本发明属医药化工领域，涉及2-甲烯基取代型裂木脂素类化合物，本发明还涉及包含2-甲烯基取代型裂木脂素类化合物的药物组合物及其医药用途。
背景技术
木脂素是一类由苯丙素氧化聚合而成的天然产物，通常所指是其二聚物。裂木脂素(断联木脂素)为不常见的木脂素类化合物，其木脂体内的一个c6-c3单元发生开环断裂后重新连接，使母核变为二苄基丁内酯的结构类型，1989年chencm等首次从peperomiajaponica中分离到此类化合物。自然界中已知的裂木脂素类化合物根据其γ-丁内酯环上2-c的取代类型与羰基还原情况，可分为2-甲基取代型、2-甲烯基取代型、2-羟甲基取代型、2-乙酰氧甲基取代型以及γ-丁内酯环上羰基被还原为羟基等类型。其中，2-甲烯基取代型裂木脂素类自然界中更为少见，目前只在草胡椒属、荨麻属中分离得到5个化合物。据文献报道，裂木脂素类化合物草胡椒素b与草胡椒素e对多种肿瘤细胞具有强的生长抑制活性。
jak(januskinase)是蛋白酪氨酸激酶(ptk)中的一种，可以介导细胞因子与其受体结合后的信号蛋白分子级联活化反应。细胞因子、生长因子等与其相应受体结合后激活jak，进而激活信号转导子和转录激活子stat(signaltransducerandactivatoroftransciription)。stat是一种能够结合于dna的独特蛋白家族，目前已发现stat家族存在7个成员，即stat1、stat2、stat3、stat4、stat5a、stat5b以及stat6。jak-stat信号通路是多种细胞因子和生长因子在细胞内传递信号的共同途径，参与机体细胞增殖、分化、凋亡以及免疫失调、炎症和肿瘤生成等多种生物学过程，近几十年来得到国内外的广泛研究。jak-stat信号通路的激活促进各种疾病包括各种实体肿瘤、淋巴瘤、白血病以及多种炎症性疾病的发生发展。例如，γ-干扰素(ifn-γ)主要通过stat1信号通路激活下游基因转录，促进细胞免疫、体液免疫等过程，发挥抗恶性肿瘤细胞增殖、抗病毒、免疫监督以及肿瘤抑制的作用。但是，ifn-γ是自身免疫性疾病可能的致病因素。抑制持续激活的stat1可能对自身免疫性疾病、慢性炎症以及随之而来的组织损伤有治疗作用。白介素-6(il-6)、表皮生长因子(egf)等主要通过stat3信号通路激活下游相应的基因调控细胞增殖、凋亡等过程。持续激活的stat3可以通过抑制机体的抗肿瘤免疫应答促进肿瘤细胞增殖、生存与转移，还可通过促进nf-κb、il-6-gp130-jak-stat信号产生炎症。抑制肿瘤细胞中持续激活的stat3，可以有效的促进肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤的发展。此外，一些肝损伤和神经系统疾病也与jak-stat信号通路与相关。
迄今为止，国内外相关研究中未见有具有2-甲烯基型裂木脂素类结构骨架的化合物对jak-stat信号通路具有抑制活性的相关报道。
技术实现要素：
在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所涉及的实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。
如本文中使用的，术语“c1-4烷氧基”指以c1-4烷基-o-的方式形成的基团，包括但不限于c1-4直链或支链烷氧基，例如甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、c4直链或支链烷氧基。
如本文中使用的，术语“c2-5烯氧基”指以c2-4烯基-o-的方式形成的基团，包括但不限于c2-5直链或支链烯氧基，例如乙烯氧基、烯丙基氧基、丙烯基氧基、c4-5直链或支链烯氧基(例如2-甲基-2-丁烯基-o-、2-甲基-1-丁烯基-o-、3-甲基-1-丁烯基-o)。
