本发明涉及一种用于以能够对循环肿瘤细胞进行有效的基因组dna测序的方式处理血液样品的方法。
已知患有不同癌症的患者的血液中存在循环肿瘤细胞(ctc)。所述循环肿瘤细胞是罕见的细胞并且通常每毫升血液可能仅存在1到1,000个细胞。血液中存在的其他细胞数量上大大超过所述循环肿瘤细胞，这使得通过细胞化学技术或分子技术对ctc进行分析变得复杂。
背景技术：
循环肿瘤细胞(ctc)在癌症中的确切作用仍旧未被完全理解。认为它们是癌症扩散到全身的机制。当前了解到细胞发生突变使控制细胞生长的机制失去活性。很可能存在具有不同影响的多位点突变，如引起抗药性的多位点突变。ctc的水平随着肿瘤负荷增大而升高，并且这个特征用于使用veridex公司的cellsearch仪器监测对例如乳腺癌的疗效。要求在分析之前提取、富集并纯化ctc。
在例如10ml体积的全血中捕获少量ctc具有巨大的挑战性，该全血中将含有约4千万到1亿个白细胞和高达550亿个红细胞。
所有这些ctc富集方法的关键问题是ctc的内在脆弱性难题。
阳性富集技术过去一直用于选择和捕获ctc，这些技术包括使用细胞特异性抗体包被珠的免疫磁性分离法(ims)、或依赖于ctc与血细胞(如白细胞、红细胞和血小板)之间的大小差异的替代性物理诱捕法。ims过程通常包括使用ctc特异性抗体，如抗epcam。这种抗原是被认为仅存在于源自肿瘤的循环细胞中而不存在于血细胞表面上的上皮细胞表面标志。
所有这些阳性ctc选择技术的缺点是它们依赖于可能不存在于所有ctc中的细胞特征。例如，不是所有ctc可以表达epcam，因此它们不会被ims技术检测到。并且，在血液中不是所有ctc都可以具有比白细胞更大的直径，特别是当细胞处于早期发育阶段并且也许非常容易受到处理的影响。这些较小的细胞不会被旨在富集大得多的细胞的物理诱捕技术保持住。因此，在正选择技术下，存在以下风险：一些ctc不会在富集的级分中存在，而这将导致假阴性诊断测试结果。
在一些癌症中，例如胰腺癌，似乎没有epcam表达或所述表达非常有限。在这些癌症中，认为ctc改变了其表型并且能失去上皮细胞特征而在特征上成为间充质；这可能是ctc扩散到全身的阶段。已知的抗epcam抗体捕获机制因此在癌症最危险并且转移到全身时可能不起作用。这个不能检测到这样的ctc的问题在本发明中得以克服。
负选择技术、即从样品中移除ctc以外的细胞现在作为减少假阴性结果的方式在积极考虑当中。负选择技术依赖于高效地移除可能损害到对样品中存在的ctc的检测的所有血细胞，在悬液中只留下剩余的互不干扰血细胞和ctc。负选择方法因此不取决于ctc细胞的任何特异性特征并且因此作为一种富集技术更广泛地适用。然而，尤其是当使用分子分析法(如pcr或测序)来分析ctc基因组的突变时，希望负选择方法通过确保高效移除白细胞来减少特定野生型背景(来自其他有核细胞中的非突变基因)和源自血液中其他有核细胞的过量dna的总体pcr干扰。
us7205157b(jurgensen等人)04/04/2007提出了通过使用适当抗体包被磁珠的阳性或负选择法在包含采收浮子的管中进行离心来从样品流体分离罕见细胞。在负选择方法中，通过从中间层移液来将ctc收集在采收器中。所描述的两种方法不足以满足能够对循环肿瘤细胞进行有效测序的要求。离心方法可能彻底破坏一些感兴趣的细胞，并且鉴于这些细胞是罕见的，这对最终样品的可用性具有巨大的影响。所使用的磁珠直径通常在4到5μm之间，发明人已经发现其与在样品中引起显著聚集和凝集的红细胞非特异性缔合，意外地在凝团中捕获感兴趣的细胞。在美国专利7205157b中描述的负选择方法中，所形成的ctc细胞的带不深并且在不捕获大量淡黄色上层的情况下用移液器单独吸取ctc细胞非常困难。美国专利7205157b中描述的正选择法存在与其他正选择方法相同的缺点。yang等人(生物技术与生物工程(biotechnologyandbioengineering)2009，102卷，第2期)描述了使用红细胞裂解、之后在负选择方法中移除cd45+细胞。yang等人阐述了为了ctc检测最佳，需要完全移除红细胞。
