克隆到基于pfuse的载体中并作为igg-scfsh形成。在一步亲和纯化后获得高纯度的scfsh和igg-scfsh。其活性通过使用基于β-内酰胺酶的fshrcre-bla细胞系的fret测定来测量。igg-scfsh、scfsh和天然fsh的ec50分别为5.5pm、5.7pm和4.6pm(图2c)。实施例7.瘦素宿主-客体构建体的结构和动力学圆二色(cd)光谱学是结构生物学中用于快速测定蛋白质和肽的二级结构和折叠特性的非常有价值的工具。为检查igg-瘦素是否像抗体支架那样自然折叠，测量了抗体支架和igg-瘦素的远紫外(uv)cd光谱。抗体支架和igg-瘦素均在217nm附近具有负峰，在195nm附近具有正峰，这与抗体由所有β-片层二级结构组成的事实一致。相似的cd光谱图谱指示igg-瘦素的宿主组分自然折叠。如所预期的，对应于α-螺旋信号，包含瘦素客体的抗体在195nm和217nm处具有更强的峰。接着，我们使用差示氢氘交换质谱(hdx-ms)来研究瘦素处于其游离形式和在其整合到抗体支架(igg-leptin)中时的构象动力学和稳定性。首先比较瘦素与igg-瘦素构建体的内在氘吸收动力学。测量覆盖85％的瘦素序列(igg-瘦素或单独的瘦素)的63个胃酶解肽hdx动力学，并且基于六个交换时间点的一式三份分析来计算瘦素和igg-瘦素中每种肽的氘掺入平均百分比(参见方法)。hdx数据的分析表明，两种瘦素变体的平均氘吸收与具有残基51-66、81-93和124-138的大部分蛋白质区域保持非常相似，极大地避免了在两种瘦素变体中与溶剂氘交换。然而，氨基酸残基18-52和67-80更接近氘交换(黄/绿/红色区域)，这指示两种瘦素变体中该区域中的更多构象灵活性。这表明瘦素的整体拓扑构象在游离和igg-瘦素之间高度相似。为了进一步表征游离瘦素和igg-瘦素之间的构象差异，接着检查两种瘦素变体之间氘吸收动力学的差异。酰胺氢与溶剂氘交换的不同速率可以揭示关于两种瘦素变体之间的构象差异的信息。差异hdx数据的分析显示，游离和嵌入的瘦素变体的平均氘吸收对于大多数蛋白质区域保持非常相似。这些数据进一步证实了体外和体内(参见下文)活性，并表明瘦素的构象在游离和igg-瘦素之间不变。此外，与igg-瘦素相比，残基43-54示出对游离瘦素中氘摄取的增加的保护。虽然这表明与igg-瘦素相比，该蛋白质区域以游离瘦素形式而更具有构象刚性，但大多数蛋白质区域的hdx行为保持不变，这表明两种瘦素形式基本上相同。实施例8.体内活性在体外结果展示igg-瘦素完全保留瘦素信号传导活性的情况下，我们表征了igg-瘦素的体内功能。检测igg-瘦素在小鼠体温下的蛋白质稳定性。将瘦素或igg-瘦素加载到渗透泵中，然后将其皮下(sc)植入到小鼠中。观察到植入3天后，泵内的瘦素和igg-瘦素两者的浓度均保持不变，如elisa所测量，这示出与瘦素相似，igg-瘦素在该条件下稳定，从而允许长期体内给药。接着，因为抗体一般在循环中表现出较长的半衰期，因此推断将瘦素嵌入抗体支架可增加激素的半衰期，所述瘦素本身由肾脏和其它周围器官迅速清除。为对此进行测试，经由颈静脉给药单剂量的瘦素或igg-瘦素，并且在不同的时间点下测定蛋白质清除率。如所预期的，瘦素蛋白质示出小于半小时的半衰期，但与之相比，igg-瘦素在血浆中的半衰期显著增加，在给药后4小时保留超过50％的蛋白质(图3a)。这种减少的清除可能是由于围绕igg-瘦素中的嵌入瘦素的一个或多个区域，这干扰了瘦素与其清除受体(诸如巨蛋白)的结合。所述数据一起示出与瘦素相比，igg-瘦素具有在体温下的相似蛋白质稳定性水平和循环时的延长的半衰期，这使其成为体内代谢调节的有效候选物。虽然igg-瘦素能够在体外有效激活瘦素信号传导，但是将瘦素嵌入抗体支架中产生了比初始单体16-kda激素大得多的187.2kda的二聚体分子。