一种提高薯类块根抗性淀粉含量的方法及应用与流程

本发明属于生物技术以及植物学领域，更具体地，本发明涉及一种提高薯类块根抗性淀粉含量的方法及应用。

背景技术

薯类植物主要指具有可供食用块根或地下茎的一类陆生作物。有块根、块茎类，如番薯(红薯、甘薯)、木薯、马铃薯、薯蓣(山药)、脚板薯等，多行无性繁殖，只留薯块作种，并可以用藤本进行繁殖。这类植物一般耐寒力较弱，多在无霜季节栽培，低温会抑制薯类作物的生长，造成块根或块茎的减产，因此种植薯类作物尽量避免长时间的低温期；此外，疏松、肥沃、深厚的土壤和多量钾肥有利于提高薯类作物产量及品质。

englyst等根据人体对淀粉消化释放葡萄糖时间的快慢将淀粉分成三种：(1)快速消化淀粉(rds，rapiddigestiablestarch)是指那些能在人体小肠中被快速消化吸收的淀粉，20min内消化完全；(2)慢消化淀粉(srs，slowlydigestiablestarch)是指那些能在人体小肠中被完全消化吸收但是速度较慢的淀粉，20～120min时间段内消化；(3)抗性淀粉(rs，resistantstarch)是指在人体小肠内无法消化吸收，被排到大肠，类似膳食纤维，能被大肠内的微生物发酵利用。影响淀粉消化性与生理反应的主要因素有淀粉来源、颗粒结构、结晶性质、直链淀粉和支链淀粉的比率以及与淀粉结合的其它成分如蛋白质、脂类等。

这种淀粉较其他淀粉在体内消化、吸收和进入血液较缓慢，具有类似膳食纤维的功能特性。但抗性淀粉本身仍然是淀粉，其化学结构不同于纤维。作为一种新型功能型添加剂，抗性淀粉对人体健康有重要作用，它能降低血糖和胰岛素的反应，适合肥胖病人和糖尿病人食用。动物实验表明，抗性淀粉还具有降低血清胆固醇、防治心血管疾病的作用。此外，抗性淀粉还具有比传统膳食纤维更好的加工特性，特别是在膨胀度、黏度、凝胶能力、持水性等方面。作为一种新型的膳食纤维，抗性淀粉具有类似于传统膳食纤维的生理功能，在大肠中，经微生物发酵，它的产短链脂肪酸尤其是丁酸的能力远远高于普通膳食纤维。而且，将抗性淀粉添加到食品中，不会影响食物的风味、质地和外观，在许多应用中，甚至可以提高最终产品的风味。因此rs已作为保健营养成分应用于面包、谷物早餐、面条等普通食品和减肥食品等特殊食品中。

薯类植物作为一种富含淀粉的植物，有必要研究、改变其淀粉品质，获得更优的品种，例如抗性淀粉含量高的品种。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种提高薯类块根抗性淀粉含量的方法及应用。

在本发明的第一方面，提供一种提高薯类植物的块根中的抗性淀粉含量或改变淀粉相关性状的方法，所述方法包括：下调薯类植物中抗性淀粉相关多肽的表达或活性；

其中，所述的抗性淀粉相关多肽选自下组：

(a)如seqidno:2氨基酸序列的多肽；

(b)将seqidno:2氨基酸序列经过一个或多个(如1-20个；较佳地1-10；更佳地1-5个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)多肽功能的由(a)衍生的多肽；或

(c)与(a)限定的多肽序列有85％以上(较佳地90％以上，更佳地95％以上，如98％以上，99％以上)同源性且具有(a)多肽功能的由(a)衍生的多肽。

在一个优选例中，所述的薯类植物是具有抗性淀粉相关多肽或其同源蛋白的植物。

在另一优选例中，所述的薯类植物包括(但不限于)：木薯，甘薯、马铃薯、山药、芋头、葛根、魔芋、洋姜、雪莲果。

在另一优选例中，所述降低植物中抗性淀粉相关多肽的表达包括：将干扰所述抗性淀粉相关多肽表达的干扰分子转入植物。

在另一优选例中，所述的干扰分子是以抗性淀粉相关多肽的编码基因或其转录本为抑制或沉默靶标的dsrna、反义核酸、小干扰rna、微小rna，或能表达或形成所述dsrna、反义核酸、小干扰rna、微小rna的构建物。