下一代测序(ngs)技术的引进允许对ctc基因组在更为详细的水平上进行分析并且现在认识到癌基因突变的检测在治疗癌症患者时可以向临床医生提供有价值的信息。从事肺腺癌和结直肠肿瘤组织研究的milbury等人(靶向扩增子重测序之前的罕见细胞突变的cold-pcr富集，临床化学201258:3580-589)报告使用cold-pcr(较低变性温度下的共扩增pcr)来生成突变特异性扩增子、之后进行ngs测序。milbury等人报告使用常规pcr突变扩增方法时的测序误差在1％-2％范围内，而他们的cold-pcr技术能够使突变富集高于与误差相关的噪音，从而能够可靠地鉴别大致0.04％的突变丰度，即在信噪比方面50倍的增强。
wo2014/165762a(samuels等人)09/10/2014披露了一种分析包括dna的生物材料的方法，所述方法包括第一步骤：使用标准技术(包括免疫磁性分离法)从血液样品中移除非ctc细胞、然后提取dna并使用未稀释的样品生成大量隔室，其目的是实现每个隔室一个基因组或更少。然后在一个实施例中使用用于对感兴趣突变的存在进行微滴数字pcr检测的标准方法来分析通常是水微滴的每个隔室。wo2014/165762a还提出通过作为检测突变的替代性方式的ngs来分析所述隔室，但没有提出这在已经生成成千上万个或数百万个微滴时如何现实地实现。
发明人已经发现通过负选择和ngs组合的ctc富集是最佳ctc突变检测方法，因为其组合了两者互补的技术：首先，负选择通过避免使用不可靠的正选择技术减少了或优选地消除了诊断测试的假阴性的发生，并且第二，dna测序提供大量序列数据，与如pcr等较简单的检测技术相比提高了分析的准确度和可靠性。
最近开发出的ngs方法是能够生成大量突变序列信息的相对简单的自动化技术。如此，它们非常适合于在诊断性测定中使用以初始确定癌症的突变谱。
然而，尽管阴性细胞选择和ngs的组合原则上是强大的ctc分析方法，但应清楚的是，当靶ctc基因组以高于1个ctc基因组：100个正常基因组(即，1个ctc细胞：50个非ctc有核细胞)的频率存在于富集样品中时，当前的ngs技术才能提供可靠的信息。这是因为还如milbury等人报告的，由于taqdna聚合酶造成的碱基错掺，用于扩增感兴趣基因序列的初始pcr步骤固有地是‘有噪声的’，并且因此将无法检测到从血液中的有核细胞中提取的dna样品中低于1％频率存在的突变。
技术实现要素：
根据本发明，一种在血液样品中检测突变的方法包括：
·对所述血液样品进行处理以去除一部分正常的非ctc有核细胞；
·纯化来自所述经处理的样品的dna；
·稀释所述经纯化的dna；
·将所述经稀释的dna分成两个或更多个重复品；
·将每个重复品中存在的dna进行测序；并且
·如果对所述重复品的测序读数中的1％或更多显示突变则鉴别所述突变。
优选地，用于对突变进行鉴别的阈值是重复品的2％或更多、3％或更多、5％或更多、或10％或更多读数中的一者显示所述突变。
优选地，稀释液中的dna浓度是每微升100个基因组或更少。在理论实例中，如果ctc基因组的频率在初始处理血液样品以去除一部分正常的非ctc有核细胞之后为1％并且最终体积为10μl并且10份相等的1μl重复品均被制备，则具体重复品中存在的ctc基因组将较存在的野生型基因组有效地富集另外10倍。最终稀释液中的总基因组的最佳浓度由可以实际制作并被测序的重复品的数量来决定；明显地，如果浓度显著高于每微升100个基因组，则如果仅使用有限数量的重复品(即，10个或更少)，ctc基因组富集的概率将降低。在这个实例中，重复品的数量必须相应地增加以达到有效富集，这使得所述方法不经济。在以上给出的、在处理血液样品以去除一部分正常的非ctc有核细胞之后存在的ctc基因组的频率为1％或更低的理论实例中，于是使用最终稀释液中低得多的浓度(即，每微升10个基因组或更少)显著降低任何重复品中存在ctc基因组的概率。因此，本发明的方法要求最终稀释液中总基因组的最佳浓度与有待被测序的实际重复数量品相匹配。
