本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种海洋生物体内半胱氨酸双加氧酶的酶活力的测定方法。
背景技术：
半胱氨酸双加氧酶cod是一种单核非血红素金属蛋白酶，在动物细胞内被发现，在肝细胞内尤其丰富，在新陈代谢和生物转化中起着关键作用。半胱氨酸双加氧酶催化半胱氨酸cys的氧化反应生成半胱亚磺酸，这是半胱氨酸分解代谢过程的第一步，在下一步的氧化过程中生成亚牛磺酸，并进一步转化成牛磺酸。而牛磺酸是一种含硫的非蛋白氨基酸，在动物体内以游离状态存在，是调节机体正常生理活动的活性物质，具有广泛的生理功能，可以增强细胞抗氧化能力、保护心肌细胞、提高神经传导和视觉机能、防止心血管病、改善内分泌状态，在临床上被广泛应用于心血管疾病、糖尿病、消化道疾病、神经系统疾病、眼部疾病等一系列疾病的治疗，在哺乳动物的主要脏器，以及海洋生物，特别是海鱼、贝类中广泛分布。但是动物体内牛磺酸的生物合成途径较为复杂，尤其是相比于哺乳动物，海洋生物体内牛磺酸含量虽然非常丰富，但其合成途径的机理还不清楚。因此以生产牛磺酸主要途径中的半胱氨酸双加氧酶为对象，通过建立快速灵敏的分析方法来评价不同种类海洋生物体内半胱氨酸双加氧酶的活力，对于后续进一步研究海洋生物体内牛磺酸的合成途径具有重要作用，但目前尚未有对半胱氨酸双加氧酶的酶活力的研究。
中国专利cn201410369496x，专利名称一种鱼类组织中三种脱碘酶活性的测定方法，申请日期2014年7月31日，公开了一种利用碘125标记分别与三种脱碘酶相适应的三种底物，经过一段时间孵育后测定脱碘酶脱下的碘离子的放射性强度，经公式计算出脱碘酶的酶活性的方法，以测定三种类型的脱碘酶id1、id2、id3。但是该方法具有特定的适用性，适用于脱碘酶的活力测定，而且测定碘离子的放射性强度对仪器的要求高，因此不适合半胱氨酸双加氧酶的酶活力的测定。
技术实现要素：
针对半胱氨酸双加氧酶对弄清牛磺酸的合成机理具有重要意义，但目前尚未有对半胱氨酸双加氧酶的酶活力的研究问题，本发明的目的在于提供一种海洋生物体内半胱氨酸双加氧酶的酶活力的测定方法，可以准确、简洁、安全的测定海洋生物体内半胱氨酸双加氧酶的酶活力，而且检测成本低，同时也可以用于其他动物体内的半胱氨酸双加氧酶的酶活力的测定，具有普遍适用性。
本发明提供如下的技术方案：
一种海洋生物体内半胱氨酸双加氧酶的酶活力的测定方法，从海洋生物体的组织样品中分离出含半胱氨酸双加氧酶的溶液，在合适的反应条件下将加入的半胱氨酸转化成半胱亚磺酸，测定生成的半胱亚磺酸的量，进而计算半胱氨酸双加氧酶的酶活力。
本发明的海洋生物体内半胱氨酸双加氧酶的酶活力的测定方法中，首先对海洋生物体的组织样品进行处理，分离出含半胱氨酸双加氧酶的溶液，然后以半胱氨酸为底物，向含半胱氨酸双加氧酶的溶液中定量加入半胱氨酸，并经半胱氨酸双加氧酶转化成半胱亚磺酸，通过测定半胱亚磺酸的量计算出半胱氨酸双加氧酶的酶活力，其中酶活力单位u定义为每分钟催化生成1μg的半胱亚磺酸所需的酶量，这样酶活力的计算公式为：ea＝m/t，其中ea指酶活力u，m指半胱亚磺酸的质量μg，t指反应时间min。这样通过转化与半胱氨酸双加氧酶相适应的半胱氨酸，准确、定量的计算出半胱氨酸双加氧酶的酶活力，而且不仅适用于海洋生物，也适用于一般的动物体。
