极性氨基酸苄酯修饰的菠菜素、其合成、活性评价及应用的制作方法

本发明涉及3h-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酰-[n-(cl-ch2c＝nh)-orn]-aa-obzl,涉及它们的制备,涉及它们对肿瘤生长的抑制作用，进一步涉及它们的抗炎及抑制pad4活性。本发明属于生物医药领域。

背景技术

恶性肿瘤严重威胁人类健康。通常10％-15％肿瘤患者只能存活5年。在过去的30年里这种困难的局面尚未显著有所改善。炎症则会进一步恶化肿瘤患者的预后。至今，更没有可预防炎症的抗肿瘤药物用于临床。发明具有抗肿瘤和抗炎双重作用的药物是抗肿瘤药物研究的前沿。发明人曾经公开下式的3h-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酰-met-aa-obzl(式中aa选自l-ala,l-val,l-met,l-asp(obzl)残基)在100nmol/kg和20nmol/kg剂量下显示一定的抗肿瘤活性。通过进一步研究发明人认识到，在3h-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酰-met-aa-obzl(式中aa的定义同上)的met残基替换为orn残基，并以2-氯乙酰亚氨基修饰它的侧链氨基，不仅可以提高抗肿瘤活性，而且可以发挥抗炎活性。通过这种修饰，获得的下式的具有抗肿瘤和抗炎双重活性的化合物，具有良好的临床应用前景。根据这些认识，发明人提出了本发明。

技术实现要素：

本发明的第一个内容是提供13h-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酰-[n-(cl-ch2c＝nh)-orn]-aa-obzl(式中aa选自l-met,l-asn,l-arg(no2),l-ser,l-tyr,l-thr,l-glu(obzl),l-asp(obzl)和l-gln残基)。

本发明的第二个内容是提供3h-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酰-[n-(cl-ch2c＝nh)-orn]-aa-obzl的合成方法，该方法包括：

(1)l-组氨酸在浓硫酸催化下与甲醛进行pictet-spengler缩合生成(6s)-4,5,6,7-四氢-3h-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-羧酸；

(2)(6s)-4,5,6,7-四氢-3h-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-羧酸甲酯化得到(6s)-4,5,6,7-四氢-3h-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-羧酸甲酯；

(3)(6s)-4,5,6,7-四氢-3h-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-羧酸甲酯氧化得到3h-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-羧酸甲酯；

(4)3h-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-羧酸甲酯皂化得到3h-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-羧酸；

(5)3h-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-羧酸与l-orn(boc)-obzl偶联得到3h-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酰-orn(boc)-obzl；

(6)3h-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酰-orn(boc)-obzl氢解脱苄得到3h-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酰-orn(boc)；

(7)3h-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酰-orn(boc)与aa-obzl(aa选自l-met,l-asn,l-arg(no2),l-ser,l-tyr,l-thr,l-glu(obzl),l-asp(obzl)和l-gln残基)偶联得到3h-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酰-orn(boc)-aa-obzl；

(8)3h-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酰-orn(boc)-aa-obzl氢解脱苄得到3h-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酰-orn(boc)-aa；

(9)3h-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酰-orn(boc)-aa-obzl在浓度为4m的氯化氢的乙酸乙酯溶液中脱boc得到3h-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酰-orn-aa；

(10)3h-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酰-orn-aa与2-氯乙酰亚氨酸乙酯在ph为11的环境下反应得到3h-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酰-orn(cl-ch2c＝nh)-aa-obzl。

本发明的第三个内容是评价3h-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酰-[n-(cl-ch2c＝nh)-orn]-aa-obzl对s180小鼠肿瘤生长抑制作用。

本发明的第四个内容是评价3h-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酰-[n-(cl-ch2c＝nh)-orn]-aa-obzl对小鼠耳肿胀的抑制活性。