在另一优选例中，干扰所述抗性淀粉相关多肽表达的干扰分子靶向抗性淀粉相关多肽的编码基因或其转录本；较佳地，靶向该编码基因的第548-741位或其转录本。

在另一优选例中，所述的干扰分子含有式(i)所示的结构：

seq正向-x-seq反向式(i)，

式(i)中，

seq正向为抗性淀粉相关多肽的编码基因的片段，seq反向为与seq正向互补的多核苷酸；

x为位于seq正向和seq反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与seq正向和seq反向不互补。

在另一优选例中，所述seq正向为抗性淀粉相关多肽的编码基因的第548-741位。

在另一优选例中，所述方法还包括后续步骤：从下调抗性淀粉相关多肽的表达后的植物中选择出相较野生型植物而言性抗性淀粉含量升高或淀粉相关性状改变的植物。

在另一优选例中，所述的改变淀粉相关性状选自：

(1)提高储藏性淀粉中直链淀粉的含量；

(2)调节储藏型淀粉中支链淀粉链长分布；较佳地为：使短链(dp6-9)比例上升，中链(dp10-18)比例下降；中长链(dp19-33)比例上升，约0.19％左右；长链(dp>33)比例下降；

(3)调节储藏型淀粉的淀粉糊粘度性质；较佳地为：降低峰值粘度、热粘度和冷粘度；

(4)调节储藏型淀粉的热力学性质；较佳地为：使储藏型淀粉to、tp、tc和δh降低；

(5)调节储藏型淀粉的淀粉结构；较佳地为：使晶型结构转向b型。

在本发明的另一方面，提供一种下调抗性淀粉相关多肽表达的物质的用途，用于提高薯类植物的块根中的抗性淀粉含量或改变淀粉相关性状。

在一个优选例中，所述的改变淀粉相关性状选自：

(1)提高储藏性淀粉中直链淀粉的含量；

(2)调节储藏型淀粉中支链淀粉链长分布；较佳地为：使短链(dp6-9)比例上升，中链(dp10-18)比例下降；中长链(dp19-33)比例上升，约0.19％左右；长链(dp>33)比例下降；

(3)调节储藏型淀粉的淀粉糊粘度性质；较佳地为：降低峰值粘度、热粘度和冷粘度；

(4)调节储藏型淀粉的热力学性质；较佳地为：使储藏型淀粉to、tp、tc和δh降低；

(5)调节储藏型淀粉的淀粉结构；较佳地为：使晶型结构转向b型。

在另一优选例中，所述的薯类植物包括：木薯，甘薯、马铃薯、山药、芋头、葛根、魔芋、洋姜、雪莲果等。

在本发明的另一方面，提供一种下调抗性淀粉相关多肽表达从而提高薯类植物的块根中的抗性淀粉含量或改变淀粉相关性状的干扰分子，其含有式(i)所示的结构：

seq正向-x-seq反向式(i)，

式(i)中，

seq正向为抗性淀粉相关多肽的编码基因片段，seq反向为与seq正向互补的多核苷酸；

x为位于seq正向和seq反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与seq正向和seq反向不互补。

在一个优选例中，所述seq正向为抗性淀粉相关多肽的编码基因的第548-741位。

在本发明的另一方面，提供一种载体，所述的载体含有前面所述的干扰分子。

在本发明的另一方面，提供一种抗性淀粉相关多肽或其编码基因的用途，用于作为鉴定薯类植物的抗性淀粉构成或淀粉相关性状的分子标记。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、含有发卡结构的rnai双元表达载体示意图。

图2、转基因植株southernblot鉴定结果。

图3、ss2-rnai转基因植株中木薯淀粉合成相关基因表达水平的变化。

图4、转基因植株中木薯淀粉合成相关基因蛋白表达的westernblot分析结果。以actin为蛋白上样量内参，以野生型木薯tms60444为对照；蛋白提取材料为大田木薯植株的成熟块根材料。

图5、野生型及转基因木薯块根中的抗性淀粉含量。图中所示数据为三次重复结果。*代表t-test检验差异显著(p<0.05)，**代表t-test检验差异极显著(p<0.01)。

图6、野生型及转基因木薯块根中淀粉的直链淀粉含量。图中所示数据为三次重复结果。*代表t-test检验差异显著(p<0.05)，**代表t-test检验差异极显著(p<0.01)。