作为本发明方法的一种改进，测定生成的半胱亚磺酸的量包括以下步骤，首先向含半胱亚磺酸的溶液中加入合适的衍生化试剂，然后经高效液相色谱法测定衍生物的浓度。半胱亚磺酸是半胱氨酸在生物体内氧化的中间体，稳定性差，存在时间短，通过衍生化试剂提高半胱亚磺酸的稳定性，提高检测的准确性。
作为本发明方法的一种改进，所述的衍生化试剂经以下过程制备而成：向1ml的甲醇中溶解0.01g的邻苯二甲醛，再加入0.01ml的乙硫醇混合，然后用0.4mol/l的硼酸钠缓冲液定容至10ml得到衍生化试剂。氨基酸的衍生试剂包括异硫氰酸苯酯、单磺酰氯试剂，但是异硫氰酸苯酯毒性高，对色谱柱存在危害，而单磺酰氯试剂的价格昂贵，而邻苯二甲醛则安全、方便、成本低。
作为本发明方法的一种改进，上述的海洋生物体内半胱氨酸双加氧酶的酶活力的测定方法包括以下步骤：
(1)将海洋生物体的组织样品洗净、匀浆、离心并保留上清液；
(2)向定量体积的上清液中加入1～1.2倍体积的半胱氨酸溶液、0.2～0.24倍体积的硫化钠溶液，然后35～39℃下震荡反应1～3h得到反应液，将反应液煮沸灭酶活性5～10min；
(3)向定量体积的反应液中加入等体积的衍生化试剂并加热震荡反应，过滤得到测试液；
(4)经高效液相色谱法建立半胱亚磺酸的浓度与峰面积的标准曲线；
(5)将测试液经高效液相色谱法分析并由步骤(4)中的标准曲线得到半胱亚磺酸的浓度；
(6)由步骤(5)中半胱亚磺酸的浓度计算出半胱氨酸双加氧酶的酶活力。
上清液中的半胱氨酸双加氧酶在硫化钠的存在下将半胱氨酸充分转化成半胱亚磺酸，通过高效液相色谱法建立半胱亚磺酸的浓度与吸光度的标准曲线，进而计算出反应液中转化生成的半胱亚磺酸的量。其中海洋生物包括鱼类、贝类、螺类、虾蟹类、头足类生物，其组织样品包括肉、肝脏、肠、腮等组织。
作为本发明方法的一种改进，步骤(1)中上清液制备过程如下：将海洋生物的组织样品洗净后置于2～3倍体积的磷酸盐缓冲液中浸润，磷酸盐缓冲液的温度为0～8℃，然后经匀浆机匀浆25～35min并在2～6℃下离心分离，离心机转速为8000～10000rpm/min。充分将海洋生物的组织样品中的半胱氨酸双加氧酶分离出来并保持活性。
作为本发明方法的一种改进，步骤(3)中的震荡频率为100～140rpm/min，反应温度35～39℃，反应时间为1～5min，滤膜的孔径为0.22μm。反应时间短会使半胱亚磺酸与衍生化试剂反应不完全，反应时间长则导致半胱亚磺酸的衍生产物分解，造成测试偏差。
作为本发明方法的一种改进，步骤(4)中建立半胱亚磺酸浓度与峰面积的标准曲线包括以下步骤：
步骤一：配制半胱亚磺酸的标准溶液；
步骤二：向半胱亚磺酸的标准溶液中分别添加定量的衍生化试剂并震荡反应得到混合液；
步骤三：将混合液经滤膜过滤后送入高效液相色谱中分析，得到以半胱亚磺酸的浓度为横坐标、峰面积为纵坐标的标准曲线。
选择合适的半胱亚磺酸的标准溶液的浓度，使半胱亚磺酸的浓度与峰面积具有良好的线性关系，得到的线性方程的拟合优度系数不低于0.995。
作为本发明方法的一种改进，半胱亚磺酸的标准溶液经定量的半胱亚磺酸溶于磷酸盐缓冲液中定容制成。与上清液的制备保持一致。
作为本发明方法的一种改进，步骤二中半胱亚磺酸与邻苯二甲醛的摩尔比为0.5～2:1。在该比例范围内的半胱亚磺酸与邻苯二甲醛的衍生反应完全，峰面积好。
作为本发明方法的一种改进，高效液相色谱检测的参数如下：色谱柱为agilenteclipsexdb-c18，流动相为甲醇与0.05mol/l的乙酸钠水溶液，其中甲醇的体积为30％～80％，流动相的流速为0.8～2.0ml/min，波长为315nm。半胱亚磺酸具有良好的分离效果，出峰时间短，为1.3～1.5min，半胱亚磺酸的峰型与相邻峰能够实现完全分离。