附图说明

图13h-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酰-[n-(cl-ch2c＝nh)-orn]-aa-obzl的合成路线。ⅰ)甲醛，浓h2so4；ⅱ)甲醇，socl2；ⅲ)kmno4，n,n-二甲基甲酰胺；ⅳ)naoh水溶液(2m)；ⅴ)苯并三氮唑-n,n,n’,n’-四甲基脲六氟磷酸盐,n,n-二甲基甲酰胺,n-甲基吗啉,hcl·orn(boc)-obzl；vi)pd/c,氢解；vii)苯并三氮唑-n,n,n’,n’-四甲基脲六氟磷酸盐,n,n-二甲基甲酰胺,n-甲基吗啉,aa-obzl；viii)氯化氢的乙酸乙酯溶液(4m)；ix)2-氯乙酰亚胺酸乙酯,三乙胺。7a-9a中aa为l-thr残基，7b-9b中aa为l-tyr残基，7c-9c中aa为l-asp(obzl)残基，7d-9d中aa为l-glu(obzl)残基，7e-9e中aa为l-gln残基，7f-9f中aa为l-asn残基，7g-9g中aa为l-ser残基，7h-9h中aa为l-met残基，7i-9i中aa为l-arg(no2)残基，7j-9j中aa不存在。

具体实施方式

为了进一步阐述本发明，下面给出一系列实施例。这些实施例完全是例证性的，它们仅用来对本发明进行具体描述，不应当理解为对本发明的限制。

实施例1制备6s-4,5,6,7-四氢-3h-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-羧酸

将10g(64.5mmol)l-组氨酸与150ml蒸馏水混悬。冰浴下往里依次缓慢滴入2ml浓硫酸和10ml甲醛溶液(40％)。反应混合物于65℃加热10h后冷却至室温，冰浴下用浓氨水调节反应液ph至7，过滤，收集滤饼，晾干，得8.96g(86％)标题化合物，为无色固体。esi-ms(m/z):168[m+h]⁺。

实施例2制备6s-4,5,6,7-四氢-3h-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-羧酸甲酯

冰浴下向5g(29.9mmol)(6s)-4,5,6,7-四氢-3h-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-羧酸与40ml甲醇的溶液中缓慢滴加10mlsocl2，室温搅拌48h，反应混合物变为澄清状态，反应结束。减压浓缩，残留物用40ml甲醇溶解，减压浓缩。该操作重复3次。残留物用乙醚磨洗3次，得到8.96g(86％)标题化合物，为无色固体。esi-ms(m/z):182[m+h]⁺。

实施例3制备3h-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-羧酸甲酯

将4g(22.1mmol)(6s)-4,5,6,7-四氢-3h-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-羧酸甲酯用200ml二甲基甲酰胺溶解，用三乙胺调ph到8。冰浴下分3次往里加500mgkmno4，搅拌12h。反应混合物减压浓缩，残留物用50ml稀盐酸(2m)溶解，滤除去不溶物。冰浴下滤液用naoh水溶液调节ph到7，无色固体充分析出之后过滤。滤饼用蒸馏水洗，室温晾干，得3.715g(82％)标题化合物，为无色固体。esi-ms(m/z):178[m+h]⁺。

实施例4制备3h-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-羧酸

在冰浴冷却下，5g(28.22mmol)3h-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-羧酸甲酯用40mlnaoh水溶液(2m)溶解，反应4h后反应混合物用稀盐酸(2m)调节ph至7。静置，使固体充分析出。过滤，滤并用蒸馏水洗，晾干，得到1.757g(38％)标题化合物，为淡黄色固体。esi-ms(m/z):162[m-h]^-；¹h-nmr(300mhz,dmso-d6)：δ/ppm＝8.757(s,1h),8.381(s,1h),8.163(s,1h)。

实施例5制备3h-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酰-orn(boc)-obzl

将1.14g(7.0mmol)3h-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-羧酸用50ml二甲基甲酰胺溶解。冰浴下往得到的溶液中加2.8g(7.4mmol)苯并三氮唑-n,n,n’,n’-四甲基脲六氟磷酸盐，搅拌30min，得到反应液a。将3g(8.3mmol)hcl·orn(boc)-obzl用50ml二甲基甲酰胺溶解，得到反应液b。将反应液b滴加到反应液a中，并用n-甲基吗啉调节反应液ph至8，室温搅拌12h。反应混合物减压浓缩，残留物用120ml乙酸乙酯溶解，滤除不溶物，滤液依次用50ml饱和nahco3水溶液及饱和nacl水溶液分别洗3次。乙酸乙酯层用无水na2so4干燥12h，过滤，滤液减压浓缩，得到的黄色油状物经硅胶柱层析纯化(二氯甲烷/甲醇＝30:1)，得到1.549g(47％)标题化合物，为无色固体。esi-ms(m/z):468[m+h]⁺；¹h-nmr(300mhz,dmso-d6):δ/ppm＝13.12(s,1h),9.00(s,1h),8.94(d,j＝7.5hz,1h),8.56(s,1h),8.53(s,1h),8.25(s,1h),7.25(m,5h),6.84(s,1h),2.93(d,j＝6.0hz,2h),1.89(d,j＝6.0hz,2h),1.46(m,2h),1.35(s,9h)。