图7、野生型及转基因木薯块根储藏型淀粉的链长分布。

a：野生型块根储藏型淀粉的链长分布；

b-d：分别为转基因植株ssc-2、6、7块根储藏型淀粉与野生型块根储藏型淀粉链长分布之差。以上数据为三次实验重复。

图8、使用快速粘度仪rapidviscoanalyzer(rva-4series，newportscientific，australia)分析淀粉粘度特征的结果。

图9、野生型及转基因木薯块根储藏型淀粉的xrd衍射图谱。

具体实施方式

本发明人经过深入的研究，发现通过改变一种抗性淀粉相关基因在薯类植物中的表达，可以显著调节薯类植物的抗性淀粉性状以及其它一些淀粉相关性状，在植物品质的遗传改良上具有良好的应用前景。

如本文所用，本发明的“薯类植物”也称为“薯类作物”，主要指具有可供食用块根或地下茎的一类的陆生作物。包括但不限于：大戟科的块根植物如木薯、旋花科的块根植物如甘薯，茄科的块茎植物如马铃薯，薯蓣科的块根植物如山药，天南星科的块茎植物如芋头、魔芋，豆科块根植物如葛根，菊科块茎植物如洋姜，雪莲果等。

在本发明中，术语“抗性淀粉相关多肽”指具有抗性淀粉相关多肽活性的seqidno:2序列的多肽。

本发明还包括所述的抗性淀粉相关多肽的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的抗性淀粉相关多肽相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根据本文的定义这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

任何一种抗性淀粉相关多肽的生物活性片段都可以应用到本发明中。在这里，抗性淀粉相关多肽的生物活性片段的含义是指作为一种多肽，其仍然能保持全长的抗性淀粉相关多肽的全部或部分功能。通常情况下，所述的生物活性片段至少保持50％的全长抗性淀粉相关多肽的活性。在更优选的条件下，所述活性片段能够保持全长抗性淀粉相关多肽的60％、70％、80％、90％、95％、99％、或100％的活性。

术语“抗性淀粉相关多肽”还包括具有与抗性淀粉相关多肽相同功能的、seqidno:2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个，还更佳如1-8个、1-5个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在c末端和/或n末端添加或缺失一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在c末端和/或n末端添加或缺失一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括抗性淀粉相关多肽的活性片段和活性衍生物。

任何与所述的抗性淀粉相关多肽同源性高(比如与seqidno:2所示的序列的同源性为70％或更高；优选的，同源性为80％或更高；更优选的，同源性为90％或更高，如同源性95％，98％或99％)的、且具有抗性淀粉相关多肽相同功能的蛋白也包括在本发明内。

应理解，虽然本发明的抗性淀粉相关多肽优选获自木薯，但是获自其它植物的与木薯抗性淀粉相关多肽高度同源(如具有80％以上、90％以上、95％以上、甚至98％以上序列相同性)的其它多肽也在本发明考虑的范围之内。比对序列相同性的方法和工具也是本领域周知的，例如blast。

本发明还涉及编码本发明抗性淀粉相关多肽或其保守性变异多肽的多核苷酸序列。所述的多核苷酸可以是dna形式或rna形式。dna形式包括cdna、基因组dna或人工合成的dna。dna可以是单链的或是双链的。dna可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与seqidno:1所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有seqidno:2的蛋白质，但与seqidno:1所示的编码区序列有差别的核酸序列。

编码seqidno:2的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。

术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码所述多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。

基于本发明人的新发现，本发明还提供了一种改良薯类植物的方法，该方法包括抑制所述薯类植物中抗性淀粉相关多肽的表达或活性。

可以采用本领域人员熟知的多种方法来降低抗性淀粉相关多肽的表达或使之缺失表达，比如将携带反义基因的表达单位(比如表达载体或病毒等)递送到靶点上，使得细胞或植物组织不表达或降低表达抗性淀粉相关多肽；或者，通过基因敲除的手段来降低抗性淀粉相关多肽的表达。