如本文中使用的，术语“c2-4炔氧基”指以c2-4炔基-o-的方式形成的基团，包括但不限于c2-4直链或支链炔氧基，例如乙炔氧基、丙炔基氧基、炔丙基氧基、c4直链或支链炔氧基。
如本文中使用的，术语“c6-8芳香烃氧基”是指以c6-8芳香烃基-o-的方式形成的基团，包括但不限于苯氧基、苄氧基。
如本文中使用的，术语“c1-12脂肪酰氧基”是指含有1-12个碳原子的脂肪酸去掉至少一个羧基中的氢原子形成的基团，所述脂肪酸为直链脂肪酸或支链脂肪酸、饱和脂肪酸或不饱和脂肪酸，所述脂肪酸含有一个或多个羧基。所述c2-12脂肪酰氧基包括但不限于甲酰氧基、乙酰氧基、丙烯酰氧基、丁酰氧基、异丁酰氧基、戊酰氧基、异戊酰氧基、琥珀酰氧基、辛烷酰氧基、月桂酰氧基。
如本文中使用的，术语“c1-4脂肪酰氧基”、“c1-5脂肪酰氧基”、“c1-8脂肪酰氧基”、“c1-12脂肪酰氧基”、“c3-5脂肪酰氧基”、“c3-6脂肪酰氧基”、“c6-10脂肪酰氧基”、“c7-9脂肪酰氧基”、“c9-12脂肪酰氧基”分别指c1-12脂肪酰氧基中，含有1-5个碳原子、1-8个碳原子、1-12个碳原子、3-5个碳原子、3-6个碳原子、6-10个碳原子、7-9个碳原子、9-12个碳原子的具体实例。
如本文中使用的，术语“直链脂肪酰氧基”、“支链脂肪酰氧基”、“饱和脂肪酰氧基”、“不饱和脂肪酰氧基”、“直链饱和脂肪酰氧基”、“支链饱和脂肪酰氧基”、“直链不饱和脂肪酰氧基”、“支链不饱和脂肪酰氧基”分别指形成脂肪酰氧基的脂肪酸为直链脂肪酸、支链脂肪酸、饱和脂肪酸、不饱和脂肪酸、直链饱和脂肪酸、支链饱和脂肪酸、直链不饱和脂肪酸、支链不饱和脂肪酸的具体实例。
如本文中使用的，术语“c6-8芳香酰氧基”是指含有6-8个碳原子的芳香羧酸去掉至少一个羧基中的氢原子形成的基团，例如苯甲酰氧基、苯乙酰氧基。
本发明中的术语“药学上可接受的盐”是指本发明化合物中存在的酸性官能团(例如-cooh、-oh、-so3h等)与适当的无机或者有机阳离子(碱)形成的盐，包括与碱金属或碱土金属形成的盐(例如钠盐、钾盐、镁盐或钙盐)、铵盐，以及与含氮有机碱形成的盐；以及本发明化合物中存在的碱性官能团(例如-nh2等)与适当的无机或者有机阴离子(酸)形成的盐，包括与无机酸形成的盐和与有机羧酸形成的盐。
如本文中使用的，术语“室温”是指25±5℃。
如本文中使用的，术语“约”应该被本领域技术人员理解，并将随其所用之处的上下文而有一定程度的变化。如果根据术语应用的上下文，对于本领域技术人员而言，其使用不是清楚的，那么“约”的意思是不超过所述特定数值或范围的正负10％。
本发明人通过创造性的劳动和不懈的努力，成功获得了具有式i所示结构的2-甲烯基取代型裂木脂素类化合物(如图1所示)：
其中，环状结构上的阿拉伯数字表示相应标位。本发明人还发现，所述化合物能够抑制细胞内jak-stat信号通路的活性，由此提供了下述发明：
在一个方面，本发明涉及具有式i所示结构的化合物或其药学上可接受的盐，
其中，
r1、r2各自选自羟基和任选被取代基取代的下列基团：c1-4烷氧基、c2-5烯氧基、c2-4炔氧基、c6-8芳香烃氧基、c1-12脂肪酰氧基、c6-8芳香酰氧基，所述取代基选自羟基、卤素(例如氟、氯、溴、碘)、硝基、羧基、苄氧基，所述取代基的个数为1-6个(例如1个、2个、3个、4个、5个或6个)；或者，r1与r2形成-o-(ch2)n-o-(n＝1或2)；
r3、r4各自选自羟基和任选被取代基取代的下列基团：c1-4烷氧基、c2-5烯氧基、c2-4炔氧基，所述取代基选自羟基、卤素(例如氟、氯、溴、碘)、硝基、羧基、苄氧基，所述取代基的个数为1-6个(例如1个、2个、3个、4个、5个或6个)；
r5、r6各自选自羟基和任选被取代基取代的下列基团：c1-4烷氧基、c2-5烯氧基、c2-4炔氧基，所述取代基选自羟基、卤素(例如氟、氯、溴、碘)、硝基、羧基、苄氧基，所述取代基的个数为1-6个(例如1个、2个、3个、4个、5个或6个)；或者，r5与r6形成-o-(ch2)n-o-(n＝1或2)；