实施例6制备3h-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酰-orn(boc)(6)

向1.549g(3.3mmol)3h-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酰-orn(boc)-obzl与20ml无水乙醇的溶液中加0.3gpd/c。往悬浮液中通24h氢气。反应混合物滤除pd/c，滤液减压浓缩，得1.048g(86％)标题化合物，为棕黑色固体。esi-ms(m/z):368[m+h]⁺。

实施例7制备3h-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酰-orn(boc)-thr-obzl(7a)

将377mg(1mnol)3h-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酰-orn(boc)(6)用30ml二甲基甲酰胺溶解。冰浴下向得到的溶液中加450mg(1.2mmol)苯并三氮唑-n,n,n’,n’-四甲基脲六氟磷酸盐，搅拌30min。之后，往溶液中滴加250mg(1.1mmol)hcl·thr-obzl与10ml二甲基甲酰胺的溶液。反应混合物用n-甲基吗啉调ph值至8，室温搅拌12h。反应混合物减压浓缩，残留物用50ml乙酸乙酯溶解，滤除不溶物，滤液依次用30ml饱和nahco3水溶液及饱和nacl水溶液分别洗3次。乙酸乙酯层用无水na2so4干燥12h，过滤，滤液减压浓缩。得到的黄色油状物经硅胶柱层析纯化(二氯甲烷/甲醇＝20:1)，得到241mg(42％)标题化合物，为无色固体。esi-ms(m/z):569[m+h]⁺；¹h-nmr(300mhz,dmso-d6):δ/ppm＝13.17(s,1h),9.00(s,1h),8.75(d,j＝9.0hz,2h),8.55(s,1h),8.38(d,j＝9.0hz,1h),8.24(s,1h),7.33(m,5h),6.80(s,1h),5.13(m,2h),5.07(d,j＝6.0hz,1h),4.74(m,1h),4.39(dd,j＝3.0hz,j＝12.0hz,1h),4.20(m,1h),2.89(d,j＝5.0hz,2h),1.68(m,12h),0.87(m,3h)。

实施例8制备3h-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酰-orn(boc)-tyr-obzl(7b)

按照实施例7的方法，从377mg(1mnol)3h-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酰-orn(boc)(6)和250mg(1.1mmol)hcl·tyr-obzl得到220mg(35％)标题化合物，为无色固体。esi-ms(m/z):631[m+h]⁺；¹h-nmr(300mhz,dmso-d6):δ/ppm＝13.17(s,1h),9.20(s,1h),8.99(s,1h),7.31(m,5h),6.98(d,j＝6.0hz,2h),6.78(s,1h),6.60(d,j＝3.0hz,2h),5.06(m,2h),4.53(dd,j＝6.0hz,j＝7.8hz,2h),2.91(m,4h),1.66(m,2h),1.35(m,12h)。

实施例9制备3h-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酰-orn(boc)-asp(obzl)-obzl(7c)

按照实施例7的方法，从377mg(1mnol)3h-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酰-orn(boc)(6)和550mg(1.1mmol)tos·asp(obzl)-obzl得到346mg(51％)标题化合物，为无色固体。esi-ms(m/z):673[m+h]⁺；¹h-nmr(300mhz,dmso-d6):δ/ppm＝13.18(s,1h),9.00(s,1h),8.80(d,j＝9.0hz,2h),8.70(d,j＝7.4hz,2h),8.55(s,1h),8.25(s,1h),7.41(m,10h),6.78(s,1h),5.08(d,j＝7.5hz,4h),4.79(m,1h),4.26(m,1h),3.05(m,4h),1.68(m,2h),1.44(m,2h),1.35(m,12h)。

