一种用于合成谷胱甘肽的重组菌及谷胱甘肽的合成方法与流程

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种用于合成谷胱甘肽的重组菌及谷胱甘肽的合成方法。

背景技术

谷胱甘肽(γ-l-glutamyl-cysteinyl-glycine，gsh)是由l-谷氨酸、l-半胱氨酸和甘氨酸三种氨基酸缩合得到的一种小分子多肽，其广泛存在于各种生物体内，是微生物及植物生物细胞内最主要含巯基的小分子肽。谷胱甘肽是体内一种重要的抗氧化剂。还原型的谷胱甘肽在活组织中具有许多重要的功能，在肝损伤、眼部疾病、物质代谢，调节细胞凋亡等方面发挥着重要的作用。此外，其在食品保鲜领域也发挥这同样重要的作用，因此国内外医药市场、食品，化妆品领域对于谷胱甘肽的需求也在稳步提升。

近年来，随着技术的提升，生产谷胱甘肽的方法也日趋增多，但主要还是以微生物发酵法、化学合成法、溶剂萃取法和酶催化合成法。化学合成的操作步骤复杂，成本高，酶催化合成法的不稳定因素较多，溶剂萃取法的生产效率较低。相对而言，微生物发酵法具有低成本，反应条件温和，生产效率高的优势而逐渐成为了生产谷胱甘肽的主要方法。

微生物发酵法是通过向微生物中导入过表达的重组质粒，用以过表达合成谷胱甘肽的酶，从而实现了谷胱甘肽的大量生产。其生产方式简单，只需要在反应体系中加入三种氨基酸后，就能实现氨基酸向谷胱甘肽转化。

近年来，随着基因工程及分子生物学的发展，研究者们逐渐发现了一些双功能酶基因，这些基因能够高产谷胱甘肽但又可以无视谷胱甘肽反馈抑制作用。另外，还有研究发现了一些能够降解谷胱甘肽的基因。因此，利用分子生物学技术将这些基因组合起来就可以实现谷胱甘肽的大量生产。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是提供一种能够高效合成谷胱甘肽的重组菌及谷胱甘肽的合成方法。

为解决以上技术问题，本发明采取如下技术方案：

本发明的一个目的是提供一种含有双功能谷胱甘肽合成基因的重组质粒，所述的重组质粒包括gs片段和载体片段；所述的载体片段为pet-22b。

优选地，所述的gs片段位于所述的载体片段的t7启动子之下。

优选地，所述的gs片段的dna序列与seqidno.1所示序列至少具有80％的同源性，进一步优选为具有85％以上的同源性，更优选为具有90％以上的同源性，再优选为具有95％以上的同源性，最优选为seqidno.1所示序列。

优选地，所述的重组质粒还包括抗性基因片段，用以筛选重组菌。

进一步优选地，所述的抗性基因片段为氨苄青霉素抗性基因片段。

本发明的另一个目的是提供一种所述的含有双功能谷胱甘肽合成基因的重组质粒的制备方法，包括如下步骤：

a)pcr扩增获得gs片段；

b)将所述的gs片段克隆入pet-22b中，得到所述的重组质粒。

优选地，步骤a)中，利用pcr技术从pmd19-t-gs中扩增获得gs片段。

优选地，步骤a)中，用以进行pcr扩增的引物为：gs-f：cagccggcgatggccatggatatgatcatcgatcgtctgc；gs-r：tggtggtggtggtgctcgagcggaaacagttttgccagaa。