在某些实施方案中，所述c1-4烷氧基选自甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、c4直链或支链烷氧基。
在某些实施方案中，所述c2-5烯氧基选自乙烯氧基、烯丙基氧基、丙烯基氧基、c4-5直链或支链烯氧基。
在某些实施方案中，所述c2-4炔氧基选自乙炔氧基、丙炔基氧基、炔丙基氧基、c4直链或支链炔氧基。
在某些实施方案中，所述c6-8芳香烃氧基选自苯氧基、苄氧基。
在某些实施方案中，所述c1-12脂肪酰氧基选自c1-4脂肪酰氧基、c1-5脂肪酰氧基、c1-8脂肪酰氧基、c1-12脂肪酰氧基、c3-5脂肪酰氧基、c3-6脂肪酰氧基、c6-10脂肪酰氧基、c7-9脂肪酰氧基、c9-12脂肪酰氧基。
在某些实施方案中，所述脂肪酰氧基选自：直链脂肪酰氧基、支链脂肪酰氧基、饱和脂肪酰氧基、不饱和脂肪酰氧基、直链饱和脂肪酰氧基、支链饱和脂肪酰氧基、直链不饱和脂肪酰氧基、支链不饱和脂肪酰氧基。
在某些实施方案中，所述c1-12脂肪酰氧基选自：甲酰氧基、乙酰氧基、丙烯酰氧基、丁酰氧基、异丁酰氧基、戊酰氧基、异戊酰氧基、辛烷酰氧基、琥珀酰氧基、月桂酰氧基。
在某些实施方案中，所述c1-12脂肪酰氧基被羧基或羟基取代。
在某些实施方案中，所述被羧基或羟基取代的c1-12脂肪酰氧基为3-羟基月桂酰氧基。
在某些实施方案中，所述c6-8芳香酰氧基选自苯甲酰氧基、苯乙酰氧基。
在某些实施方案中，所述c6-8芳香酰氧基被卤素、羟基或硝基取代。
在某些实施方案中，所述被卤素、羟基或硝基取代的c6-8芳香酰氧基选自没食子酰氧基、对硝基苯甲酰氧基、对氯苯甲酰氧基、对氟苯甲酰氧基。
在某些实施方案中，r1、r2各自选自羟基、甲氧基、乙氧基、异戊烯氧基、甲酰氧基、乙酰氧基、丙烯酰氧基、丁酰氧基、异丁酰氧基、戊酰氧基、异戊酰氧基、琥珀酰氧基、辛烷酰氧基、月桂酰氧基、3-羟基月桂酰氧基、苯甲酰氧基、没食子酰氧基、对硝基苯甲酰氧基、对氯苯甲酰氧基、对氟苯甲酰氧基，或者，r1与r2形成-o-(ch2)n-o-(n＝1或2)；
r3、r4各自选自任选被取代基取代的c1-3烷氧基(例如甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基)；
r5、r6各自选自任选被取代基取代的c1-3烷氧基(例如甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基)，或者，r5与r6形成-o-(ch2)n-o-(n＝1或2)；
所述取代基选自羟基、卤素(例如氟、氯、溴、碘)、硝基、羧基、苄氧基，所述取代基的个数为1-6个(例如1个、2个、3个、4个、5个或6个)。
在某些实施方案中，所述化合物满足以下条件：
(1)r1-r6不同时为甲氧基，以及
(2)当r1、r3、r4各自为甲氧基，且r5与r6形成-o-ch2-o-时，r2不是羟基。
在某些实施方案中，r1、r2各自选自羟基、甲氧基、乙氧基、异戊烯氧基、乙酰氧基、苯甲酰氧基、没食子酰氧基、对硝基苯甲酰氧基；
r3、r4各自选自甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基；
r5、r6各自选自甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基，或者，r5与r6形成-o-(ch2)n-o-(n＝1或2)；
并且，所述化合物满足以下条件：
(1)r1-r6不同时为甲氧基，以及
(2)当r1、r3、r4各自为甲氧基，且r5与r6形成-o-ch2-o-时，r2不是羟基。
在某些实施方案中，r1为羟基或甲氧基；
r2选自羟基、甲氧基、乙氧基、异戊烯氧基、乙酰氧基、苯甲酰氧基、没食子酰氧基、对硝基苯甲酰氧基；