实施例10制备3h-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酰-orn(boc)-glu-obzl(7d)

按照实施例7的方法，从377mg(1mnol)3h-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酰-orn(boc)(6)和570mg(1.1mmol)tos·asp(obzl)-obzl得到290mg(42％)标题化合物，为无色固体。esi-ms(m/z):687[m+h]⁺；¹h-nmr(300mhz,dmso-d6):δ/ppm＝13.18(s,1h),9.00(s,1h),8.63(m,3h),8.24(s,1h),7.33(m,10h),5.11(m,4h),4.60dd,j＝7.5hz,j＝12.0hz,1h),4.40(dd,j＝6.0hz,j＝12.0hz,1h),2.88(d,j＝6.0hz,2h),2.45(m,2h),2.09(m,1h),1.96(m,1h),1.71(m,2h),1.47(m,2h),1.36(m,9h)。

实施例11制备3h-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酰-orn(boc)-gln-obzl(7e)

按照实施例7的方法，从377mg(1mnol)3h-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酰-orn(boc)(6)和266mg(1.1mmol)hcl·gln-obzl得到205mg(34％)标题化合物，为无色固体。esi-ms(m/z):597[m+h]⁺；¹h-nmr(300mhz,dmso-d6):δ/ppm＝13.16(s,1h),9.00(s,1h),8.64(m,2h),8.55(s,1h),8.24(s,1h),7.33(m,5h),6.80(s,1h),5.13(m,2h),4.62(m,1h),4.32(m,1h),2.86(d,j＝6.0hz,2h),2.16(m,2h),2.00(m,1h),1.77(m,3h),1.34(m,12h)。

实施例12制备3h-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酰-orn(boc)-asn-obzl(7f)

按照实施例7的方法，从377mg(1mnol)3h-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酰-orn(boc)(6)和250mg(1.1mmol)hcl·asn-obzl得到190mg(32％)标题化合物，为无色固体。esi-ms(m/z):582[m+h]⁺；¹h-nmr(300mhz,dmso-d6):δ/ppm＝13.18(s,1h),9.00(s,1h),8.65(m,3h),8.24(s,1h),7.42(s,1h),7.33(m,5h),6.95(s,1h),5.15(m,2h),4.64(m,2h),2.88(d,j＝6.0hz,2h),2.68(m,2h),1.68(m,2h),1.35(m,10h)。

实施例13制备3h-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酰-orn(boc)-ser-obzl(7g)

按照实施例7的方法，从377mg(1mnol)3h-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酰-orn(boc)(6)和230mg(1.1mmol)hcl·ser-obzl得到180mg(32％)标题化合物，为无色固体。esi-ms(m/z):555[m+h]⁺；¹h-nmr(300mhz,dmso-d6):δ/ppm＝13.17(s,1h),9.00(s,1h),8.63(m,3h),8.24(s,1h),7.33(m,5h),6.80(s,1h),5.13(s,2h),4.69(m,1h),4.46(dd,j＝6.0hz,j＝7.8hz,1h),3.76(m,2h),2.88(m,2h),1.74(m,2h),1.33(m,12h)。

实施例14制备3h-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酰-orn(boc)-met-obzl(7h)

按照实施例7的方法，从377mg(1mnol)3h-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酰-orn(boc)(6)和300mg(1.1mmol)hcl·met-obzl得到190mg(320％)标题化合物，为无色固体。esi-ms(m/z):600[m+h]⁺；¹h-nmr(300mhz,dmso-d6):δ/ppm＝13.21(s,1h),9.00(s,1h),8.70(d,j＝3.0hz,1h),8.65(d,j＝7.5hz,1h),8.50(s,1h),8.24(s,1h),7.34(m,5h),6.81(d,j＝6.0hz,1h),5.13(m,2h),4.47(m,2h),2.88(m,2h),1.98(m,3h),1.90(m,2h),1.65(m,2h),1.47(m,2h),1.37(m,9h)。

实施例15制备3h-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酰-orn(boc)-arg(no2)-obzl(7i)