作为本发明的一种实施方式，提供了一种降低植物中抗性淀粉相关多肽的表达的方法，所述的方法包括：

(1)将干扰抗性淀粉相关多肽的编码基因表达的干扰分子转入植物组织、器官或种子，获得转化入所述干扰分子的植物组织、器官或种子；和

(2)将步骤(1)获得的转入了所述干扰分子的植物组织、器官或种子再生成植物。

作为一种优选的实例，所述的方法包括步骤：

(i)提供携带可干扰基因表达的载体的农杆菌，所述的载体选自下组：

(a)含有反方向启动的抗性淀粉相关多肽的编码基因或基因片段(反义分子)的载体；

(b)含有可在植物体内形成特异性干扰抗性淀粉相关多肽的编码基因表达(或转录)的成分的干扰分子的载体；

(ii)将植物的组织或器官与步骤(i)中的农杆菌接触，从而使所述载体转入植物组织或器官。

较佳地，所述方法还包括：

(iii)选择出转入了所述载体的植物织或器官；和

(iv)将步骤(iii)中的植物组织或器官再生成植物。

基于抗性淀粉相关基因的核苷酸序列，可以设计出在导入植物体后可形成特异性干扰抗性淀粉相关基因表达的分子的多核苷酸。设计时要考虑到特异性以及干扰的效率。本发明对干扰分子的制备方法没有特别的限制，包括但不限于：化学合成法，体外转录法等。应理解，本领域技术人员在得知了抗性淀粉相关基因与植物抗性淀粉性状的相关性以后，可以以各种途径制备出所述的干扰分子，从而用于调节植物性状。所述的干扰分子可通过转基因技术被输送到植物体内，或还可采用本领域已知的多种技术被输送到植物体内。

作为本发明的特别优选的方式，提供了一种效果优异的干扰分子，所述的干扰分子可特异性的干扰抗性淀粉相关基因的表达；并且经验证，其具有良好的干扰抗性淀粉相关基因表达的效果。所述的干扰分子是含有seqidno:1中第548-741位所示的核苷酸序列的分子，构成发夹结构。

本发明还提供了一种干扰分子，所述干扰分子含有以下结构：seq正向为抗性淀粉相关基因片段，seq反向为与seq正向互补的多核苷酸；x为位于seq正向和seq反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与seq正向和seq反向不互补。

所述的干扰分子在导入到植物体内后，可折叠成稳定的茎环结构，茎环结构的茎部两侧包含基本上互补的两条序列。也即，形成如下所示的二级结构：

其中，||表示在seq正向和seq反向之间的基本上互补的关系。所述的茎环结构可被植物体内的各种物质进一步作用、加工或剪切，并且形成双链rna(dsrna)。

通常，所述的干扰分子位于表达载体上，因此，含有所述的干扰分子的表达载体也被包含在本发明中。

作为本发明的其它选择方式，通过敲除抗性淀粉相关多肽的编码基因，从而下调植物中抗性淀粉相关多肽的表达。较佳地，采用crispr/cas9系统进行基因编辑，从而敲除该抗性淀粉相关基因；合适的sgrna靶位点，会带来更高的基因编辑效率，所以在着手进行基因编辑前，设计并找到合适的靶位点较为重要。在设计特异性靶位点后，还需要进行体外细胞活性筛选，以获得有效的靶位点用于后续实验。或者，采用传统的同源重组的方法来敲除该抗性淀粉相关基因。

本发明还包括利用前述任一种方法获得的植物，所述的植物包括：转入了抗性淀粉相关基因或其同源基因的转基因植物；或者抗性淀粉相关多肽表达量(包括低表达或不表达)降低的植物等。

可采用任何适当的常规手段，包括试剂、温度、压力条件等来实施所述的方法。

此外，本发明还涉及利用抗性淀粉相关多肽或其编码基因作为一种基因转化植株后代的追踪标记。本发明还涉及利用抗性淀粉相关多肽或其编码基因作为一种分子标记，通过检测植物中抗性淀粉相关多肽的表达情况，鉴定植物的性状。还可利用抗性淀粉相关基因相关的植物特性作为杂交制种过程中真杂种的指示标记。

本发明的方法可以制备获得块中的抗性淀粉含量提高、直链淀粉含量提高的薯类植物，从而可实现从薯类植物中大量提取抗性淀粉的工艺。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如j.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1、抗性淀粉相关基因的克隆及序列分析

实验克隆得到的抗性淀粉相关基因开放阅读框(openreadingframe，orf)为2256bp，与genbank中已公布的序列存在一个核苷酸不同，对应编码的氨基酸完全一致，个别核苷酸的差异应该是由于基因克隆的木薯品种来源不同，genbank中公布的序列来源于kasetsartuniversity50(ku50)，而本实验克隆的基因来自tms60444。