r3、r4、r5、r6各自为甲氧基；或者，r3、r4各自为甲氧基，r5与r6形成-o-ch2-o-；
并且，所述化合物满足以下条件：
(1)r1-r6不同时为甲氧基，以及
(2)当r1、r3、r4各自为甲氧基，且r5与r6形成-o-ch2-o-时，r2不是羟基。
在某些实施方案中，r1、r3、r4、r5、r6各自为甲氧基，r2为羟基。
在某些实施方案中，r2、r3、r4、r5、r6各自为甲氧基，r1为羟基。
在某些实施方案中，r1、r3、r4各自为甲氧基，r2为乙氧基，r5与r6形成-o-ch2-o-。
在某些实施方案中，r1、r3、r4各自为甲氧基，r2为异戊烯氧基，r5与r6形成-o-ch2-o-。
在某些实施方案中，r1、r3、r4各自为甲氧基，r2为乙酰氧基，r5与r6形成-o-ch2-o-。
在某些实施方案中，r1、r3、r4各自为甲氧基，r2为没食子酰氧基，r5与r6形成-o-ch2-o-。
在某些实施方案中，r1、r3、r4各自为甲氧基，r2为对硝基苯甲酰氧基，r5与r6形成-o-ch2-o-。
在某些实施方案中，r1、r3、r4各自为甲氧基，r2为苯甲酰氧基，r5与r6形成-o-ch2-o-。
在一个方面，本发明涉及一种药物组合物，其含有本发明的化合物或其药学上可以接受的盐，任选地，还含有一种或多种药用辅料。
本申请的药用辅料是指生产药品和调配处方时，使用的赋形剂和附加剂，是指除活性成分外，在安全性方面已进行了合理的评估，并且包含在药物制剂中的物质。药用辅料除了赋型、充当载体、提高稳定性外，还具有增溶、助溶、缓控释等重要功能，是可能会影响到药品的质量、安全性和有效性的重要成分。药用辅料根据来源可分为天然物、半合成物和全合成物；根据其作用与用途可分为：溶剂、抛射剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、着色剂、黏合剂、崩解剂、填充剂、润滑剂、湿润剂、渗透压调节剂、稳定剂、助流剂、矫味剂、防腐剂、助悬剂、包衣材料、芳香剂、抗黏着剂、抗氧剂、螯合剂、渗透促进剂、ph调节剂、缓冲剂、增塑剂、表面活性剂、发泡剂、消泡剂、增稠剂、包合剂、保湿剂、吸收剂、稀释剂、絮凝剂与反絮凝剂、助滤剂、释放阻滞剂等；根据其给药途径可分为口服、注射、黏膜、经皮或局部给药、经鼻或口腔吸入给药和眼部给药等。同一药用辅料可用于不同给药途径的药物制剂，且有不同的作用和用途。
本申请的药物组合物可根据给药途径制成各种适宜的剂型。给药途径可以是口服、非肠道或局部给药。
本申请的药物组合物可以以任意方式施用，例如：口服、喷雾吸入、直肠用药、鼻腔给药、局部用药、非肠道用药，如皮下、静脉、肌内、腹膜内、鞘内、心室内、胸骨内和颅内注射或输入，或借助外植存储器；其中优选的给药方式为口服、腹膜内或静脉内。
当口服用药时，所述药物组合物可制成任意口服可接受的制剂形式，包括但不限于片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、糖浆剂、口服溶液剂、口服混悬剂和口服乳剂等。其中，片剂使用的载体一般包括乳糖和玉米淀粉，另外也可加入润滑剂如硬脂酸镁。胶囊剂使用的稀释剂一般包括乳糖和干燥玉米淀粉。口服混悬剂则通常是将活性成分与适宜的乳化剂和悬浮剂混合使用。任选地，以上口服制剂形式中还可加入一些甜味剂、芳香剂或着色剂。
当经皮或局部施用时，所述药物组合物可制成适当的软膏、洗剂或搽剂形式，其中将活性成分悬浮或溶解于一种或多种载体中。软膏制剂可使用的载体包括但不限于：矿物油、液体凡士林、白凡士林、丙二醇、聚氧化乙烯、聚氧化丙烯、乳化蜡和水；洗剂或搽剂可使用的载体包括但不限于：矿物油、脱水山梨糖醇单硬脂酸酯、吐温60、十六烷酯蜡、十六碳烯芳醇、2-辛基十二烷醇、苄醇和水。
所述药物组合物还可以注射剂形式用药，包括注射液、注射用无菌粉末与注射用浓溶液。其中，可使用的载体和溶剂包括水、林格氏溶液和等渗氯化钠溶液。另外，灭菌的非挥发油也可用作溶剂或悬浮介质，如单甘油酯或二甘油酯。