按照实施例7的方法，从377mg(1mnol)3h-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酰-orn(boc)(6)和500mg(1.1mmol)hcl·arg(no2)-obzl得到293mg(44％)标题化合物，为无色固体。esi-ms(m/z):669[m+h]⁺；¹h-nmr(300mhz,dmso-d6):δ/ppm＝13.18(s,1h),9.00(s,1h),8.63(d,j＝9.0hz,2h),8.55(s,1h),8.50(m,1h),8.24(s,1h),7.33(m,5h),6.80(d,j＝6.0hz,1h),5.13(m,2h),4.69(m,1h),4.26(dd,j＝6.0hz,j＝7.8hz,1h),3.12(m,2h),2.88(m,2h),1.68(m,2h),1.78(m,4h),1.51(m,2h),1.32(m,12h)。

实施例16制备3h-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酰-orn-obzl

冰浴下将223mg(0.61mmol)3h-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酰-orn(boc)-obzl用20ml氯化氢的乙酸乙酯(4m)溶解，搅拌4h，tlc(二氯甲烷/甲醇＝15/1)显示反应完毕，将反应液于37℃减压浓缩。残留物用40ml乙酸乙酯溶解，减压浓缩。残留物用40ml乙酸乙酯溶解，减压浓缩。该操作重复3次，彻底除去氯化氢。残留物用无水乙醚充分悬浮，静置，去乙醚，得160mg(91％)标题化合物，为无色固体。esi-ms(m/z):368[m+h]⁺。

实施例17制备3h-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酰-orn-thr-obzl(8a)

按照实施例16的方法，从241mg(0.4mmol)3h-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酰-orn(boc)-thr-obzl(7a)得168mg(84％)标题化合物，为无色固体。esi-ms(m/z):469[m+h]⁺。

实施例18制备3h-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酰-orn-tyr-obzl(8b)

按照实施例16的方法，从220mg(0.4mmol)3h-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酰-orn(boc)-tyr-obzl(7b)得152mg(83％)标题化合物，为无色固体。esi-ms(m/z):531[m+h]⁺。

实施例19制备3h-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酰-orn-asp(obzl)-obzl(8c)

按照实施例16的方法，从346mg(0.5mmol)3h-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酰-orn(boc)-asp(obzl)-obzl(7c)得203mg(70％)标题化合物，为无色固体。esi-ms(m/z):573[m+h]⁺。实施例20制备3h-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酰-orn-glu(obzl)-obzl(8d)

按照实施例16的方法，从290mg(0.4mmol)3h-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酰-orn(boc)-glu(obzl)-obzl(7d)得185mg(77％)标题化合物，为无色固体。esi-ms(m/z):587[m+h]⁺。实施例21制备3h-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酰-orn-gln-obzl(8e)

按照实施例16的方法，从205mg(0.4mmol)3h-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酰-orn(boc)-gln-obzl(7e)得155mg(91％)标题化合物，为无色固体。esi-ms(m/z):497[m+h]⁺。

实施例22制备3h-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酰-orn-asn-obzl(8f)

按照实施例16的方法，从190mg(0.4mmol)3h-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酰-orn(boc)-asn-obzl(7f)得130mg(82％)标题化合物，为无色固体。esi-ms(m/z):482[m+h]⁺。

实施例23制备3h-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酰-orn-ser-obzl(8g)

按照实施例16的方法，从180mg(0.4mmol)3h-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酰-orn(boc)-ser-obzl(7g)得120mg(80％)标题化合物，为无色固体。esi-ms(m/z):455[m+h]⁺。

实施例24制备3h-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酰-orn-met-obzl(8h)

按照实施例16的方法，从190mg(0.4mmol)3h-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酰-orn(boc)-met-obzl(7h)得145mg(92％)标题化合物，为无色固体。esi-ms(m/z):500[m+h]⁺。

实施例25制备3h-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酰-orn-arg(no2)-obzl(8i)

按照实施例24的方法，从293mg(0.4mmol)3h-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酰-orn(boc)-arg(no2)-obzl(7i)得198mg(81％)标题化合物，为无色固体。esi-ms(m/z):569[m+h]⁺。

实施例26制备3h-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酰-[n-(cl-ch2c＝nh)-orn]-obzl(9j)