在本发明中，优选地，最终的经稀释的样品分成2个、5个或更优选地10个重复品。显而易见，随着最终稀释样品的重复品数量增加，任何重复品中存在的任何ctc基因组的富集倍数相应地增大，实际限制是对所有重复品进行测序的成本。然而，随着未来测序成本下降和随着引入经改进的自动化和微流控技术，因此基于常规将测序的重复品数量增加到>10是将会有成本效益的。这种方法不同于wo2014/165752a中描述的方法，因为其使用有限数量的重复品(隔室)，其中每个重复含有非ctc和ctc基因组的混合物，而不是对各自含有单一基因组的大量隔室进行测序。
在本发明的一个实施例中，从血液样品中捕获并去除一部分非ctc有核细胞的是通过结合到特异性非ctc细胞抗体包被珠上并将带有所捕获的非ctc有核细胞的珠优选地以磁性方式或通过重力作用与剩余的样品分开。在wo2013/121216a(stanley等人)22/08/2013(highefficiencycellcapture“高效细胞捕获”)中描述了被设计用于从全血中捕获细胞、用于处理血液样品以去除一部分正常的有核细胞的合适的密集的磁珠。
用方法将珠进行官能化以将抗体(例如，蛋白a或链霉亲和素)与生物素化抗体附接。具有针对cd45的特异性的抗体可以用于所述方法中。cd45是除了红血球和血小板以外的所有分化型造血细胞上存在的类型1跨膜蛋白质。这包括发明人想要去除的所有含dna的白细胞。利用针对这种抗原的抗体，并且在一些情况下，优选地组合地利用针对cd3和cd14的抗原来提供更高效率的总白细胞捕获和去除。
优选地，珠直径在20-150μm之间，并且更优选地直径在50-100μm之间；因此大幅度大于us7205157中考虑的珠大小。同样，理想上，珠可以具有>1.5g/ml并且优选地在2g/ml与5g/ml之间的密度，以促进以机械方式引起移动穿过粘性全血样品和捕获悬浮的白细胞。
根据本发明的第二实施例，从血液样品中捕获并去除一部分正常的非ctc有核细胞是通过密度梯度离心法。
根据本发明的第三实施例，从血液样品中捕获并去除一部分正常的非ctc有核细胞是通过密度梯度离心法。实质上，本发明可以被总结为包括负选择步骤：从血液样品中去除一部分非ctc细胞，之后从剩余的非ctc细胞和富集的ctc中提取dna，之后将所提取的dna稀释到非常低的浓度并对最终稀释液的多个重复品进行测序。因此，整个过程包括两个不同的按序进行的ctcdna富集步骤，第一步骤通过将完整细胞进行分离来确保去除一部分非ctcdna，而第二步骤目的在于生成至少一个重复品，所述重复品由于在制备所述重复品过程中出现的基因组泊松分布而含有ctcdna。第二富集步骤的优点是其补偿了第一步骤中不彻底的非ctc去除，由此允许在pcr引起的碱基错掺的背景下可靠地检测突变。
发明人认为，如果在所有重复品中或一个或多个重复品中在>1％ngs读数中、优选地超过2％、或更优选地超过3％、或更优选地超过5％的测序读数中检测到突变序列，则认为ngs方法中报告的突变序列是可靠的；然而如果突变序列存在于小于1％的ngs读数中，则这可能是由于pcr碱基错掺误差并且因此不是明确的结果。
通过负选择、之后有限稀释并对多个重复品进行测序的方法进行的这种ctc富集有许多优点。
首先，ctc表达的表型无关紧要。负选择之后剩余的含dna的细胞是充分富集的有待与有限稀释/多个重复品方法相结合有效地测序的ctc。
第二，当ctc很可能处于扩散到全身、引起转移发展过程中可以对它们进行测序。当作为单细胞循环时，它们很可能对这个阶段期间的治疗性干预非常有价值。