本发明的第三个目的是提供一种用于合成谷胱甘肽的重组菌，所述的重组菌包括所述的重组质粒和累积谷胱甘肽的基因缺陷型菌株。

优选地，所述的累积谷胱甘肽的基因缺陷型菌株为敲除三肽酶基因pept的大肠杆菌。

进一步优选地，所述大肠杆菌为e.colibl21(de3)。

进一步优选地，所述的敲除三肽酶基因pept的大肠杆菌的制备方法包括以下步骤：

a)利用pcr技术从pkd3质粒中扩增获得氯霉素基因片段；

b)将所述的氯霉素基因片段电转入大肠杆菌bl21(de3)中，用以置换pept基因；

c)消除氯霉素基因以实现pept基因的敲除。

本发明的第四个目的是提供一种所述的重组菌的制备方法，将所述的重组质粒转化入所述的累积谷胱甘肽的基因缺陷型菌株，得到所述的重组菌。

本发明的第五个目的是提供一种谷胱甘肽的合成方法，通过对所述的重组菌进行培养，得到所述的谷胱甘肽。

优选地，所述的培养的温度为25～35℃，ph为3～7，诱导剂的浓度为0.1～1mmol/l。

进一步优选地，所述的培养的温度为28～32℃，ph为4～6，诱导剂的浓度为0.4～0.6mmol/l。

进一步优选地，所述的诱导剂为iptg。

优选地，所述的合成方法的具体步骤为：将所述的重组菌接种于培养基中，并加入氨苄青霉素，在35～40℃培养8～12小时，然后接种至培养基中，并加入诱导剂，调节ph为3～7，在25～35℃下进行摇瓶培养，得到所述的谷胱甘肽。

由于以上技术方案的实施，本发明与现有技术相比具有如下优点：

本发明的重组菌既能够高效表达谷胱甘肽，又能够减少谷胱甘肽的降解，从而使得合成谷胱甘肽的效率提高，生产成本和能耗降低。

附图说明

图1是pmd19-t-gs质粒图谱的示意图。

图2是pet-22b-gs质粒图谱示意图，gs位于t7强启动子下。

图3是pcr扩增获gs的检测结果，其中泳道1为gspcr扩增产物，m是蛋白标准分子量。

图4是pept基因敲除pcr鉴定结果，其中泳道1为δpept的pcr扩增产物,泳道2为pept的pcr扩增产物，m是蛋白标准分子量。

图5是gs基因蛋白表达的sds-page结果，其中3泳道为gs蛋白，1泳道为未加诱导剂，2泳道为de3诱导后蛋白，m是蛋白标准分子量。

图6是谷胱甘肽工程菌不同温度下谷胱甘肽产量结果。

图7是谷胱甘肽工程菌不同iptg浓度下谷胱甘肽产量结果。

图8是谷胱甘肽工程菌不同ph下谷胱甘肽产量结果。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。

以下实施例中为注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如《分子克隆：实验室手册》(newyork:coldspringharborlaboratorypress，1989)中所述的条件或厂商提供的方案进行。

在本发明的下述实施例中，使用的胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒均购自生工生物公司。

在本发明的下述实施例中，使用的clonexpressⅱ，turbo保真酶来自南京诺唯赞生物科技有限公司。ncoi，xhoi，dnamarker，均购自takara公司。

在本发明的下述实施例中，使用的表达载体pet-22b，菌种e.colibl21(de3)、e.colidh5α，为中国药科大学生命中心实验室保存,其中菌种e.colibl21(de3)的atcc编号为baa-1025tm。

在本发明的下述实施例中，使用的e.colibl21(de3)感受态细胞、e.colidh5α感受态细胞，按照invitrogen公司pichiaexpressionkit手册中提供的方法进行。

在本发明的下述实施例中，使用的lb液体培养基的配方为：1％胰蛋白栋，0.5％酵母浸粉，1％nacl；使用的摇瓶发酵培养基的配方为：1％胰蛋白栋，0.5％酵母浸粉，1％nacl。配置固体lb平板培养基时，按照上述配方添加2％琼脂粉。

在本发明的下述实施例中，感受态细胞的制备和转化，按照《分子克隆：实验室手册》提供的方法进行。

实施例1pet-22b-gs表达质粒的构建

1.1引物设计

根据ncbi报道的gs序列，设计以下2条引物用以扩增gs基因：

gs-f：cagccggcgatggccatggatatgatcatcgatcgtctgc(seqidno.3)

gs-r：tggtggtggtggtgctcgagcggaaacagttttgccagaa(seqidno.4)