在某些实施方案中，本发明的化合物或其药学上可接受的盐以单位剂量的形式存在于药物组合物中。
在某些实施方案中，给予受试者有效量的所述药物组合物。如本文中所使用的，术语“有效量”是指足以获得或至少部分获得期望的效果的量。例如，预防疾病有效量是指，足以预防，阻止，或延迟疾病的发生的量；治疗疾病有效量是指，足以治愈或至少部分阻止已患有疾病的患者的疾病和其并发症的量。测定这样的有效量完全在本领域技术人员的能力范围之内。例如，对于治疗用途有效的量将取决于待治疗的疾病的严重度、患者自己的免疫系统的总体状态、患者的一般情况例如年龄，体重和性别，药物的施用方式，以及同时施用的其他治疗等等。
在一个方面，本发明涉及上述任一项化合物、其药学上可接受的盐或上述任一项药物组合物在制备以jak-stat信号通路为靶点的药物中的用途。
在一个方面，本发明涉及上述任一项化合物、其药学上可接受的盐或上述任一项药物组合物在制备用于预防和/或治疗受试者的jak-stat信号通路相关疾病的药物中的用途。
在一个方面，本发明涉及一种预防和/或治疗jak-stat信号通路相关疾病的方法，包括给有此需要的受试者施用上述任一项化合物、其药学上可接受的盐或上述任一项药物组合物。
在一个方面，本发明涉及上述任一项化合物、其药学上可接受的盐或上述任一项药物组合物，其用于预防和/或治疗受试者的jak-stat信号通路相关疾病。
在某些实施方案中，所述jak-stat信号通路相关疾病选自肿瘤、炎症、自身免疫性疾病、肝损伤和神经系统疾病。
在某些实施方案中，所述肿瘤选自胰腺癌、脑癌、结直肠癌、胃癌、肝癌、肺癌、卵巢癌、乳腺癌、宫颈癌、淋巴瘤、人急性早幼粒细胞白血病。
在某些实施方案中，所述炎症和自身免疫性疾病选自慢性炎症、风湿性关节炎和类风湿性关节炎。
在某些实施方案中，所述肝损伤选自肝缺血再灌注损伤、脂肪肝、病毒性肝炎、肝纤维化和肝衰竭。
在某些实施方案中，所述神经系统疾病选自脊髓损伤、蛛网膜下腔出血、周围神经损伤、横贯性脊髓炎和脑梗死。
在某些实施方案中，所述受试者为哺乳动物，例如牛科动物、马科动物、羊科动物、猪科动物、犬科动物、猫科动物、啮齿类动物、灵长类动物；例如，所述受试者为人。
另一方面，本发明涉及制备上述任一项化合物或其药学上可接受的盐的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)制备石蝉草乙醇总提取物；
(2)利用有机溶剂(例如石油醚和乙酸乙酯)对石蝉草乙醇总提取物进行萃取，得到萃取产物；
(3)利用真空液相色谱对萃取产物进行分离，得到初步分离产物；
(4)利用柱层析和半制备高效液相色谱对初步分离产物或其中的一个或多个部分进行分离。
在某些实施方案中，所述步骤(1)包括：在乙醇溶液中对石蝉草进行加热回流，过滤，除去滤液中的溶剂得到石蝉草乙醇总提取物。
在某些实施方案中，所述步骤(2)包括：分别使用石油醚和乙酸乙酯对石蝉草乙醇总提取物进行萃取，得到三个萃取部位，合并石油醚、乙酸乙酯萃取部位，除去溶剂得到萃取产物。
在某些实施方案中，所述步骤(3)包括：利用真空液相色谱(6×9cm，200～300目硅胶，石油醚-乙酸乙酯5:3～0:1)对萃取产物进行分离，利用薄层色谱(tlc)进行检测，得到初步分离产物，包括5个部分，即fr.a、fr.b、fr.c、fr.d、fr.e。
在某些实施方案中，所述步骤(4)包括：利用柱层析(11×21cm，gh-ods硅胶，甲醇-水40:60～55:45)对fr.d进行分离，用高效液相色谱(hplc)检测，得到d1、d2、d3、d4；使用半制备hplc(5×27cm，ymc-ods硅胶，甲醇-水45:55)对d2进行分离，得到6个部分，即d2-1、d2-2、d2-3、d2-4、d2-5、d2-6；使用半制备hplc对所述d2-1～d2-6中的一个或多个部分分别进行分离，得到本发明的化合物。