冰浴下向160mg(0.4mmol)3h-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酰-orn-obzl与40ml无水乙腈的溶液中加入250mg(1.72mmol)2-氯乙酰亚氨酸乙酯，然后用无水三乙胺调节ph至11。反应混合物于冰浴下搅拌10h，tlc(正丁醇/冰醋酸/水＝5/1/1)显示反应完成。反应液减压浓缩，残留物用无水乙醚(10ml×3)磨洗，除去三乙胺，得到15mg(10％)标题化合物，为无色固体。esi-ms(m/z):441[m+h]⁺；¹h-nmr(300mhz,cd3od):δ/ppm＝9.02(s,1h),8.53(s,1h),8.41(s,1h),7.37(m,5h),5.25(d,j＝6.0hz,2h),4.34(s,2h),3.51(m,1h),2.16(m,1h),1.95(m,1h),1.80(m,2h),1.35(m,6h)mp:180-181℃；

实施例27制备3h-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酰-[n-(cl-ch2c＝nh)-orn]-thr-obzl(9a)

按照实施例26的方法，从168mg(0.4mmol)3h-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酰-orn-thr-obzl(8a)和250mg(1.60mmol)2-氯乙酰亚氨酸乙酯得到35mg(24％)标题化合物，为无色固体。esi-ms(m/z):543[m+h]⁺；¹h-nmr(300mhz,dmso-d6):δ/ppm＝9.89(s,1h),9.45(s,1h),9.02(s,2h),9.01(s,1h),8.77(d,j＝9.0hz,1h),8.43(d,j＝6.0hz,1h),8.58(s,1h),8.27(s,1h),7.32(m,5h),5.18(s,2h),4.84(m,1h),4.42(m,1h),4.33(s,2h),4.02(m,1h),1.79(m,2h),1.62(m,2h)；mp137-140℃；

实施例28制备3h-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酰-[n-(cl-ch2c＝nh)-orn]-tyr-obzl(9b)

按照实施例26的方法，从152mg(0.3mmol)3h-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酰-orn-tyr-obzl(8b)和200mg(1.2mmol)2-氯乙酰亚氨酸乙酯得到15mg(9％)标题化合物，为无色固体。esi-ms(m/z):605[m+h]⁺；¹h-nmr(300mhz,dmso-d6):δ/ppm＝9.88(m,2h),9.45(s,1h),9.03(s,1h),9.01(s,1h),8.77(s,1h),8.64(d,j＝6.0hz,1h),8.58(m,2h),8.26(s,1h),6.80(m,2h),6.62(m,2h),5.50(s,2h),4.21(s,2h),4.65(m,2h),4.40(m,2h),3.42(m,2h),3.33(m,2h),1.71(m,2h),1.56(m,2h)；mp168-169℃；

实施例29制备3h-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酰-[n-(cl-ch2c＝nh)-orn]-asp(obzl)-obzl(9c)

按照实施例26的方法，从203mg(0.4mmol)3h-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酰-orn-asp(obzl)-obzl(8c)和250mg(1.6mmol)2-氯乙酰亚氨酸乙酯得到26mg(11％)标题化合物，为无色固体。esi-ms(m/z):647[m+h]⁺；¹h-nmr(300mhz,dmso-d6):δ/ppm＝9.88(s,1h),9.46(s,1h),9.03(d,2h),8.91(d,j＝9.0hz,1h),8.77(d,j＝6.0hz,1h),8.59(s,1h),8.27(s,1h),7.31(m,10h),5.10(s,2h),5.02(s,2h),4.79(m,1h),4.65(m,1h),4.32(s,2h),3.20(m,2h),2.88(m,2h),1.77(m,2h),1.58(m,2h)；mp115-116℃；

实施例30制备3h-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酰-[n-(cl-ch2c＝nh)-orn]-glu(obzl)-obzl(9d)

按照实施例26的方法，从185mg(0.4mmol)3h-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酰-orn-glu(obzl)-obzl(8d)和250mg(1.6mmol)2-氯乙酰亚氨酸乙酯得到20mg(10％)标题化合物，为无色固体。esi-ms(m/z):661[m+h]⁺；¹h-nmr(300mhz,dmso-d6):δ/ppm＝9.88(s,1h),9.48(s,1h),9.02(d,2h),8.78(d,j＝9.0hz,1h),8.67(d,j＝6.0hz,1h),8.58(s,1h),8.26(s,1h),7.32(m,10h),5.12(s,2h),5.06(s,2h),4.66(m,1h),4.41(m,1h),4.32(s,2h),3.20(m,2h),2.07(m,1h),1.79(m,3h),1.58(m,2h)；mp104-105℃；