根据初步功能验证，本发明人将该基因定义为抗性淀粉相关基因，其全长2256bp，编码751个氨基酸的多肽(称为抗性淀粉相关多肽)。

抗性淀粉相关基因序列(seqidno:1)：

atggcatttataggatcacttccttttattatccaaaccaaagcagaaagttctgtccttctccatgacaaaaacctacagcgatccagattctccgttttcccatgtagatcacaaaactcttttaatttagccgtttcgttatctttgagttttaagcctgtaagagctacaggtaaggaaggcgttagtggtgatgggtcagaggatacacttcaagccaccatcgagaaaagcaagaaagttctcgccttgcaaagggacctacttcagaagattgctgaaagaaggaaattggtttcttctatacaaagtagtgttggtgaccacgacacaaacaaaacttctcatgaacagagggaaaactctttgccaaattcagataatacttcaactagtgatgtgaatatgcaccaacagcaaaatggcccagttcttccgagtagctatgtccattcaactgcagatgaggtatcagaaactgcatcttcagctattaatagaggtcatgctaaagatgataaggaacttgaacaacatgcatctcctagaacagcctttgttaagaattctaccaaacagtttaaagagatggattctgagaaactacagacagatgagataccatcttttctttcaaacaccacagatatttccactataaatgaagaaaatagtgaacattcaaatgaatcaacctcacctatggttgacatttttgaaagtgattctatgactgaagacatgaagccacctcctttggctggggacaatgtcatgaatgttattttggtagctgcagaatgtgctccatggtccaaaacaggtggccttggtgatgtcgctggatctttaccaaaggctttggctcggcgtggacatcgggttatggttgtggcaccgcgatatggcaactatgttgaacctcaggatactggagtccgaaagaggtataaggtggatggtcaggattttgaagtatcatacttccaagccttcattgatggggttgattttgtattcattgacagtcctatgtttcgccacatagggaatgatatatatggaggaaacagaatggatatattaaagaggatggtattattttgcaaagctgctgttgaggttccttggcatgtcccatgtggtggagtctgctatggggatggaaatttggctttcattgcaaatgattggcatacagcattgttgccagtgtatctgaaggcatattatcgggataatggtttaatgcaatatacaagatctgttcttgtaattcataacatagctcaccagggtcggggtccagtggatgatttctcttacgtgggtctaccagaacattacattgatctcttcaaactgcatgatccgattggtggtgaccacttcaatatctttgcagctggtcttaaggtggcagatcgtgtggttactgttagtcatggatacgcctgggagcttaaaacatctgaaggtggttggggtctgcacaatatcataaatgagaacgactggaaattgcagggcattgttaatgggattgatgccaaagaatggaatccacagtttgatattcaactgacatcagatggttatactaactattccctggaaacacttgatactggcaagcctcagtgcaaggcagccttacagaaggagctcggtttgcccatccgtccagatgtccctgttattgggttcattggaaggttggattatcagaaaggtgtcgatctcatagctgaggcaattccctggatggtgggtcaggatgtgcaactagtaatgttgggtactggcagacaagacttggaagagatgcttagacaatttgaaaaccaacatagagataaagtgaggggatgggttggtttttctgtgaagacagctcacaggataactgctggtgcagatattttgctcatgccatcaagatttgaaccatgtgggctaaaccagttatatgctatgatgtacgggacgattcctgtagtacacgctgtgggtggactaagggacacggtgcaacctttcgatccatttaatgagtcggggcttgggtggacatttgatagcgctgaatcacataaactgatacatgcattaggcaattgcttgctcacttaccgagagtacaagaagagctgggaaggactgcagagaagagggatgactcaaaacctcagctgggaccatgctgctgagaaatatgaggagactcttgttgcagccaagtaccagtggtga