其中gs-f和gs-r用于扩增gs编码区；在gs-f上引入ncoi酶切位点，在gs-r上引入xhoi酶切位点。其中gs-f和gs-r与pet-22b同源的部分用于将gs基因克隆到pet-22b载体上，所用的试剂盒为clonexpressⅱ。

1.2pcr扩增gs序列

利用生工质粒提取试剂盒对大肠杆菌dh5α抽提得到pmd19-t-gs载体。

以pmd19-t-gs载体为模板，以步骤1.1中设计的gs-f和gs-r为引物对，进行pcr扩增，具体如下：

扩增gs的反应体系为：turbo保真酶50μl，上下游引物(10μm)各4μl，加入去离子水40μl，1μl的pmd19-t-gs至体系总体积为100μl。

扩增反应条件为：95℃4min；95℃30s，55℃30s，72℃1min，34个循环；72℃10min；4°∞，30个循环。

pcr扩增产物进行凝胶电泳检测，检测结果如图3所示。获得的产物的大小约为2247bp，与gs预期产物大小相似。

1.3表达载体的构建

1.3.1对步骤1.2pcr扩增后得到的pmd19-t-gs酶切

选择ncoi和xhoi两个限制酶，对步骤1.2pcr扩增后得到的pmd19-t-gs进行酶切，反应体系如下：ncoi2ul；xhoi2ul；pmd19-t-gs1μg；10×kbuffer10ul；加水至100ul。37℃水浴酶切1小时。对酶切产物进行胶回收得到gs片段，用以随后的克隆。该gs片段的dna序列如seqidno.1所示，氨基酸序列如seqidno.2所示。

1.3.2gs基因构建在pet-22b上

于低温冰水浴中配置如下所示反应体系5×ceⅱbuffer4μl；ⅱ2μl；pet-22b线性载体50ng；gs片段200ng；加水至20μl。配置中如果有液体粘黏管壁的情况，可通过短暂离心的方法处理。

体系配置完成后，用移液枪反复上下轻轻吹打，重复步骤直至混匀各部分，操作的时候避免产生气泡。置于37℃环境下反应30min。反应完成时，立即将反应管置于冷水浴中低温冷却，所得产物片段置于-20℃环境中保存，用于后续试验。

将连接产物分别转化入宿主菌e.colide3，并涂布含氨苄青霉素的固体lb平板，37℃培养至转化子长出。挑取阳性的转化子鉴定，根据鉴定结果，最终获得pet-22b-gs重组质粒，其质粒图谱如图2所示，检测结果如图5。

实施例2pept基因敲除菌株的构建

2.1引物设计

敲除pept基因共需4条引物，用于同源重组的引物s1、s2及用于鉴定缺陷株的引物s3、s4。

s1：atggataaactacttgagcgatttttgaactacgtgtctctggatacccagtgtaggctggagctgc(seqidno.5)

s2：ttacttccgttgcgccgttaactcggcaatacggacgatcacctgcaccgatgggaattagccatgg(seqidno.6)

s3：atggataaactacttgagcg(seqidno.7)

s4：ttacttccgttgcgccgtta(seqidno.8)

2.2基因缺陷株δpept的构建

同源重组辅助质粒pkd46转入宿主菌e.colibl21(de3)，l-阿拉伯糖诱导后制备电转化感受态细胞。

以含氯霉素抗性基因cm的质粒pkd3为模板,s1、s2为引物进行pcr扩增反应。

于冰上将2μl抗性片段pkd3-cm加入电转化感受态细胞，混匀后置于1mm电击杯中进行电击转化。电击参数为：2.5kv，脉冲3ms。电击完成后立即加入无抗性lb液体培养基,于37℃培养3h,使接入抗性片段的细胞充分复苏。然后取菌液涂布至含cm的lb平板,筛选出含抗性基因的缺陷株阳性克隆。将阳性单克隆分别接入含cm及amp的培养基中，42℃培养4-5h，筛选出在cm中正常生长，在amp中不能生长的菌种，即为重组成功的菌株δpept-cm。