这提高了外周给药的igg-瘦素可能不能有效地渗透血脑屏障并获得进入中枢神经系统中的瘦素响应神经元的可能性。为了解决这个问题，首先比较响应于igg-瘦素的中心治疗的下丘脑中的神经元活化。在脑内脑室(icv)注射igg-瘦素(其将蛋白质直接递送到脑室中)之后，在下丘脑的多个区域中存在stat3的稳定磷酸化。邻近脑室的神经元中的stat3活化与在等摩尔量的瘦素的icv注射情况下观察到的相当，与体外数据一致，即igg-瘦素完全保留瘦素的信号传导功能(图3b)。远离心室的神经元的相对较弱的stat3活化可能反映出igg-瘦素通过组织的较慢扩散。值得注意的是，与主动转运到中枢神经系统中的瘦素一致，瘦素的外周给药导致stat3活化的模式类似于中央递送后观察到的。相比之下，虽然igg-瘦素的外周给药也可诱导stat3磷酸化，但是它限于弓状核(arc)中的神经元，但是尤其是不存在于通过igg-瘦素的中央给药激活的下丘脑中的其它神经元群。对于该有趣的结果的一个潜在的解释是，已知arc中前乳糖皮质素和神经肽y/刺鼠相关蛋白质神经元的树突状突起紧邻中突隆起，并且能够直接感知血浆中的循环分子，因此回避对穿过血脑屏障运输的需求。外周给药的igg-瘦素可能使用这种机制来激活arc神经元。该些结果一起示出，igg-瘦素可以激活下丘脑中的瘦素响应神经元，尽管抗体支架确实损害了igg-瘦素穿透脑血液屏障的能力。arc神经元在调节饱腹感和能量消耗方面起到关键作用。为了检查由igg-瘦素激活arc神经元是否足以引起代谢作用，通过皮下渗透泵将蛋白质外周递送到肥胖小鼠中。有趣的是，与载体对照相比，igg-瘦素可以在给药之后显著减少食物摄取以及体重(图3c左图)。该观察结果展示，虽然仅能够激活arc中的瘦素响应神经元，但外周igg-瘦素仍然可发挥分解代谢功能，但确实注意到与相等摩尔量的瘦素相比，igg-瘦素的效力中等地较弱。另一方面，当通过脑输液泵将igg-瘦素长期递送到ob/ob小鼠的脑室时，其减少食物摄入和体重与瘦素相当的程度(图3c中图)。igg-瘦素还可导致野生型小鼠(图3c右图)，而不是饮食诱导肥胖(dio)小鼠(图4左图)或db/db小鼠(图4右图)的食物摄取、体重和脂肪构成的减少，不包括igg-瘦素的分解代谢作用可能是由于一些非特异性毒性的可能性。体内实验结果一起示出，igg-瘦素保留了瘦素的信号传导功能，并且可以激活下丘脑中的瘦素响应神经元以调节代谢。实施例9.抗体支架的cdr区外的客体插入的耐受性本实施例描述了将客体肽插入cdr区外部的抗体支架中。宿主-客体多肽融合分子的成功构建是至少两个参数的函数。首先，必须回答允许取代的位置。其次，哪个接头是允许的。为了探索允许客体多肽插入的宿主支架中的其它位点，通过检查嵌入在如上所述的scfv抗体支架中的功能性瘦素的对其它位点处短肽插入的耐受性来进行综合性研究。具体地讲，通过在scfv支架中的5个不同位置的每一个处取代4-残基随机肽的库来修饰功能性scfv嵌入瘦素融合分子。使用经典的nnk策略设计了编码4-残基随机肽库的dna片段(barbos等人，proc.natl.acad.sci.usa90:10003-10007，1993)。通过取代替换的scfv支架中的5个初始肽是根据kabat编号的片段h6-h9(a)、h23-h26(b)、h36-h39(c)、h47-h50(d)和h64-h67(e)(如图9所示)。这产生在5个非cdr位置的每一个处由4-残基随机肽序列修饰的scfv-瘦素融合分子的5个库。产生这五个库的慢病毒并将其感染到leprsie-bla细胞中。然后进行基于自分泌的流式细胞仪分析，其中抗体支架中的瘦素作为功能性探针。