本发明的有益效果如下：
本发明的海洋生物体内半胱氨酸双加氧酶的酶活力的测定方法，可以准确、简洁、安全的测定海洋生物体内半胱氨酸双加氧酶的酶活力，而且检测成本低，同时也可以用于其他动物体内的半胱氨酸双加氧酶的酶活力的测定，具有普遍适用性。
具体实施方式
下面就本发明的具体实施方式作进一步说明。
如无特别说明，本发明中所采用的原料均可从市场上购得或是本领域常用的，如无特别说明，下述实施例中的方法均为本领域的常规方法。
实施例1
一种海洋生物体内半胱氨酸双加氧酶的酶活力的测定方法，从海洋生物体的组织样品中分离出含半胱氨酸双加氧酶的溶液，在合适的反应条件下将加入的半胱氨酸转化成半胱亚磺酸，测定生成的半胱亚磺酸的量，进而计算半胱氨酸双加氧酶的酶活力。
测定生成的半胱亚磺酸的量优选包括以下步骤，首先向含半胱亚磺酸的溶液中加入合适的衍生化试剂，然后经高效液相色谱法测定衍生物的浓度，其中衍生化试剂优选经以下过程制备而成：向1ml的甲醇中溶解0.01g的邻苯二甲醛，再加入0.01ml的乙硫醇混合，然后用0.4mol/l的硼酸钠缓冲液定容至10ml得到衍生化试剂。
上述海洋生物体内半胱氨酸双加氧酶的酶活力的测定方法优选包括以下步骤：
(1)将海洋生物体的组织样品洗净、匀浆、离心并保留上清液，优选的上清液制备过程如下：将海洋生物的组织样品洗净后置于2倍体积的磷酸盐缓冲液中浸润，磷酸盐缓冲液的ph值为7.6，磷酸盐缓冲液的温度为0℃，然后经匀浆机匀浆30min并在4℃下离心分离，离心机转速为9000rpm/min；
(2)向定量体积的上清液中加入1倍体积的半胱氨酸溶液、0.2倍体积的硫化钠溶液，然后37℃下震荡反应2h得到反应液，将反应液煮沸灭酶活性5min。其中半胱氨酸溶液的浓度优选50mmol/l，硫化钠溶液的浓度优选为50mmol/l；
(3)向定量体积的反应液中加入等体积的衍生化试剂混合，然后100rpm/min下加热震荡反应3min，反应温度37℃，经0.22μm的滤膜过滤得到测试液；
(4)经高效液相色谱法建立半胱亚磺酸的浓度与峰面积的标准曲线，优选包括以下步骤：
步骤一：配制半胱亚磺酸的标准溶液，优选半胱亚磺酸的标准溶液经定量的半胱亚磺酸溶于磷酸盐缓冲液中定容制成，配制的半胱亚磺酸的标准溶液的浓度依次为：0.005、0.01、0.015、0.025、0.035、0.05、0.1、0.25、0.5，单位μg/ml；
步骤二：向半胱亚磺酸的标准溶液中分别添加定量的衍生化试剂并震荡反应得到混合液，优选的半胱亚磺酸与邻苯二甲醛的摩尔比为0.5:1；
步骤三：将混合液经滤膜过滤后送入高效液相色谱中分析，得到以半胱亚磺酸的浓度为横坐标、峰面积为纵坐标的标准曲线；
(5)将测试液经高效液相色谱法分析并由步骤(4)中的标准曲线得到反应液中半胱亚磺酸的浓度，测试液中半胱亚磺酸的浓度扣除空白对照组的结果即为反应液中半胱亚磺酸的浓度；
(6)由步骤(5)中半胱亚磺酸的浓度计算出半胱氨酸双加氧酶的酶活力。
上述海洋生物体内半胱亚磺酸脱羧酶的酶活力的测定方法优选的高效液相色谱检测的参数如下：色谱柱为agilenteclipsexdb-c18，流动相为甲醇与0.05mol/l的乙酸钠水溶液，其中甲醇所占体积80％，余下为乙酸钠水溶液，流动相的流速为1.0ml/min，波长为315nm。