第三，血液中可以存在比经由epcam表面抗原或通过大小选择捕获检测到的多得多的ctc。这种经改进的方法准许分离和分析这些当前无法检测的细胞。
第四，这提供了一种具有提高癌症生存率的潜力的筛检工具。在可以获得先进的医疗保健的国家中在大多数情况下，患者经原发性肿瘤的切除和治疗后活下来。由于转移到全身而引起的多种继发性肿瘤的发展导致死亡。等到检测到它们时，肿瘤已经在周围组织或主要器官中固定。认为初期治疗时的ctc水平高，由此就需要去除的白细胞的绝对数量方面降低所要求的纯度目标。通过使用测序技术在这样的早期阶段鉴别出该患者中的突变，随后可以使用低成本和常规分子测试，如qpcr，以监测患者治疗后情况和检测来自肿瘤的ctc的重现；允许在继发性肿瘤可以植入并开始生长之前立即治疗。
第五，这是一种用于监测患者对治疗的响应和引导治疗选择的工具。癌症不是静态的，而是在多个细胞亚群体中含有各种不同的突变。这些可以通过例如阻止毒剂转移到细胞中并杀死所述细胞等机制而引起对某些治疗的抗性。与细菌抗生素抗性一样，临床医生正在观察到随着疾病发展癌症不断变化的癌症抗性谱。可假定所述治疗杀光易感癌细胞群体，但有抗性的ctc可以增殖并生长成有抗性的癌症形式。因此临床医生拥有信息来帮助选择非常有可能对个体患者起效的疗法并且然后在治疗过程中在血样测试上使用一般筛查以实时观察其起效与否和ctc水平是否开始升高以查明是否出现有抗性的癌症形式并且相应地改变疗法。
发明人认为如yang等人所使用的，在非ctc有核细胞去除步骤之前使用红细胞裂解步骤不是有利的，因为在所使用的严酷细胞裂解条件下其可能导致脆弱ctc的损失。的确，yang等人报告其红细胞裂解步骤、之后进行离心以使剩余的单核细胞集聚，这导致损失33％的单核细胞。假定由于血液中的上皮或间充质样ctc细胞可能比血液单核细胞更脆弱，所以ctc的损失可能非常高。
发明人已经发现红细胞在非ctc有核细胞被去除之前保持完整并且它们接着在后续步骤中当从剩余的有核细胞中提取dna并对其进行纯化时被裂解。从这个裂解步骤释放的红细胞的血红蛋白于是在使用ngs对ctc基因组进行测序之前在标准dna纯化技术中被去除。
在替代性过程中，通过例如特异性抗红细胞的抗体包被珠的使用在第一步骤中可以去除血液样品中的一部分或基本上所有红细胞，之后在涉及特异性抗非ctc抗体包被珠的第二步骤中去除非ctc有核细胞。这每一个步骤可以被重复一次或多次，以确保高效去除红细胞和/或非ctc细胞。在将非ctc有核细胞结合到抗体包被珠之前去除红细胞的优点是可以抑制样品中非常大量的红细胞(>1000x)结合存在的更有限数量的其他细胞；假定是通过非特异性位阻效应。用于去除存在的所有红细胞的合适抗体可以是针对通用抗原具有特异性的抗体，如cd235a(血型糖蛋白a)。
根据本发明，一种分析ctc基因组中的突变谱的再另外的方法的特征在于包括：在从血液样品中去除至少一部分非ctc有核细胞之前去除一部分或基本上所有红细胞；随后使富集的ctc细胞裂解并纯化dna；实施限有限稀释步骤以达到每微升少于100个基因组、优选地每微升少于20个基因组的水平；将经稀释的样品分成2个或更多个、或优选地10个、或多于10个重复品；对每个重复品中的ctc基因组的特定区域进行测序；如果重复品中的超过1％、优选地超过2％或更优选地超过3％的测序读数显示在ctc基因组的特定区域的突变，则鉴别出序列中的所述突变。
作为用于固定到捕获珠上的细胞特异性抗体的替代抗体包括基于核酸的适配子或凝集素或聚合抗体模拟物。
发明实例
实例1
以下是用于掺有培养的panc1细胞的全血的分析目的的实例，展示了也包括红细胞去除步骤的阴性富集方案。