然后将来自自分泌测定的每个库中的包含功能性慢性病毒群的细胞量化(如由瘦素活性所示)。与阴性对照组(无感染)中的0.5％阳性群和阳性对照组的32.18％相比(在不插入随机4-aa肽的情况下，由表达scfv-瘦素的慢病毒感染)，在库a，b，c，d和e中分别为4.22％、18.91％、1.43％、1.43％和2.22％。结果指示，在非cdr位点处的肽插入是允许的，以维持客体瘦素分子的活性，但在不同抗体区域处的取代耐受性水平方面存在显著差异。区域b示出最高的取代耐受性，这与其与cdrh1结构相邻的事实一致。其它区域也示出不同水平的取代耐受性，从而揭示了可将功能性客体插入抗体支架中的潜在位置。实施例10.构建抗体支架中的screlaxin分子的库人松弛素-2(松弛素-h2)是异二聚体激素。其由两条链组成，即24个残基的a链和29个残基的b链。松弛素-h2在结构上包含2个链间(a链和b链之间)和1个链内(a链内)二硫键，这对其生物学功能至关重要。松弛素-h2与属于7-跨膜g蛋白偶联受体超家族的松弛素受体rxfp1(lgr7)和rxfp2(lgr8)相互作用。rxfp1已经用于测定松弛素-h2活性的各种测定中，其比rxfp2、rxfp3或rxfp4更合适。此外，rxfp1是那些较少gpcr之一，其具有较大的细胞外结构域。为构建ab中松弛素库，使用柔性接头将松弛素-h2的a链和b链连接在一起。然后将该单链松弛素-h2经由工程化的n-端和c-端接头插入支架抗体的cdrh3中。最终的基因盒为[xxx]-[环l]-[a链]-[环2]-[b链]-[环3]-[xxx]，其中xxx表示三个随机氨基酸残基，环1为ggggsgggsggs(seqidno:46)或ggsggs(seqidno:47)，环2为gsgsgsgs(seqidno:45)，并且环3为sggggsggggsg(seqidno:48)或sggggs(seqidno:49)。宿主scfv支架(seqidno:1)是具有包含19个氨基酸残基(kabat编号)的cdrh3的抗体。为保持抗体芯的适当折叠，同时最大化连接的灵活性，作为cdrh3芯的lgitktstcyt环(seqidno:3)被组合的n-端和c-端连接库的成员取代。将包含松弛素-h2基因盒的支架scfv的池转染到慢病毒载体中。最终的库大小为3.67×107。表达screlaxin-h2分子库的慢病毒在hek293t细胞中产生。实施例11.选择抗体嵌入功能性瘦素-h2激动剂由于其高精度和灵敏度，已经广泛使用了细胞的流式细胞仪分选，其中β-内酰胺酶报告基因的表达由各种细胞信号传导响应元件诱导。为建立高吞吐量平台以从巨大的组合库中发现激动剂抗体，构建基于β-内酰胺酶的报告细胞系。hek293t细胞由两种慢病毒共感染，一种表达rxfp1，其受ef-1α启动子的控制，另一种在刺激camp反应元件(cre)时表达β-内酰胺酶。在由10ng/ml松弛素-h2蛋白质刺激后，将松弛素-h2反应细胞(rxfp1cre-bla)分选并合并。为选择功能性松弛素激动剂，以约2的感染复数利用慢病毒组合连接库转染rxfp1cre-bla细胞。感染后5小时移除慢病毒，将甲基纤维素培养基置于细胞顶部以限制分泌抗体扩散到相邻细胞。慢病毒感染后20小时，用培养基洗去甲基纤维素培养基，并将细胞胰蛋白酶化，加载liveblazer-fretb/g底物并分选。为了避免假阳性克隆体，施用非常严格的选通。如果需要，将分选的细胞裂解并用作模板以使用pcr扩增scfv片段用于下一轮分选。在四轮分选后，筛选出60个克隆体用于松弛素活性。从每个克隆体提取质粒并转染到hek293t细胞中以表达包含松弛素的scfv。转染后48小时，将上清转移以用于使用rxfp1cre-bla细胞的fret分析。在60个克隆体中，9个被鉴定为激动剂(图5)。