空白对照组经取相同体积的上清液，按照步骤(2)与步骤(3)的过程处理得到，但在步骤(2)中不加入半胱氨酸溶液。
实施例2
一种海洋生物体内半胱氨酸双加氧酶的酶活力的测定方法，从海洋生物体的组织样品中分离出含半胱氨酸双加氧酶的溶液，在合适的反应条件下将加入的半胱氨酸转化成半胱亚磺酸，测定生成的半胱亚磺酸的量，进而计算半胱氨酸双加氧酶的酶活力。
测定生成的半胱亚磺酸的量优选包括以下步骤，首先向含半胱亚磺酸的溶液中加入合适的衍生化试剂，然后经高效液相色谱法测定衍生物的浓度，其中衍生化试剂优选经以下过程制备而成：向1ml的甲醇中溶解0.01g的邻苯二甲醛，再加入0.01ml的乙硫醇混合，然后用0.4mol/l的硼酸钠缓冲液定容至10ml得到衍生化试剂。
上述海洋生物体内半胱氨酸双加氧酶的酶活力的测定方法优选包括以下步骤：
(1)将海洋生物体的组织样品洗净、匀浆、离心并保留上清液，优选的上清液制备过程如下：将海洋生物的组织样品洗净后置于2.5倍体积的磷酸盐缓冲液中浸润，磷酸盐缓冲液的ph值为7.6，磷酸盐缓冲液的温度为4℃，然后经匀浆机匀浆25min并在2℃下离心分离，离心机转速为8000rpm/min；
(2)向定量体积的上清液中加入1.1倍体积的半胱氨酸溶液、0.22倍体积的硫化钠溶液，然后35℃下震荡反应1h得到反应液，将反应液煮沸灭酶活性7.5min,其中半胱氨酸溶液的浓度优选50mmol/l，硫化钠溶液的浓度优选为50mmol/l；
(3)向定量体积的反应液中加入等体积的衍生化试剂混合，然后120rpm/min下加热震荡反应1min，反应温度35℃，经0.22μm的滤膜过滤得到测试液；
(4)经高效液相色谱法建立半胱亚磺酸的浓度与峰面积的标准曲线，优选包括以下步骤：
步骤一：配制半胱亚磺酸的标准溶液，优选半胱亚磺酸的标准溶液经定量的半胱亚磺酸溶于磷酸盐缓冲液中定容制成,配制的半胱亚磺酸的标准溶液的浓度依次为：0.005、0.01、0.015、0.025、0.035、0.05、0.1、0.25、0.5，单位μg/ml；
步骤二：向半胱亚磺酸的标准溶液中分别添加定量的衍生化试剂并震荡反应得到混合液，优选的半胱亚磺酸与邻苯二甲醛的摩尔比为1:1；
步骤三：将混合液经滤膜过滤后送入高效液相色谱中分析，得到以半胱亚磺酸的浓度为横坐标、峰面积为纵坐标的标准曲线；
(5)将测试液经高效液相色谱法分析并由步骤(4)中的标准曲线得到反应液中半胱亚磺酸的浓度，测试液中半胱亚磺酸的浓度扣除空白对照组的结果即为反应液中半胱亚磺酸的浓度；
(6)由步骤(5)中半胱亚磺酸的浓度计算出半胱氨酸双加氧酶的酶活力。
上述海洋生物体内半胱亚磺酸脱羧酶的酶活力的测定方法优选的高效液相色谱检测的参数如下：色谱柱为agilenteclipsexdb-c18，流动相为甲醇与0.05mol/l的乙酸钠水溶液，其中甲醇所占体积80％，余下为乙酸钠水溶液，流动相的流速为2.0ml/min，波长为315nm。
空白对照组经取相同体积的上清液，按照步骤(2)与步骤(3)的过程处理得到，但在步骤(2)中不加入半胱氨酸溶液。
实施例3
一种海洋生物体内半胱氨酸双加氧酶的酶活力的测定方法，从海洋生物体的组织样品中分离出含半胱氨酸双加氧酶的溶液，在合适的反应条件下将加入的半胱氨酸转化成半胱亚磺酸，测定生成的半胱亚磺酸的量，进而计算半胱氨酸双加氧酶的酶活力。