将20μl链霉亲和素衍生磁珠(50-100μm直径，通用电气医疗集团(gehealthcare))添加到未包被的聚苯乙烯微孔中。然后添加10μl的生物素酰化抗cd235a小鼠单克隆抗体(英国剑桥艾碧康(abcam)公司)和10μl磷酸缓冲盐缓冲液ph7.5(pbs)并且在板式摇床上以200rpm在室温下孵育板30分钟。然后用pbs清洗这些珠3次，使用磁性分离法从清洗缓冲液中回收这些珠。将pbs中25μl的1/10全血添加到经清洗的抗235a抗体包被珠，之后每个孔添加16,000个panc1细胞，n＝3。(panc1细胞是胰腺肿瘤细胞系并且在所述实例中充当ctc模拟物)。然后将抗体包被珠和掺入的全血样品孵育30分钟而不摇动，以去除红细胞。然后将红细胞去除后的上清液吸出并添加到另一未包被的微孔中，并且添加根据上述方法制备的20μl抗cd45包被的磁珠，并且将样品孵育另外30分钟而不摇动，以去除cd45+细胞，即，非ctc有核细胞。然后将耗尽非ctc有核细胞的上清液移除并且使悬液中的剩余细胞裂解，并且使用罗氏magnapure系统纯化释放的dna。使用lightcycler(罗氏)实时定量pcr系统评估珠提取步骤之后剩余的正常非ctc有核细胞和panc1细胞的水平。使用针对正常的kras基因的pcr引物来对正常的dna进行定量，同时使用针对在密码子12处的kras天冬氨酸突变的pcr引物测量源自掺入的panc1细胞的dna。
在另外的实验中，重复以上过程，其中在cd45+细胞去除步骤之前添加第二红细胞去除步骤。
所附表1中陈述了结果，示出了在lightcyclerpcr仪器中从掺入的全血提取的和对panc1细胞进行负选择之后从样品提取的dna获得的ct值。
表1
所述结果显示负选择方案显著减少了全血样品中的非ctc有核细胞，在悬液中留下大部分掺入的panc1细胞。在表1中的过程b)中观察到的非ctc有核细胞减少大致500倍，而没有可测量的panc1细胞损失。
实例2
以下是本发明的方法应用于从晚期转移性胰腺癌患者取得的全血样品的实例。在这个实例中，没有单独的红细胞去除步骤，并且所述过程涉及特定的白细胞耗竭步骤、之后是细胞直接裂解、dna纯化、稀释、多个重复品的制备和最后ngs方案。
根据实例1中的方法，将链霉亲和素包被的、50-100μm直径的磁性琼脂糖珠(通用电气医疗集团(gehealthcare)，小查尔芬特(littlechalfont)，英国)用生物素化抗cd45单克隆抗体(英国剑桥艾碧康(abcam)公司)进行包被。然后，将0.5ml的抗cd45抗体包被珠添加到来自被诊断为患有晚期转移性胰腺癌的70岁女性患者的7.5ml全血中；所述样品由英国皇家利物浦医院胰腺癌部门(royalliverpoolhospital,pancreaticcancerunit)在得到适当的伦理道德许可的情况提供。然后在首尾相连的转台上将所述珠和全血样品在室温下混合30分钟。然后，使用磁体将珠吸引到管的侧面并从所述管吸出白细胞耗竭后的上清液。然后使白细胞耗竭后的上清液的0.5ml的等分部分裂解，根据罗氏magnapure系统中的标准方法纯化并浓缩释放的dna。这种仪器递送在0.1ml的缓冲液中的纯化后的dna样品，并且然后基于以p53野生型序列为基础的qpcr分析被稀释到每μl10个基因组的大致浓度。然后，从经稀释的每μl10个基因组的储备溶液中取10×1μl的等分部分，以制作10个重复品，并且使用iontorrentngs系统(美国卡尔斯巴德市生命技术公司(lifetechnologiesinc.))使每个重复品经受文库制备、编上条形码、克隆扩增和p53基因测序。
这种稀释成10个基因组/10个重复品的过程(“10g/10”)在表2中进行了展示，示出了来自在ngs分析之前已经使用抗cd45包被珠处理过的全血样品的数据。
表2
iontorrent仪器中来自所有10×1μl等分部分的所有读数的11.4％中存在突变序列(t>a)。具体地，在重复品1中，读数的32.9％是突变序列，而在重复品4中，2.88％是突变序列；两者明显高于针对可靠突变检测指定的最小1％阈值。这因此在这位胰腺癌患者的血液中可靠检测到p.e271v突变。p.e271v是p53外显子8中已知的错义突变，导致功能丧失。