使用抗flag抗体利用蛋白质印迹法(westernblotting)测量这9个克隆体的上清液中的蛋白质含量(图5)。基于上清液中的活性和蛋白质含量，克隆体a3和c12示出最高效力。使用pfuse载体将这两个克隆体转化成完整igg1抗体。测序分析示出，c12实际上为两个克隆体，c12-2和c12-1的混合物。10个嵌入screlaxin分子的序列信息，包括xxx末端接头和环序列，如图6所示。实施例12.鉴定的抗体嵌入screlaxin激动剂的表征a3(igl)、c12-2(ig2)和c12-1(ig3)在freestyle293-f细胞(lifetechnologies)中表达。按照制造商的说明，重链和轻链质粒两者均共转染到freestyle293-f细胞中。转染后3天，收集上清液并使用一步亲和纯化来纯化至>95％纯度。用考马斯蓝染色的sds-page凝胶检测纯度(图7)。为了表征纯化的抗体，使用体外fret测定来测量ec50值。将rxfp1cre-bla细胞接种到384孔板中，将连续稀释的抗体/松弛素-h2蛋白(r&dsystems)加入孔中。抗体/松弛素-h2蛋白的最终浓度在0.033nm至135nm的范围内。在这之后，将板在细胞培养箱中温育五个小时，然后加载liveblazer-fretb/g底物，并在室温下温育另外2小时。收集和分析fret信号。如所预期的，支架抗体示出无活性(图8)。另一方面，如图8所示，通过测定的分别为7.9nm、1.4nm、9.6nm的ig1、ig2、ig3的ec50值(天然松弛素-h2分子的ec50为4.9nm)证实了鉴定的screlaxin的激动剂活性。实施例13.材料和方法本实施例描述了用于产生嵌入如本文例示的抗体支架中的一些功能性多肽的一些材料和方法。试剂：兔抗磷酸化stat3购自cellsignaling。人瘦素elisa试剂盒购自r&d。小鼠重组瘦素购自amgen。渗透泵和脑输液试剂盒购自alzet。细胞培养基：将人hek293t细胞维持在包含10％fbs、非必需氨基酸(neaa)、青霉素和链霉素(p/s)的dmem中。leprsie-bla和fshrcre-bla细胞在补充有10％透析的fbs(lifetechnology)、neaa和p/s的dmem培养基中生长。baf3lepr细胞在具有10％fbs、p/s和10ng/mlil-3的rpmi-1640中培养。freestyle293-f细胞维持在补充有4mmglutamax-i(lifetechnology)的freestylef17表达培养基(lifetechnology)中。组合抗体库的构建：将bamhi和xmai限制性位点引入支架的cdrh3环中。瘦素利用三个正向引物(lf1、lf2、lf3)和三个反向引物(lr1、lr2、lr3)(表3)的组合扩增，并使用bamhi和xmai克隆到支架中。单链fsh(scfsh)通过下列连接编码β链的基因的3'和编码α链的基因的5'来构建：ggatcaggatcgaacgcgacggggtcaggttctaatgcaacttcaggatcgactagt(seqidno:2)。然而，使用类似于用于瘦素构建体的策略来扩增scfsh(表4)。表3.用于构建igg-瘦素的组合连接库的启动子。表4.用于构建igg-scfsh的组合连接库的启动子。慢病毒的制备：使用lipofectamine2000转染试剂(lifetechnology)，以1:1:1的比例，利用基于plv2的慢病毒质粒连同pcmv-dr8.91和pvsv-包装质粒一起转染人hek293t细胞。在转染后48小时收集上清液中的慢病毒，并且然后通过0.45μm聚醚砜膜过滤器(millipore)过滤。使用lenti-xp24快速滴定试剂盒(clontech)测量滴度。