本发明涉及一种纯化
技术领域：
，且特别涉及一种细胞色素c及其内毒素的去除方法。
背景技术：
：细胞色素是各种生物体中都很常见的蛋白质，它是一类含有铁卟啉基团的电子传递蛋白，只存在于缺氧细胞中，广泛存在于真核生物的线粒体内膜和内质网中，植物的叶绿体中，以及光合成微生物和细菌中。细胞色素在线粒体内膜上起传递电子的作用。细胞色素c是细胞色素中的一种，它在线粒体呼吸链上位于细胞色素b和细胞色素氧化酶之间，是呼吸链的一种重要的组成部分。每分子细胞色素c含有一个血红素和一条多肽链，细胞色素c是一种稳定的可溶性蛋白，它易溶于水及酸性溶液。在酶存在的情况下，细胞色素c对组织的氧化、还原有迅速的酶促作用。通常外源性细胞色素c不能进入健康细胞，但在缺氧时，细胞膜的通透性增加，细胞色素c可用于组织缺氧的急救和辅助用药，如一氧化碳中毒、催眠药中毒、新生儿窒息、严重休克缺氧、麻醉及肺部疾病引起的呼吸困难、高山缺氧、脑缺氧、心脏病引起的缺氧等。然而，细胞色素c中的内毒素存在制约着细胞色素c的应用。内毒素是革兰氏阴性细菌细胞壁中的一种成分，叫做脂多糖。脂多糖对宿主是有毒性的。内毒素只有当细菌死亡溶解或用人工方法破坏菌细胞后才释放出来，所以叫做内毒素。其毒性成分主要为类脂质a。内毒素位于细胞壁的最外层、覆盖于细胞壁的黏肽上。各种细菌的内毒素的毒性作用较弱，大致相同，可引起发热、微循环障碍、内毒素休克及播散性血管内凝血等。内毒素耐热而稳定，抗原性弱。目前，去除细胞色素c中内毒素的方法，操作过程复杂，费时费力，内毒素合格率低。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种细胞色素c中内毒素的去除方法，此方法制备的细胞色素c内毒素的合格率高，且制备过程简单，分离效果好，重复性高，样品回收率高，分离条件温和，具有较高的工业推广前景。本发明的另一目的在于提供一种细胞色素c，通过此细胞色素c中内毒素的去除方法去除内毒素后制得，此细胞色素c纯度与安全性更高。本发明解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。本发明提出一种细胞色素c中内毒素的去除方法，其包括：将阴离子树脂置入层析柱内；用缓冲液平衡层析柱使得流出液的ph值和电导率与上柱的缓冲液的ph值和电导率一致；调节内毒素不合格的细胞色素c的精品溶液的ph值和电导率至与缓冲液的ph值和电导率一致后过滤得到澄清的上样液；将上样液过柱后得到流穿液。将收集到的流穿液依次进行透析以及过滤。本发明提出一种细胞色素c，通过上述的细胞色素c中内毒素的去除方法去除内毒素后制得。本发明实施例的一种细胞色素c及其内毒素的去除方法的有益效果是：本发明提供的细胞色素c主要通过阴离子树脂层析技术去除内毒素后制得，层析技术的优点主要通过以下几方面进行体现：1)层析操作简单，只需将阴离子树脂装入层析柱后再用缓冲液进行过柱处理就能制得，相比现有技术的制备方法，此制备方法更加的简单便捷。2)层析的设备简单，仅仅需要一根层析柱就能进行。3)层析的分离效果好，通过缓冲液过柱、上样液的过柱以及洗脱作业能使得内毒素被吸附在阴离子树脂上，从而有效地去除了细胞色素c中的内毒素，提高细胞色素c的纯度。4)层析的重复性高，样品的回收率高，层析是在层析柱中进行的，此层析柱经过消毒杀菌后能多次重复利用。并且，层析柱为作业主要进行的场所，经过层析柱后的样品均能被回收，因此样品的回收率得到提高。5)层析的分离条件温和，大多都在中性条件下进行的。6)层析所得产品回收率达96％以上。具体实施方式为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。下面对本发明实施例的一种细胞色素c及其内毒素的去除方法进行具体说明。一种细胞色素c中内毒素的去除方法，其包括：将阴离子树脂置入层析柱内；用缓冲液平衡层析柱使得流出液的ph值和电导率与上柱的缓冲液的ph值和电导率一致；调节内毒素不合格的细胞色素c的精品溶液的ph值至与缓冲液的ph值一致后过滤得到澄清的上样液；将上样液过柱后得到流穿液；将收集到的流穿液依次进行透析以及过滤。