在某些实施方案中，所述方法还包括：对本发明的一个化合物进行烷基化或酰化反应，得到本发明的另一个化合物。
有益效果
本发明的化合物能够抑制细胞内jak-stat信号通路的活性，在预防和/或治疗与jak-stat信号通路相关的疾病(例如肿瘤、炎症和自身免疫性疾病)方面，具有很好的药用潜力。
下面将结合实施例和附图对本发明的实施方案进行详细描述，但是，本领域技术人员将理解，下列实施例和附图仅用于说明本发明，而不是对本发明的范围的限定。根据优选实施方案的下列详细描述，本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得显然。
附图说明
图1显示了本发明化合物的结构式。
图2显示了实施例1中，对石蝉草乙醇总提取物进行减压柱层析分离的薄层层析检测结果(展开条件：石油醚-乙酸乙酯1:3)。
图3显示了实施例1中，对fr.d进行反相柱层析分离的薄层层析点样分析结果(展开条件：石油醚-乙酸乙酯1:3)。
图4显示了实施例1中，对d3进行反相柱层析分离的薄层层析检测结果(展开条件：石油醚-丙酮1:2)。
具体实施方式
本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
在以下实施例的结构研究中，比旋光度用英国oa公司的polaar3005型旋光仪测定。正负离子esi-ms和hr-esi-ms分别用美国ab公司api3000型液质联用仪和英国micromass公司lct型质谱仪测定。圆二色谱用法国biologicscience公司mos-450圆二色谱仪测定。核磁共振图谱用日本jeol公司jnm-eca-400型和美国bruker公司inov600型超导核磁共振仪测定。分析型hplc采用hp1200型高效液相色谱仪，uv检测器，色谱柱采用wondasiltmods柱(5μm,4.6×150mm)；ymc-pack-ods-acolumn(5μm,4.6×150mm)。半制备hplc采用shimadzulc-15c型hplc，spd-15c检测器，色谱柱采用ymc-pack-ods-a柱(5μm,10×250mm)。
在所有实验中使用的溶剂均为分析纯级别，所用石油醚沸点范围为60-90℃。
实施例1：石蝉草药材的提取与化合物1、2、3、4、5、6的制备
石蝉草(peperomiablandajacq.kunth)干燥全草1.3kg切小段，80％(2×12l)乙醇加热回流提取2h，过滤。所得滤液合并后减压去除溶剂得到石蝉草乙醇总提取物290g，分别使用石油醚(3×800ml)、乙酸乙酯萃取(3×800ml)得到三个萃取部位。合并石油醚、乙酸乙酯萃取部位，减压除去溶剂得到105g产物，经减压柱层析分离(vlc，重复操作7次，6×9cm，200～300目硅胶，按照石油醚-乙酸乙酯5:3→4:3→1:1→1:2→0:1的顺序梯度洗脱)，根据薄层层析检测结果(展开条件：石油醚-乙酸乙酯1:3)，分别合并流份1-3；4-6；7-10；11-13；14-22(如图2所示)，浓缩得到5个部分(fr.a～fr.e)。
取10gfr.d，经反相柱层析分离(11×21cm，ymc-ods硅胶)，甲醇-水(40:60,45:55,50:50,55:45)梯度洗脱，每个梯度洗脱2000ml，流份收集后蒸干，薄层层析点样分析(展开条件：石油醚-乙酸乙酯1:3)，根据层析结果，分别合并流份1-3；4-6；7-12；13-19(如图3所示)，得到四个流份d1～d4。
d3浓缩至小体积后静置，析出杂质(30mg)，母液蒸干称重为1.4g，经反相柱层析(5×27cm，ymc-ods硅胶，甲醇-水45:55)分离，根据薄层层析(展开条件：石油醚-丙酮1:2)检测结果，分别合并流份12-13；14-15；16-16δ；17-18；19；20(如图4所示)，得到六个流份(d3-1～d3-6)。