实施例31制备3h-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酰-[n-(cl-ch2c＝nh)-orn]-gln-obzl(9e)

按照实施例26的方法，从155mg(0.3mmol)3h-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酰-orn-gln-obzl(8e)和200mg(1.2mmol)2-氯乙酰亚氨酸乙酯得到38mg(21％)标题化合物，为无色固体。esi-ms(m/z):571[m+h]⁺；¹h-nmr(300mhz,dmso-d6):δ/ppm＝9.90(s,1h),9.47(s,1h),9.02(s,1h),8.79(d,j＝9.0hz,1h),8.69(d,j＝9.0hz,1h),8.59(s,1h),8.27(s,1h),7.63(s,1h),7.32(m,5h),7.28(s,1h),6.81(s,1h),5.07(s,2h),4.68(m,2h),4.33(s,2h),3.25(m,1h),2.74(m,1h),2.17(m,2h),1.99(m,2h),1.83(m,3h),1.61(m,2h)；mp141-143℃；

实施例32制备3h-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酰-[n-(cl-ch2c＝nh)-orn]-asn-obzl(9f)

按照实施例26的方法，从130mg(0.3mmol)3h-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酰-orn-asn-obzl(8f)和200mg(1.2mmol)2-氯乙酰亚氨酸乙酯得到26mg(17％)标题化合物，为无色固体。esi-ms(m/z):556[m+h]⁺；¹h-nmr(300mhz,dmso-d6):δ/ppm＝9.88(s,1h),9.45(s,1h),9.02(m,2h),8.77(d,j＝9.0hz,1h),8.69(d,j＝9.0hz,1h),8.57(s,1h),8.26(s,1h),7.45(s,1h),7.31(m,5h),6.99(s,1h),5.07(s,2h),4.67(m,2h),4.32(s,2h),3.25(m,2h),2.72(m,2h),1.79(m,2h),1.55(m,2h)；mp144-146℃；

实施例33制备3h-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酰-[n-(cl-ch2c＝nh)-orn]-ser-obzl(9g)

按照实施例26的方法，从120mg(0.3mmol)3h-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酰-orn-ser-obzl(8g)和200mg(1.2mmol)2-氯乙酰亚氨酸乙酯得到32mg(20％)标题化合物，为无色固体。esi-ms(m/z):529[m+h]⁺；¹h-nmr(300mhz,dmso-d6):δ/ppm＝9.90(s,1h),9.37(s,1h),8.98(s,1h),8.75(d,j＝9.0hz,1h),8.66(d,j＝9.0hz,1h),8.59(s,1h),8.27(s,1h),7.32(m,5h),5.07(s,2h),4.67(m,1h),4.39(s,1h),4.21(s,2h),3.25(m,2h),2.72(m,1h),1.97(m,2h),1.65(m,2h)；mp213-216℃；

实施例34制备3h-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酰-[n-(cl-ch2c＝nh)-orn]-met-obzl(9h)

按照实施例26的方法，从145mg(0.4mmol)3h-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酰-orn-met-obzl(8h)和250mg(1.72mmol)2-氯乙酰亚氨酸乙酯得到20mg(10％)标题化合物，为无色固体。esi-ms(m/z):574[m+h]⁺；¹h-nmr(300mhz,dmso-d6):δ/ppm＝9.89(s,1h),9.46(s,1h),9.04(s,1h),9.01(s,1h),8.77(d,j＝9.0hz,1h),8.66(d,j＝9.0hz,1h),8.58(s,1h),8.27(s,1h),7.32(m,5h),5.07(m,2h),4.67(m,1h),4.49(s,1h),4.33(s,2h),3.24(m,2h),2.02(s,3h),1.87(m,4h),1.62(m,2h)；mp122-124℃；

实施例35制备3h-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酰-[n-(cl-ch2c＝nh)-orn]-arg(no2)-obzl(9i)