测定生成的半胱亚磺酸的量优选包括以下步骤，首先向含半胱亚磺酸的溶液中加入合适的衍生化试剂，然后经高效液相色谱法测定衍生物的浓度，其中衍生化试剂优选经以下过程制备而成：向1ml的甲醇中溶解0.01g的邻苯二甲醛，再加入0.01ml的乙硫醇混合，然后用0.4mol/l的硼酸钠缓冲液定容至10ml得到衍生化试剂。
上述海洋生物体内半胱氨酸双加氧酶的酶活力的测定方法优选包括以下步骤：
(1)将海洋生物体的组织样品洗净、匀浆、离心并保留上清液，优选的上清液制备过程如下：将海洋生物的组织样品洗净后置于3倍体积的磷酸盐缓冲液中浸润，磷酸盐缓冲液的ph值为7.6，磷酸盐缓冲液的温度为8℃，然后经匀浆机匀浆35min并在6℃下离心分离，离心机转速为10000rpm/min；
(2)向定量体积的上清液中加入1.2倍体积的半胱氨酸溶液、0.24倍体积的硫化钠溶液，然后39℃下震荡反应3h得到反应液，将反应液煮沸灭酶活性10min,其中半胱氨酸溶液的浓度优选50mmol/l，硫化钠溶液的浓度优选为50mmol/l；
(3)向定量体积的反应液中加入等体积的衍生化试剂混合，然后140rpm/min下加热震荡反应5min，反应温度39℃，经0.22μm的滤膜过滤得到测试液；
(4)经高效液相色谱法建立半胱亚磺酸的浓度与峰面积的标准曲线，优选包括以下步骤：
步骤一：配制半胱亚磺酸的标准溶液，优选半胱亚磺酸的标准溶液经定量的半胱亚磺酸溶于磷酸盐缓冲液中定容制成,配制的半胱亚磺酸的标准溶液的浓度依次为：0.005、0.01、0.015、0.025、0.035、0.05、0.1、0.25、0.5，单位μg/ml；
步骤二：向半胱亚磺酸的标准溶液中分别添加定量的衍生化试剂并震荡反应得到混合液，优选的半胱亚磺酸与邻苯二甲醛的摩尔比为2:1；
步骤三：将混合液经滤膜过滤后送入高效液相色谱中分析，得到以半胱亚磺酸的浓度为横坐标、峰面积为纵坐标的标准曲线；
(5)将测试液经高效液相色谱法分析并由步骤(4)中的标准曲线得到反应液中半胱亚磺酸的浓度，测试液中半胱亚磺酸的浓度扣除空白对照组的结果即为反应液中半胱亚磺酸的浓度；
(6)由步骤(5)中半胱亚磺酸的浓度计算出半胱氨酸双加氧酶的酶活力。
上述海洋生物体内半胱亚磺酸脱羧酶的酶活力的测定方法优选的高效液相色谱检测的参数如下：色谱柱为agilenteclipsexdb-c18，流动相为甲醇与0.05mol/l的乙酸钠水溶液，其中甲醇所占体积80％，余下为乙酸钠水溶液，流动相的流速为0.8ml/min，波长为315nm。
空白对照组经取相同体积的上清液，按照步骤(2)与步骤(3)的过程处理得到，但在步骤(2)中不加入半胱氨酸溶液。
本测定方法的结果
1、偏差
配制3个不同浓度的半胱亚磺酸标样溶液，分别为10μg/ml、100μg/ml、500μg/ml，然后按步骤(3)处理后重复测试3次，测试结果见表1。
表1
此3种浓度的半胱亚磺酸标样rsd分别为3.06％，2.94％和0.84％，说明该方法精密度较高，具有良好的重现性。
2、海洋生物体的测试
选取南美白对虾、梭子蟹、大黄鱼、蛤蜊等具有代表性的四种海洋生物，按本发明的测定方法对其不同组织中半胱氨酸双加氧酶的酶活力进行了检测，结果见表2，其中未检测表示该部分组织无法清楚辨别分离而不能检测。
从表中可以看出不同海洋生物体内的半胱氨酸双加氧酶的酶活力存在较大差别，其中南美白对虾体内的半胱氨酸双加氧酶的酶活力高达32u。另外不同组织中半胱氨酸双加氧酶的酶活力也存在著差异。大黄鱼的肝脏中半胱氨酸双加氧酶的活力明显高于其他组织，而其鳃中半胱氨酸双加氧酶的活力则最低。
表2