d3-1使用半制备hplc分离(甲醇-水40:60，流速1.5ml/min，压力220bar)得到化合物2(2mg)。d3-2使用半制备hplc分离(甲醇-水40:60，流速1.5ml/min)得到化合物3(6mg)、化合物4(18mg)。d3-3经凝胶柱层析(2×100cm，甲醇)分离去除低分子量杂质后经半制备hplc分离(甲醇-水48:52，流速1.5ml/min，压力212bar)得到化合物1(10mg)、化合物2、5的混合物，进一步采用半制备hplc(乙腈-甲醇-水20:23:57，流速1.5ml/min，压力180bar)分离得到化合物2(2mg)、化合物5(12mg)。d3-6经半制备hplc分离(甲醇-水58:42，流速1.5ml/min，压力180bar)得到化合物6(5mg)。
另外多次重复使用半制备hplc(甲醇-水40:60，流速1.5ml/min，压力220bar)对d3-2剩余部分进行分离，得到化合物4的纯品125mg。
化合物1～6的理化常数和波谱数据
化合物1：白色无定型粉末，易溶于甲醇；
化合物2：白色无定型粉末，易溶于甲醇；
表1化合物1、2的nmr数据(400/100mhz，cdcl3)
化合物3：白色无定型粉末，易溶于甲醇；(+)esi-msm/z：462.5[m+nh4]+，467.5[m+na]+，483.4[m+k]+；1hnmr(600mhz,cdcl3)(见表2)。
化合物4：白色无定型粉末，易溶于甲醇；(+)esi-msm/z：415.4[m+h]+，432.4[m+nh4]+，438.4[m+k]+，(-)esi-msm/z：413.2[m-h]-；1hnmr(400mhz,cdcl3)(见表2)。
化合物5：白色无定型粉末，易溶于甲醇；(+)esi-ms：m/z429.3[m+h]+，446.6[m+nh4]+，451.3[m+na]+，467.3[m+k]+，463.3[m+cl]-，473.5[m+hcoo]-；1hnmr(400mhz,cdcl3)(见表2)。
化合物6：浅黄色固体，易溶于氯仿；(+)esi-msm/z：413.2[m+h]+，430.3[m+nh4]+，435.4[m+na]+，451.3[m+k]+，847.4[2m+na]+；1hnmr(400mhz,cdcl3)(见表2)。
表2化合物3～6的1hnmr数据
附注：化合物3的测定条件为(600mhz，cdcl3)；化合物4～6的测定条件为(400mhz，cdcl3)。
化合物1-6的结构分别如下：
实施例2：本发明化合物4a～4f的衍生化制备
称取上述实施例1制得的化合物4约12mg，用0.5ml丙酮溶解，加入50mg无水k2co3混匀，于60℃磁力搅拌下滴加50μl硫酸二乙酯进行乙基化反应6h。反应产物利用制备硅胶薄层层析进行分离纯化，除回收4mg原料化合物4以外，制得4a(1.2mg,正离子esi-msm/z：443[m+h]+，459[m+nh4]+)。
称取上述实施例1制得的化合物4约12mg，用0.5ml丙酮溶解，加入50mg无水k2co3混匀，于60℃磁力搅拌下滴加50μl1-溴-3-甲基-2-丁烯，常温反应12h，过滤，少量丙酮洗涤，合并滤液，减压蒸干，经制备硅胶薄层层析进行分离纯化，除回收3mg原料化合物4以外，制得4b(1.5mg,正离子esi-msm/z：483[m+h]+，负离子esi-msm/z：481[m-h]-)。
称取上述实施例1制得的化合物4约12mg，用0.25ml无水吡啶溶解，迅速加入0.25ml醋酐混匀，避光放置24h进行乙酰化反应。反应产物经制备硅胶薄层层析进行分离纯化，制得4c(3mg,正离子esi-msm/z：457[m+h]+，负离子esi-msm/z：455[m-h]-)。