抗性淀粉相关多肽序列(seqidno:2)：

mafigslpfiiqtkaessvllhdknlqrsrfsvfpcrsqnsfnlavslslsfkpvratgkegvsgdgsedtlqatiekskkvlalqrdllqkiaerrklvssiqssvgdhdtnktsheqrenslpnsdntstsdvnmhqqqngpvlpssyvhstadevsetassainrghakddkeleqhasprtafvknstkqfkemdseklqtdeipsflsnttdistineensehsnestspmvdifesdsmtedmkppplagdnvmnvilvaaecapwsktgglgdvagslpkalarrghrvmvvaprygnyvepqdtgvrkrykvdgqdfevsyfqafidgvdfvfidspmfrhigndiyggnrmdilkrmvlfckaavevpwhvpcggvcygdgnlafiandwhtallpvylkayyrdnglmqytrsvlvihniahqgrgpvddfsyvglpehyidlfklhdpiggdhfnifaaglkvadrvvtvshgyawelktseggwglhniinendwklqgivngidakewnpqfdiqltsdgytnysletldtgkpqckaalqkelglpirpdvpvigfigrldyqkgvdliaeaipwmvgqdvqlvmlgtgrqdleemlrqfenqhrdkvrgwvgfsvktahritagadillmpsrfepcglnqlyammygtipvvhavgglrdtvqpfdpfnesglgwtfdsaeshklihalgnclltyreykksweglqrrgmtqnlswdhaaekyeetlvaakyqw

实施例2、抗性淀粉相关基因rnai载体的构建及转基因木薯的获得

本发明人首先通过选择抗性淀粉相关基因(manes.02g046900)基因特异性片段(sss2，548-741bp)，构建了特异性抑制抗性淀粉相关基因(ss2)表达的rnainterference(rnai)双元载体：ppcamv35s::ss2rnai。该双元载体的示意图如图1所示，其中，正向sss2与反向sss2以及intron形成发夹结构，用于在细胞内形成rnai有效的分子。

将构建好的载体转入农杆菌lba4404，再通过农杆菌侵染木薯脆性悬浮愈伤，侵染后的愈伤组织通过再生、筛选等过程得到阳性植株，将ppcamv35s::ss2rnai转基因木薯记作ss2rnai，缩写为ssc。

实施例3、抗性淀粉相关基因rnai转基因木薯的分子鉴定

通过农杆菌介导的木薯悬浮愈伤转化共获得ppcamv35s::ss2rnai阳性转基因木薯ssc-2、6、7、10、13等共20个株系，随后通过southernblot筛选最后获得单拷贝转基因植株为ssc-2、6、7、10、17、18共六个株系，如图2。

为了验证rnai干扰的效果，本发明人通过real-timepcr对单拷贝植株中抗性淀粉相关基因以及淀粉合成相关基因的表达水平进行分析。在大多数ppcamv35s::ss2rnai单拷贝转基因木薯中，抗性淀粉相关基因的表达量都被特异性下调，如图3。

此外，本发明人发现mesbe2基因转录水平的表达量显著上升，其他基因转录水平的表达量变化不一致。

以上结果说明，转基因木薯中抗性淀粉相关基因表达水平受到抑制，对淀粉合成过程中其他基因的转录水平具有一定的影响。

虽然目标基因在表达水平上受到了强烈的抑制，但在蛋白水平上是否也受到抑制，需要进一步的证明。本发明人针对抗性淀粉相关基因特异性的蛋白片段设计抗原多肽并成功获得了木薯抗性淀粉相关基因的兔源多克隆抗体。收获野生型木薯及抗性淀粉相关基因表达明显下调的三个单拷贝转基因木薯(ssc-2、ssc-6、ssc-7)发育阶段一致的成熟块根，提取总蛋白后，进一步通过westernblot检测抗性淀粉相关基因的蛋白量。结果如图4，表明：在野生型中有抗性淀粉相关基因的目的条带，大小约在78kd，与预测的抗性淀粉相关基因大小一致；在转基因植株ssc-2、6、7中并没有抗性淀粉相关基因的目的条带，说明通过rnai的手段，不仅降低了目的基因的表达水平，同时也成功降低了目的基因的蛋白量。

此外，本发明人发现所测定的其它一些淀粉合成相关基因的蛋白水平没有显著变化。

实施例4、抗性淀粉相关基因对块根储藏型淀粉中直链淀粉含量的调节

收获野生型木薯及抗性淀粉相关基因转基因木薯(ssc-2、ssc-6、ssc-7)发育阶段一致的成熟块根，烘干后参考抗性淀粉检测试剂盒(megazymeinternationalirelandltd.)测定各样品的抗性淀粉含量。