具体地，将阴离子树脂置入层析柱内。其中，阴离子树脂又称为阴离子交换树脂是在分子中含有碱性基团的离子交换树脂。在水或极性溶剂中能溶胀，在水中具有碱性，能以其氢氧根离子或非金属离子交换溶液中的阴离子。含有氢氧根离子的树脂，根据电离常数的大小，可分为强碱性、中等碱性和弱碱性三类。强碱性阴离子交换树脂，主要是分子中含有季铵基-n(ch3)3oh的树脂。弱碱性阴离子交换树脂，有间苯二胺-甲醛树脂、三聚氰胺-胍·甲醛树脂等。在本发明的实施例中，阴离子树脂包括qxl以及deae中的任一种。qxl以及deae均可以作为此方法中的阴离子树脂。当然，在本发明的其他实施例中，阴离子树脂还可以选择为其他种类，例如可以为间苯二胺-甲醛树脂以及三聚氰胺-胍·甲醛树脂中的任一种。间苯二胺-甲醛树脂以及三聚氰胺-胍·甲醛树脂均呈现弱碱性，能减小对细胞色素c中其他蛋白的损伤性。当然，在本发明的其他实施例中，在装柱前可以对阴离子树脂进行溶胀，溶胀是高分子聚合物在溶剂中体积发生膨胀的现象。聚合物溶解时先经过吸收溶剂从而使聚合物膨胀的过程。聚合物溶解时先溶胀的原因是：1.聚合物蜷曲的形状能提供溶剂分子扩散进去的空间；2.溶剂分子较小，扩散速度较快，在聚合物扩散至溶剂中引起它溶解之前，溶剂分子已扩散到聚合物分子间引起它的溶胀。并且，溶剂可以选择为乙醇，乙醇较为环保，残留在聚合物上的乙醇可挥发，不会带入多于的杂质。其中，层析柱是层析技术中的主体，一般用玻璃管或有机玻璃管。将阴离子树脂置入层析柱内的过程称为装柱，装柱是一次性置入柱内，一次性置入避免了柱内产生气体或断层。当然，在本发明的其他实施例中，装柱的具体步骤可以根据需求进行调整，本发明不做限定。在本发明的实施例中，层析柱的柱比为25～100:1，在此柱比下，细胞色素c中分子量相差不大的大分子物质可以得到有效地分离，从而有效地去除内毒素。当然，在本发明的其他实施例中，柱比可以根据需求进行调整，本发明不做限定。具体地，用缓冲液平衡层析柱使得上样液的ph值和电导率与上柱的缓冲液的ph值和电导率一致。其中，缓冲液是使得层析柱内介质的保持物理与化学平衡的一类物质。在本发明的实施例中，缓冲液包括pbs冲液、tris缓冲液、hepes缓冲液、tes缓冲液以及mops缓冲液中的任一种。pbs缓冲液是常用的用于生物学研究的一个缓冲溶液。有助于保持恒定的ph值和电导率。tris缓冲液中的tris为弱碱，在25℃下，它的pka为8.1；根据缓冲理论，tris缓冲液的有效缓冲范围在ph为7.0到9.2之间，tris缓冲液能有效地维持层析柱内的ph值和电导率。mops缓冲液是一类生物缓冲剂，有助于保持恒定的ph值和电导率。其中，利用缓冲液平衡层析柱至少需要3～5个柱体积，柱体积为树脂桩柱后，从柱的底板到树脂沉积表面的体积。经过3～5个柱体积的缓冲液平衡至基线变得平稳，并且流出液的ph值和电导率与上柱的缓冲液的ph值和电导率一致。当然，在本发明的其他实施例中，缓冲液的用量可以根据具体情况进行相应地调整，本发明不做限定。具体地，调节内毒素不合格的细胞色素c的精品溶液的ph值至与缓冲液的ph值一致后过滤得到澄清的流穿液。本发明的实施例中，采用浓度为0.1～0.2m的盐酸进行ph的调节，此浓度的盐酸调节ph的效率高，且对蛋白质的损伤较小。细胞色素c的精品溶液与缓冲液的ph一致，标志着精品溶液的ph与阴离子树脂的ph相同，这样上样液进行过柱时，细胞色素c中的内毒素的分离的效果更好。当然，在本发明的其他实施例中，盐酸的浓度可以根据需求进行调整，并且调节ph的试剂也可以根据需求进行选择，例如可以选择为醋酸等，本发明不做限定。其中，澄清的上样液通过滤孔尺寸为0.2～0.53μm的第一滤膜过滤得到。滤膜是处理溶液中溶质的分离和增浓，也常用于胶状悬浮液的分离，其应用领域在不断扩大。在膜的一侧施以适当压力，就能筛出小于孔径的溶质分子，以分离分子量大于500道尔顿(原子质量单位)、粒径大于10纳米的颗粒。