将编码flp重组酶的质粒pcp20化学转化到菌株δpept-cm中，30℃培养后涂布氨苄抗性平板并筛选出转化子，然后转接到不含抗生素的lb液体培养基中42℃过夜培养。在消除cm的同时，对温度敏感的质粒pkd46、pcp20在高温下会逐渐丢失。消除质粒的菌株为基因缺陷株阳性克隆。

将阳性单克隆分别接入含cm及amp的培养基中，42℃培养4-5h，筛选出在cm和amp中都不能生长的菌种，该菌种即为完成敲除目的基因的菌种。为进一步查看抗性基因cm的去除情况，以阳性单克隆为模板,s3、s4为引物进行pcr扩增鉴定，凝胶电泳检测结果如图4所示，pcr产物(即泳道1)长度为130bp,对照野生株pcr产物(即泳道2)为1201bp,二者差异显著,证明基因缺陷株δpept构建成功。

实施例3表达质粒转化合成谷胱甘肽菌株

将实施例1制得的pet-22b-gs重组质粒转化到实施例2制得的基因缺陷株δpept，并涂布同时含有氨苄青霉素的固体lb平板，37℃培养至转化子长出。其中基因缺陷株δpept是氨苄青霉素抗性菌株，不能在含有氨苄青霉素的固体lb平板上生长，因此，平板上长出的转化子均为转化了pet-22b-gs质粒的大肠杆菌。将该菌株命名为δpept-22b-gs，即为重组菌，按体积比1:1加40％甘油保存菌种。

实施例4δpept-22b-gs摇瓶发酵生产谷胱甘肽

将δpept-22b-gs甘油菌以体积百分比为1％接种于lb液体培养基中，加入占lb液体培养基千分之一体积的氨苄青霉素，于37℃培养过夜。取10ml接种至2.5l含有1l培养基的摇瓶中，加入诱导剂iptg至诱导剂浓度为0.8mm，调节ph为4，分别控制培养温度为16℃、25℃、30℃进行摇瓶培养，进行平行实验，并于培养的2、4、6、8、10小时取样，利用四氧嘧啶法检测检测发酵产物中谷胱甘肽的累积量，检测结果见图6，从图6可知，最佳培养温度为30℃。

实施例5δpept-22b-gs摇瓶发酵生产谷胱甘肽

将δpept-22b-gs甘油菌以体积百分比为1％接种于lb液体培养基中，加入占lb液体培养基千分之一体积的氨苄青霉素，于37℃培养过夜。取10ml接种至2.5l含有1l培养基的摇瓶中，加入诱导剂iptg至诱导剂浓度分别为0.1mm、0.5mm、1mm，调节ph为4，控制培养温度为30℃进行摇瓶培养，进行平行实验，并于培养的2、4、6、8、10小时取样，利用四氧嘧啶法检测检测发酵产物中谷胱甘肽的累积量，检测结果见图7，从图7可知，最佳诱导剂浓度为0.5mm。

实施例6δpept-22b-gs摇瓶发酵生产谷胱甘肽

将δpept-22b-gs甘油菌以体积百分比为1％接种于lb液体培养基中，加入占lb液体培养基千分之一体积的氨苄青霉素，于37℃培养过夜。取10ml接种至2.5l含有1l培养基的摇瓶中，加入诱导剂iptg至诱导剂浓度为0.5mm，调节ph分别为3、5、7，控制培养温度为30℃进行摇瓶培养，进行平行实验，并于培养的2、4、6、8、10小时取样，利用四氧嘧啶法检测检测发酵产物中谷胱甘肽的累积量，检测结果见图8，从图8可知，最佳ph为5。

以上对本发明做了详尽的描述，其目的在于让熟悉此领域技术的人士能够了解本发明的内容并加以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，凡根据本发明的精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。

序列表

<110>张家港市华天药业有限公司

<120>一种用于合成谷胱甘肽的重组菌及谷胱甘肽的合成方法

<141>2018-07-27

<160>8

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>2247

<212>dna

<213>人工序列(rengongxulie)

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