称取上述实施例1制得的化合物4约12mg，用0.25ml丙酮溶解，加入0.25ml没食子酸的10mg/ml丙酮溶液混匀，再滴加6n盐酸1滴混匀后，避光放置室温下进行酰化反应7天。反应产物经制备硅胶薄层层析进行分离纯化，制得4d(0.8mg,正离子esi-msm/z：567[m+h]+，负离子esi-msm/z：565[m-h]-)。
称取上述实施例1制得的化合物4约12mg，用0.2ml无水吡啶溶解，迅速加入p-硝基苯甲酰氯13mg混匀，避光放置10h进行酰化反应。反应产物经制备硅胶薄层层析进行分离纯化，制得4e(3mg,正离子esi-msm/z：564[m+h]+，负离子esi-msm/z：562[m-h]-)。
称取上述实施例1制得的化合物4约12mg，用0.2ml无水吡啶溶解，迅速加入苯甲酰氯8μl混匀，避光放置20h进行酰化反应。反应产物经制备硅胶薄层层析进行分离纯化，制得4f(2.2mg,正离子esi-msm/z：537[m+h]+，负离子esi-msm/z：535[m-h]-)。
化合物4a-4f的结构分别如下：
实施例3：本发明式i化合物对jak-stat信号通路抑制活性的测试
4#/hepg2细胞分别稳定转染stat1-luciferase、stat3-luciferase质粒(以a-mem添加10％fbs为培养基)。培养4#/hepg2肿瘤细胞至对数生长期后，收集细胞，1000rpm离心5分钟，弃上清，以适量培养基悬浮，调整细胞浓度至2×105/ml，将细胞悬液接种到96孔细胞培养板中，每孔100μl，放置于细胞培养箱(37℃，5％co2)中。细胞培养至完全贴壁，生长至密度60～70％后，随机分组：
阴性对照：加入与待测药物等体积的含0.5％终浓度dmso的培养基，设2个副孔，分别加入激动剂(ifn-γ或il-6)11μl，孵育5.5小时；
阳性对照：设立三组阳性对照，各设2个副孔，每孔加入100μl浓度分别为100，50，10，2，0.4，0.08μm的pyridone6，分别加入激动剂(ifn-γ或il-6)11μl，孵育5.5小时；
药物处理：药物处理组，各设2个副孔，分别加入化合物1-6，化合物4a-4f(每孔加入100μl浓度分别为250，100，50，10，2，0.4，0.08μm的药物)培养1小时后，分别加入激动剂(ifn-γ或il-6)11μl，继续孵育5.5小时；
取出96孔板，小心吸取，移去培养基，每孔加入荧光素酶细胞裂解液(cclr)30μl，轻轻震荡使细胞充分裂解后，分别移取20μl到酶标96孔板中，加入30μl荧光素酶底物，混合均匀，置于酶标仪中检测荧光强度，计算ic50。运用prismgraphpad5.0统计软件计算ic50值。抑制活性结果见表3。
表3本发明化合物及阳性对照jak抑制剂pyridone6对ifn-γ/stat1、il-6/stat3的抑制活性
如表3所示，pyridone6对ifn-γ/stat1信号通路和il-6/stat3信号通路产生了强烈的抑制作用，证明细胞模型建模成功。使用荧光素酶报告基因检测法检测了本发明12个化合物对ifn-γ/stat1、il-6/stat3信号通路的抑制活性。本发明12个化合物显示了对ifn-γ/stat1信号通路的不同程度的抑制活性，抑制作用的ic50值为1.35到81.47μm；这12个化合物还显示了对il-6/stat3信号通路的不同程度的抑制活性，抑制作用的ic50值为0.59到>100μm。
以上实验结果说明，本发明的化合物具有jak-stat信号通路抑制活性，可用于预防和/或治疗与jak-stat信号通路相关的疾病，例如肿瘤、炎症、自身免疫性疾病、肝损伤和神经系统疾病。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，但本领域技术人员将理解：根据已经公开的所有教导，可以对细节进行各种修改和变动，并且这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。