经过滤膜过滤后的上样液中的大颗粒杂质被过滤掉，间接地提高了细胞色素c的精品溶液的纯度。当然，在本发明的其他实施例中，滤孔的尺寸可以根据需求进行调整，本发明不做限定。具体地，将上样液过柱后得到流穿液。经过上样过程后，细胞色素c的内毒素被稳定地吸附在阴离子树脂上，流穿液则为去除了内毒素后的细胞色素c。作为优选的方案，上样液以2～4ml/min的速度匀速过柱，流速低，洗脱峰窄，从而增加了分辨率。当然，在本发明的其他实施例中，流速也可以根据需求进行选择，本发明不做限定。匀速过柱可减小层析柱内气泡以及断层的产生。具体地，将收集到的流穿液依次进行透析以及过滤。其中，流穿液用5kd膜透析至溶液电导率小于500μs。5kd膜的截流率小，截流的的效果更好，当溶液的电导率小于500μs时，标志着溶液当中的杂质离子被去除干净，从而保证了纯化的效果。其中，过滤是通过滤孔尺寸为0.2～0.3μm的第二滤膜进行的。采用比第一滤膜的滤孔尺寸更小的第二滤膜能有效地去除第一滤膜未去除的杂质，提高分离效果与纯化度。进一步地，在本发明的较佳实施例中，细胞色素c中内毒素的去除方法还包括在用缓冲液平衡层析柱之前用0.1～2.0m的naoh溶液以2～4ml/min的流速冲洗放入层析柱内的阴离子树脂4～24h后，再以2～4ml/min的流速用注射用水洗涤至层析柱内的ph为7～8。此步骤主要是对阴离子树脂的处理，一方面使得树脂的层析分离效果更加好，另一方面减小了上样液的负担，减小了ph对于分离提纯的影响。其中，注射用水指符合中国药典注射用水项下规定的水。注射用水以2～4ml/min的速度过柱，流速低，洗脱峰窄，进一步增加了分辨率。为蒸馏水或去离子经蒸馏所得的水，故又称重蒸馏水。注射用水能有效控制微生物污染且同时控制细菌内毒素的水平。进一步地，在本发明的较佳实施例中，细胞色素c中内毒素的去除方法还包括在将上样液过柱后得到流穿液之后，用缓冲液对上样液匀速过柱后的层析柱进行洗涤，并对洗涤液依次进行透析以及过滤。此步骤采用缓冲液过柱，可以洗脱粘附在介质上的细胞色素c，避免细胞色素c的浪费，相应地提高了产品率。作为优选地方案，洗涤液可以与流穿液混合后同时进行透析以及过滤，这样设计可以减少器材的使用，节约成本。当然，在本发明的其他实施例中，细胞色素c的精制方法还可以包括其他步骤，例如将过滤后得到的流穿液进行冷冻以及干燥处理等。进行冷冻干燥处理能进一步地抑制细菌增长与繁殖，便于除去内毒素后的精品的细胞色素c的保存与工业化利用。一种细胞色素c，通过上述的细胞色素c中内毒素的去除方法去除内毒素后制得。以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。实施例1本实施例提供了一种细胞色素c，通过以下方法去除内毒素后制得：将qxl置入层析柱内；用pbs缓冲液平衡层析柱使得流出液的ph值和电导率与上柱的缓冲液的ph值和电导率一致；用0.1m盐酸调节内毒素不合格的细胞色素c的精品溶液的ph至与缓冲液的ph值一致后用滤孔尺寸为0.3～0.5μm的第一滤膜过滤得到澄清的上样液；将上样液以2ml/min的速度匀速过柱后得到流穿液；将收集到的流穿液依次进行透析以及过滤，透析是用5kd膜透析至溶液电导率为500μs。过滤是通过滤孔尺寸为0.2μm的第二滤膜进行的。实施例2本实施例提供了一种细胞色素c，与实施例1提供的细胞色素c的区别在于，本实施例提供的细胞色素c通过以下方法去除内毒素后制得：将deae置入层析柱内；用tris缓冲液平衡层析柱使得流出液的ph值和电导率与上柱的缓冲液的ph值和电导率一致；用0.15m盐酸调节细胞色素c的精品溶液的ph至与缓冲液的ph值一致后用滤孔尺寸为0.45μm的第一滤膜过滤得到澄清的上样液；将上样液以3ml/min的速度匀速过柱得到流穿液；将收集到的流穿液依次进行透析以及过滤，透析是用5kd膜透析至溶液电导率为480μs。过滤是通过滤孔尺寸为0.22μm的第二滤膜进行的。