构建稳定的细胞系：将与c-端血凝素表位(ha)标签融合的人瘦素受体(lepr)基因克隆到基于plv2的载体中，其中感兴趣的基因的表达由延长因子-1α(ef1a)启动子驱动。cellsensorsie-blahek293t细胞用1ng/ml的重组人瘦素(r&dsystems)转导和刺激。使用liveblazer-fretb/g加载试剂盒(lifetechnology)在激发波长为409nm、发射波长为460nm和530nm下分选瘦素响应细胞。按照与人lepr相同的策略构建人fshr细胞系，不同的是细胞用表达由cre控制的β-内酰胺酶的慢病毒共转导。为构建baf3lepr细胞系，将人lepr克隆到pmscvpuro载体中，然后将其转染到pheonix细胞中以产生逆转录病毒，用逆转录病毒感染il-3依赖性baf3细胞，并用10μg/ml嘌呤霉素选择细胞。随后在包含10ng/ml瘦素的培养基中培养嘌呤霉素抗性细胞。增殖测定：baf3lepr细胞用不含il-3的培养基洗涤三次，稀释至20万个细胞/ml，并接种到96孔板(80μl/孔)中。将连续稀释的蛋白质(20μl/孔)加入到细胞中，从而得到1.25pm、12.5pm、125pm、1.25nm、12.5nm和125nm的浓度。细胞在37℃下培养另外48小时。将+celltiter96aqueous，一种溶液试剂(promega)加入细胞(20μl/孔)中。记录490nm处的吸光度。cd光谱测量：将纯化的蛋白质用磷酸钠缓冲液透析两次，然后稀释至0.5mm。使用1-mm路径长度的比色杯在aviv圆二色谱仪型号420上收集远紫外光cd信号，并在室温下在260至190nm范围内进行测量。差示hdx-ms：使用与orbitrap质谱仪(exactivetm，thermofisher)接口的全自动化系统(ctchtspal，leaptechnologies，carrboro，nc；安装在4℃机柜内)进行差示溶液相酰胺hdx实验，与先前所述仅有些许变化。就不同的hdx实验而言，将5μligg-瘦素(10μm)或单独的瘦素(10μm)与20μl包含d2o的hdx缓冲液(20mmtris7.3，150mmnacl，5mmdtt)混合，并在4℃下温育预定时间(0s、10s、30s、60s、900s或3,600s)。交换后，使不期望的正向或反向交换最小化，并且通过加入25μl的淬灭溶液(1％v/vtfa的3m尿素和50mmtcep溶液)使蛋白质变性。然后通过以200μl/min-1(0.1％v/vtfa，1℃)穿过固定的2mm×2cm胃蛋白酶柱(室内制备)来消化蛋白质，所得的胃酶解肽捕集在2mm×1cmc18捕集柱(thermoscientific)中。然后在4℃下将结合肽以线性梯度(5-50％ch3cnw/v和0.3％w/v甲酸)洗脱穿过2mm×50cmc18hplc柱(hypersilgold，thermofisher)并持续8min。使用exactivetmplusorbitrap质谱仪(exactivetm,thermofisher)获得质谱数据。每个hdx实验以一式三份进行，使用pymol(delanoscientific)将差示hdx数据覆盖在人瘦素的晶体结构(pdb代码：1ax8)上。肽鉴定和hdx数据处理：利用ltq线性离子捕集谱仪(ltqorbitrapxl，thermofisher)在70分钟梯度下进行ms/ms实验。产物离子光谱以数据依赖模式采集，并选择五种最丰富的离子进行产物离子分析。将ms/ms*.原始数据文件转换成*.mgf文件并且然后提交给mascot(matrixscience，london，uk)进行肽鉴定和评分。仅具有20或更大的mascot分数的肽包括在用于hdx检测的肽组中。