结果显示，与野生型木薯储藏型淀粉相比，在转基因植株块根中抗性淀粉的含量有非常明显的上升，野生型木薯块根中抗性淀粉含量约有5.8％，ss2-rnai转基因植株块根中抗性淀粉的含量上升到25-26％，如图5。

实施例5、抗性淀粉相关基因对块根储藏型淀粉中直链淀粉含量的调节

收获野生型木薯及抗性淀粉相关基因转基因木薯(ssc-2、ssc-6、ssc-7)发育阶段一致的成熟块根，提取储藏性淀粉参考中华人民共和国国家标准gb/t15683-2008/iso6647-1：2007测定各样品的直链淀粉含量。

结果显示，与野生型木薯储藏型淀粉相比，在转基因植株储藏型淀粉中直链淀粉的含量有非常明显的上升，野生型木薯储藏型淀粉中直链淀粉含量约有21％，ss2-rnai转基因植株储藏型淀粉中直链淀粉的含量上升到27-33％，如图6。

实施例6、抗性淀粉相关基因对块根储藏型淀粉中支链淀粉链长分布的调节

块根储藏型淀粉通过异淀粉酶(isoamylase)水解后，利用hpaec-pad分析其水解液中的葡聚糖成分。

分析结果显示，野生型块根储藏型淀粉中最短的葡聚糖链为dp6，在dp11-12及dp45处有两个峰，dp18-20处有一个肩峰。转基因植株块根储藏型淀粉与野生型相比，其短链(dp6-9)有明显的上升，最高可提高2.8％；中链部分(dp10-18)有明显的下降，约-0.76％左右；中长链部分(dp19-33)有明显上升，约0.19％左右；长链部分(dp>33)略有下降，约-0.15％；如图7。

实施例7、抗性淀粉相关基因对块根储藏型淀粉粘度性质的调节

直链淀粉含量与淀粉糊粘度性质特征密切相关，因此，本发明人使用快速粘度仪rapidviscoanalyzer(rva-4series，newportscientific，australia)分析淀粉粘度特征。

本发明人发现，与野生型相比，ss2-rnai转基因木薯块根储藏性淀粉的rva曲线发生了明显的变化，峰值粘度、热粘度和冷粘度显著低于野生型，说明随着淀粉中直链淀粉的增多，淀粉越难糊化。达到最高峰之后，不同于野生型由于淀粉粒破裂而造成的粘度曲线下降，如图8，高直链淀粉ssc-2、ssc-6和ssc-7的糊化曲线则表现出继续上扬的特征。

实施例8、抗性淀粉相关基因对块根储藏型淀粉热力学性质的调节

差示热值扫描(differentialscanningcalorimetry，dsc)是测定在加热过程中淀粉的吸热能力的一种热力学手段，淀粉的吸热能力主要受到淀粉直链淀粉含量、淀粉结晶度、支链淀粉链长分布等方面的影响，ss2-rnai转基因植株中，块根储藏型淀粉to、tp、tc和δh与野生型块根储藏型淀粉相比明显降低，其中δh要比野生型降低两到三倍左右。

表1野生型及转基因木薯块根储藏型淀粉的热力学性质参数

注：表中所示数据均为3次实验重复的平均值±标准差。*表示在此条件下各测定值之间差异显著(p<0.05)；**表示在此条件下各测定值之间差异极显著(p<0.01)。

实施例9、抗性淀粉相关基因对块根储藏型淀粉结构的调节

淀粉xrd衍射图谱可以分为a、b、c、v型淀粉，一般认为淀粉的xrd衍射图谱由结晶区的衍射峰及非结晶区的背景峰组成。木薯野生型淀粉表现出了典型的a型(在2θ＝15.2°、17.0°、23.6°附近有明显衍射峰，且17.0°为双峰)衍射特征。如图9，与野生型相比，ss2-rnai木薯块根储藏型淀粉17°的衍射双峰变成单峰，并且其15°与23°的衍射峰强度明显下降，结晶度降低。由于其17°衍射峰变化为单峰，属于b型衍射结构特征，因此可认为当直链淀粉含量升高时，晶型结构出现由a型转向b型的变化。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110>中国科学院上海生命科学研究院

<120>一种提高薯类块根抗性淀粉含量的方法及应用

<130>172364

<160>2

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>2256

<212>dna

<213>木薯

<400>1

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