表3中示出了使用来自同一患者、经未包被的珠处理的血液的对照实验，所述珠在表面上没有抗cd45抗体。
表3
在这种情况下，在被测序的10个重复品中的任一者中没有检测到高于针对pcr碱基错掺而设定的1％阈值的已知突变。这表明，在这个耗竭非白细胞的样品中，ctc突变基因组没有充分富集到允许通过ngs进行可靠的突变识别。
表4示出了来自同一患者的、尚未使用珠进行处理(即还没有对全血进行处理)的第三血液样品的结果。在这个第二对照实验中，在被测序的10个重复品中的任一者中没有检测到高于1％阈值的已知突变。
表4
在这个第二对照实验中，在被测序的10个重复品中的任一者中没有检测到高于1％阈值的已知突变。
总之，结果显示通过ngs在晚期胰腺癌患者的血液中检测到突变p.e271v，前提是样品中存在的大量野生型dna通过白细胞特异性抗体包被珠的两个富集步骤、之后通过10g/10有限稀释/多个重复品步骤而被去除。这个样品还确认了在细胞裂解和dna纯化之前不要求从血液样品中去除红细胞。由于这个过程涉及非特异性细胞裂解、纯化、和浓缩方案，产生的dna溶液很可能含有来自非白细胞(推定的ctc)的富集基因组和dna片段、以及循环肿瘤dna(ctdna)。在这个实例中，不可能在这两个不同的突变序列源之间进行区分。
实例4
在这个实例中，使用了用于在全血中富集ctc的两种市售的负选择方法。第一方法“玫瑰花结步骤(rosettesep)”(肝细胞技术有限公司(stemcelltechnologiesinc.))使用针对人类造血细胞上的细胞表面抗原(cd45、cd66b)的单克隆抗体来将白细胞与使用抗血型糖蛋白a抗体形成的红血球玫瑰花结交联。通过浮力密度介质(如菲可帕克(ficoll-paque))离心将这些“免疫玫瑰花结(immunorosette)”制成沉淀，其中ctc在菲可帕克层上保持为非玫瑰花结形并且可以通过吸出而被回收。
第二负选择方法是oncoquick装置(德国葛莱娜第一生化有限公司(greinerbio-one))，其使用通过离心形成的更精细的密度梯度。ctc保持在多孔膜之上的梯度上层中，而在离心过程中，较重和密度较大的白细胞在管的底部被沉淀。然后可以通过吸出来回收ctc。
rosettesep方法首先作为负选择富集过程用于来自三位癌症患者的全血上。使用本发明的方法，其中稀释到每微升10个基因组并且对10分重复品进行测序(“10g/10”)，以在小部分ctc中鉴别出p53突变，在免疫玫瑰花结沉淀中看不到所述突变，预期其不含有ctc(参见表5)。
表5
随后，使用oncoquik和rosettesep两者处理冰冻全血样品和新鲜全血样品的组合。在这个实例中，样品被稀释到每微升20个基因组并且对2个重复品进行测序(“20g/2”)。在2个健康的对照中没有发现突变。在3/7胰腺癌患者中鉴别出突变。在新鲜全血样品中在oncoquik和rosettesep富集的样品中发现krasp.v14l的突变。
装置
在图1中，用于阴性选择ctc细胞的装置包括微孔1，所述微孔具有附接至底部和可能其侧面的磁体2(正常情况下是永磁体，尽管可以使用电磁体)。将直径为50-100μm、密度通常为3.5g/ml(通用电气医疗集团)并且包被上抗cd45生物素化抗体的链霉亲和素衍生磁珠添加到含有可疑ctc细胞的血液样品中、进行混合并允许孵育30分钟。将血液和包被抗体的珠的混合物置于微孔1中。发现大的、比较重的珠高效地捕获血液中的白细胞，而没有使用较小、较轻的珠所看到的红细胞凝集和聚集。
将血液和珠混合物4置于微孔中；珠5结合白细胞并吸引至磁体2上并聚合在与磁体2相邻的微孔1的表面上，一些珠在重力作用下还落到微孔的底部并被磁体固持在那里。