按照实施例26的方法，从160mg(0.4mmol)3h-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酰-orn-obzl(8i)和250mg(1.72mmol)2-氯乙酰亚氨酸乙酯得到15mg(10％)标题化合物，为无色固体。esi-ms(m/z):441[m+h]⁺；¹h-nmr(300mhz,cd3od):δ/ppm＝9.02(s,1h),8.53(s,1h),8.41(s,1h),7.37(m,5h),5.25(d,j＝6.0hz,2h),4.34(s,2h),3.51(m,1h),2.16(m,1h),1.95(m,1h),1.80(m,2h),1.35(m,6h)；mp159-161℃；

实施例36评价化合物9a-i的抗肿瘤活性

化合物9a-i用生理盐水溶解，阿霉素用生理盐水溶解作阳性对照，生理盐水(剂量为10ml/kg/天)作阴性对照。小鼠腹腔注射化合物9a-j的剂量为2nmol/kg/天，小鼠腹腔注射化合物9i的剂量为200nmol/kg/天，小鼠腹腔注射阿霉素的剂量为2000nmol/kg/天，连续给药7天，共给药7次。实验小鼠为icr雄性小鼠，体重为20±2g。瘤源来自小鼠的s180肉瘤,自行传代维持。

无菌条件下抽取生长旺盛的s180腹水瘤瘤液接种,用生理盐水稀释成(1:2)的液体充分混合,将肿瘤细胞悬液用新鲜配制的0.2％台盼蓝染色,混匀后按白细胞计数方法计数,染蓝色者为死细胞,不染色者为活细胞。按细胞浓度＝4大方格内活细胞数/4×10⁴×稀释倍数＝细胞数/ml计算细胞浓度。按细胞存活率＝活细胞数/(活细胞数+死细胞数)×100％计算细胞存活率。将存活率大于90％的瘤液用匀浆法制备成2.0×10⁷个/ml的细胞悬液,于鼠腋皮下接种,0.2ml/只,制造s180荷瘤小鼠。肿瘤接种24h后,随机分组，每组12只小鼠。小鼠每日腹腔注射化合物9a-j，或每日腹腔注射阿霉素，或每日腹腔注射蒸馏水，连续给药10天，共给药10次。第11天乙醚麻醉,脱颈椎处死小鼠。然后用镊子固定小鼠右腋肿瘤生长部位,剪开皮肤,暴露肿瘤,钝性剥离,称重,瘤重以平均值±sdg表示。实验数据采用t检验和方差分析,结果见表1。可以看出，在2nmol/kg剂量下化合物9a-i明显抑制肿瘤生长，活性与剂量比它们高1000倍的阿霉素无统计学差异。这个剂量比发明人曾经公开的3h-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酰-met-aa-obzl(aa选自l-ala,l-val,l-met,l-asp(obzl)残基)的有效剂量100nmol/kg低50倍。本发明有突出的技术效果。

表1化合物9a-i对s180荷瘤小鼠肿瘤生长的影响

a)与生理盐水及化合物9j比p<0.01，与阿霉素比p>0.05；n＝12.

实施例37评价化合物9a-i的抗炎活性

化合物9a-i用生理盐水溶解,单次腹腔注射,剂量为2nmol/kg；阿司匹林用生理盐水溶解,作为阳性对照,单次腹腔注射,剂量为1.11mmol/kg；生理盐水作为空白对照,剂量为10ml/kg。icr雄性小鼠，体重为20±2g，每组12只小鼠。实验前小鼠静息1天，操作间保持室内温度25℃。一次性腹腔注射上述剂量的化合物9a-j或阿司匹林或生理盐水30分钟后，在小鼠的右耳外廓涂0.03ml二甲苯(0.03ml)，2小时后将小鼠乙醚麻醉，颈椎脱臼处死。将小鼠的左、右耳剪下，用直径7mm的打孔器在两耳的相同位置，取圆形耳片，分别称重，求出两圆耳片的重量差作为肿胀度。肿胀度＝右耳圆片重量-左耳圆片重量。实验数据均采用t检验和方差分析，肿胀度以(均值±sdmg)表示。实验结果列入表2。结果表明，在2nmol/kg剂量下化合物9a-i组小鼠的耳肿胀度明显低于空白对照组小鼠的耳肿胀度。说明化合物具有抗炎作用。

表2化合物9a-i的抗炎活性

a)与生理盐水及化合物9j比p<0.01；n＝12。