ms/msmascot搜索也针对诱饵(反向)序列进行并排除了假阳性。进一步手动检查mascot检索中所有肽离子的ms/ms光谱，并且经具有最高mascot分数的独特带电离子用于估计序列覆盖率。利用最新版本的内部开发软件hdxworkbench来计算每个肽同位素包封的强度加权平均m/z值(重心)和每个肽的氘吸收水平。反向交换的校正基于估计的70％氘回收率进行，并构成交换缓冲液的已知80％氘含量。动物程序：根据由therockefelleruniversity的iacuc批准的方案进行小鼠的所有外科手术。野生型c57b16/j、ob/ob、db/db和dio(饮食诱导的肥胖)小鼠来自thejacksonlaboratory。为通过外周给药表征其体内功能，通过皮下植入的渗透泵，对于瘦素以600ng/h，对于igg-瘦素以3600ng/h，或对于支架对照物以2920ng/h递送蛋白质。就中心给药而言，蛋白质通过渗透脑输注泵，对于瘦素以50ng/h，并且对于igg-瘦素以300ng/h，递送到侧脑室。在指定的实验时间段期间每天测量每只小鼠的食物摄取量和体重。使用echomri身体成分分析仪测量脂肪组成。为测定蛋白质清除率，将单剂量的瘦素(4.5μg)或igg-瘦素(27μg)通过颈静脉递送到小鼠中，然后在指定的时间点收集血液。通过elisa测量人瘦素的血浆浓度。为检查体内的神经元活化，ob/ob小鼠利用瘦素(2.5μg/g体重)或igg-瘦素(15μg/g体重)通过腹膜内注射，或利用瘦素(100ng)或igg-瘦素(600ng)通过脑室内注射来处理。在处理1小时后，先用pbs之后利用4％多聚甲醛进行心脏灌注。以4％于下丘脑固定后，解剖脑样本并通过自由浮动免疫染色测定，如先前在knight等人，plosone5，el1376，2010中所述。虽然为了清楚理解的目的，已经通过说明和实施例的方式对本发明进行了一些详细的描述，但是鉴于本发明的教导，对于本领域普通技术人员显而易见的是可对其进行某些变化和修改，但不脱离所附权利要求的精神或范围。本说明书中引用的所有出版物、数据库、基因库序列、专利和专利申请以引用方式并入本文，如同每个被具体地和单独地示出通过引用并入那样。宿主scfv支架序列(seqidno:l)：qvqlvqsgaevkkpgssvkvsckasggtfssyaiswvrqapgqglewmggiipifgtanyaqkfqgrvtitadeststayelsslrsedtavyycasqgilgitktstcytrvmdvwgqgttvvvssraslggggsggggsggggstqagltqppsvskglrqtatltctgnsnnvgnqgaawlqqhqghppllsyrnnnrpsgiserlsasrsgntasltitglqpedeadyycaawddslngqvvfgggtkltvl克隆体a3screlaxin-h2序列加末端接头(seqidno:69)：rtrggsggs-qlysalankcchvgctkrslarfc-gsgsgsgs-dswmeeviklcgrelvraqiaicgmstws-sggggslms克隆体c12-2screlaxin-h2序列加末端接头(seqidno:71)：rtrggsggs-qlysalankcchvgctkrslarfc-gsgsgsgs-dswmeeviklcgrjelvraqiaicgmstws-sggggskpp克隆体c12-1screlaxin-h2序列加末端接头(seqidno:72)：plnggsggs-qlysalankcchvgctrslarfc-gsgsgsgs-dswmeeviklcgrelvraqiaicgmstws-sggggskpp当前第1页12