现在耗竭了白细胞的样品可以使用移液管6从微孔被吸引出来，所述移液管延伸到微孔的基底附近，但与底部保持足够的空隙，从而不吸入珠和在那里已经固定不动的白细胞。
现在使剩余的富集ctc的样品裂解并优选地使用罗氏magnapure系统制备释放的dna。
对于大多数ctc，将发现裂解之前的富集血液样品将含有以1:50或更大的频率存在的ctc。
可以在通过以相同方式提取白细胞之后使用包被有抗cd235a生物素化抗体以与上述相同方式从样品中取出红血球。但由于红细胞不含有干扰后续步骤的dna，所以这样做时好像优点极小并且可能存在在过程中损失靶ctc的某些风险。
对于一些ctc，特别是源自胰腺癌的那些，在裂解步骤之前可能有必要重复白细胞初始分离，以便进一步减少样品中任何剩余的白细胞的数量。
还将有益的是使珠包被上抗cd3抗体、抗cd14抗体、抗cd19抗体以及抗cd45抗体，以提高t细胞、单核细胞、和b细胞的去除效率。可以使用用于其他白细胞表面抗原的另外抗体。
权利要求书(按照条约第19条的修改)
1.一种在血液样品中检测突变的方法，该方法包括：对所述血液样品进行处理以去除一部分正常的非ctc有核细胞；纯化来自所述经处理的样品的dna；稀释所述经纯化的dna；将所述经稀释的dna分成两个或更多个重复品，其中每一重复品包含源自ctc的基因组和源自非ctc的基因组两者；对每个重复品中存在的dna进行测序并且如果对一个或多个重复品的测序读数中超过1％显示所述序列中的突变则鉴别所述突变。
2.根据权利要求1所述的方法，其中鉴别突变的阈值是重复品的2％或更多、3％或更多、5％或更多、或10％或更多读数中的一者显示所述突变。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述dna被稀释成每微升100个基因组的水平或更低的水平。
4.根据任一项前述权利要求所述的方法，其中所述dna被稀释成每微升20个基因组的水平或更低的水平。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述dna被稀释成每微升10个基因组的水平或更低的水平。
6.根据任一项前述权利要求所述的方法，其中所述经稀释的dna被分成五个或更多个重复品并且对每个重复品进行测序。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述经稀释的dna被分成10个或更多个重复品并且对每个重复品进行测序。
8.根据任一项前述权利要求所述的方法，其中使用非ctc细胞抗体包被珠去除一部分非ctc有核细胞。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述珠包被有抗cd45抗体。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述珠另外包被有抗cd45抗体、抗cd14抗体、抗cd19抗体、和抗cd3抗体中的一者或多者。
11.根据权利要求8至10中任一项所述的方法，其中所述珠的直径为20μm到150μm(含)。
12.根据权利要求8至11中任一项所述的方法，其中所述珠具有1.5g/ml或更大的密度。
13.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中使用密度梯度离心法去除一部分非ctc有核细胞。
14.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中通过以下来去除一部分非ctc有核细胞：由红细胞形成玫瑰花结并使用非ctc细胞特异性抗体将非ctc细胞结合到所述玫瑰花结上。
15.根据任一项前述权利要求所述的方法，其中去除一部分非ctc有核细胞之前去除所述样品中存在的一部分红细胞或基本上所有红细胞。