实施例3本实施例提供了一种细胞色素c，与实施例1提供的细胞色素c的区别在于，本实施例提供的细胞色素c通过以下方法去除内毒素后制得：将间苯二胺-甲醛树脂置入层析柱内；用tris缓冲液平衡层析柱使得流出液的ph值和电导率与上柱的缓冲液的ph值和电导率一致；用0.2m盐酸调节细胞色素c的精品溶液的ph至与缓冲液的ph值一致后用滤孔尺寸为0.5μm的第一滤膜过滤得到澄清的上样液；将上样液以4ml/min的速度匀速过柱得到流穿液；将收集到的流穿液依次进行透析以及过滤，透析是用5kd膜透析至溶液电导率为470μs。过滤是通过滤孔尺寸为0.3μm的第二滤膜进行的。实施例4本实施例提供了一种细胞色素c，与实施例1提供的细胞色素c的区别在于，本实施例提供的细胞色素c通过以下方法去除内毒素后制得：将三聚氰胺-胍·甲醛树脂置入层析柱内；用0.1m的naoh溶液以2ml/min的流速冲洗放入层析柱内的三聚氰胺-胍·甲醛树脂4h后，再以2ml/min的流速用注射用水洗涤至层析柱内的ph为7。用tris缓冲液平衡层析柱使得流出液的ph值和电导率与上柱的缓冲液的ph值和电导率一致；用0.1m盐酸调节细胞色素c的精品溶液的ph至与缓冲液的ph值一致后用滤孔尺寸为0.45μm的第一滤膜过滤得到澄清的上样液；将上样液以2ml/min的速度匀速过柱得到流穿液；将收集到的流穿液依次进行透析以及过滤，透析是用5kd膜透析至溶液电导率为460μs。过滤是通过滤孔尺寸为0.22μm的第二滤膜进行的。实施例5本实施例提供了一种细胞色素c，与实施例1提供的细胞色素c的区别在于，本实施例提供的细胞色素c通过以下方法去除内毒素后制得：将三聚氰胺-胍·甲醛树脂置入层析柱内；用0.15m的naoh溶液以3ml/min的流速冲洗放入层析柱内的三聚氰胺-胍·甲醛树脂10h后，再以3ml/min的流速用注射用水洗涤至层析柱内的ph为7.5。用tris缓冲液平衡层析柱使得流出液的ph值和电导率与上柱的缓冲液的ph值和电导率一致；用0.1m盐酸调节细胞色素c的精品溶液的ph至与缓冲液的ph值一致后用滤孔尺寸为0.45μm的第一滤膜过滤得到澄清的上样液；将上样液以2ml/min的速度匀速过柱得到流穿液；用tris缓冲液过柱洗涤残留的细胞色素c并得到洗涤液，将洗涤液与流穿液混合。将收集到的混合液依次进行透析以及过滤，透析是用5kd膜透析至溶液电导率为455μs。过滤是通过滤孔尺寸为0.22μm的第二滤膜进行的。实施例6本实施例提供了一种细胞色素c，与实施例1提供的细胞色素c的区别在于，本实施例提供的细胞色素c通过以下方法去除内毒素后制得：将三聚氰胺-胍·甲醛树脂置入层析柱内；用0.2m的naoh溶液以4ml/min的流速冲洗放入层析柱内的三聚氰胺-胍·甲醛树脂24h后，再以4ml/min的流速用注射用水洗涤至层析柱内的ph为8。用tris缓冲液平衡层析柱使得流出液的ph值和电导率与上柱的缓冲液的ph值和电导率一致；用0.1m盐酸调节细胞色素c的精品溶液的ph至与缓冲液的ph值一致后用尺寸为滤孔0.45μm的第一滤膜过滤得到澄清的上样液；将上样液以2ml/min的速度匀速过柱得到流穿液；用tris缓冲液过柱洗涤残留的细胞色素c并得到洗涤液，将洗涤液与流穿液混合。将收集到的混合液依次进行透析以及过滤，透析是用5kd膜透析至溶液电导率为450μs。过滤是通过滤孔尺寸为0.22μm的第二滤膜进行的。实验例1将实施例1～6所制备的细胞色素c各取十份，利用鲎试剂进行内毒素合格测试，此测试利用鲎试剂与内毒素产生凝胶反应的特点，测试结果如表1所示。表1.测试结果编号试剂最终状态实施例1十份均为阴性实施例2十份均为阴性实施例3十份均为阴性实施例4十份均为阴性实施例5十份均为阴性实施例6十份均为阴性根据表1所示的数据可知，本发明的实施例提供的精制后的细胞色素c的内毒素含量均完全合格。由此可知，通过本发明实施例提供的精制方法，可以有效地去除细胞色素c中的内毒素。以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。当前第1页12