硝基还原酶基因lnr及其编码的蛋白和应用的制作方法

本发明属于环境微生物和农业领域，涉及降解二甲戊灵、仲丁灵、氨磺灵和氟乐灵的硝基还原酶基因lnr及其编码的蛋白和应用。

背景技术

随着对粮食产量要求的提高，在世界范围内的化学除草面积也逐渐扩大，除草剂的施用量也居高不下。除草剂的使用可减轻农业劳动强度、保证农业正常生产甚至高产，但是长期以来大量除草剂的使用也不可避免地产生了负面影响：土壤、地下水和空气中的农药污染；在某些作物中残留；对人体健康的潜在危害。大量研究表明微生物降解是农药在环境中消失的最主要因素，且微生物降解修复技术是一种原位生物修复技术，效果好，费用低，无二次污染，适合大面积污染修复，是土壤有机污染物修复技术的主流和发展方向。

二硝基苯胺类除草剂是一类优秀的旱田作物选择性除草剂,在化学除草中占有重要地位，主要品种包括二甲戊灵、仲丁灵、氨磺灵和氟乐灵。它们具有广谱的除草活性，应用范围广、用量大，在土壤中具有中度持久性，半衰期为2-3个月。据相关资料显示，在美国近几年的大豆除草剂施用种类调查中，二甲戊灵和氟乐灵的使用量仅次于草甘膦。现已发现该类除草剂的残留对生态环境、水生生物及人体健康都有潜在危害。

目前，国内外已筛选到很多能降解二甲戊灵、仲丁灵、氨磺灵和氟乐灵的细菌和真菌菌株，并利用hplc、gc和ms等方法鉴定了降解中间产物，并根据中间产物的鉴定推测了微生物降解的部分代谢途径。研究表明微生物降解二硝基苯胺类除草剂的主要方式有氧化n端脱烷基和硝基还原作用，但至今微生物降解二硝基苯胺类除草剂的全过程还不清楚，且参与其中的降解基因/酶还鲜有报道。bacillussubtilisy3是一株二甲戊灵高效降解菌株，采用hplc-ms/ms鉴定了菌株y3降解二甲戊灵生成的中间产物为2-硝基-6-氨基-n-(1-乙基丙基)-3,4-二甲苯胺(6-氨基二甲戊灵)。对菌株y3基因组框架图进行分析发现，菌株y3中有很多nitroreductases-like的orfs，因此不采用异源表达的方法分别对各个基因进行功能鉴定，转而通过菌株粗酶液蛋白纯化的方法获得了二甲戊灵硝基还原酶pnr。pnr是首个报道的二甲戊灵硝基还原酶，同时它还能催化还原仲丁灵、氨磺灵和氟乐灵的两个硝基基团。

获得二甲戊灵、仲丁灵、氨磺灵和氟乐灵降解代谢菌株和降解基因/酶在治理其残留，消除其药害中具有以下作用：(1)通过现代生物技术将降解基因导入作物构建相应的除草剂抗性转基因作物；(2)通过现代微生物发酵技术将降解菌株和基因制成降解菌剂或酶制剂实现土壤原位修复。终上所述，二甲戊灵、仲丁灵、氨磺灵和氟乐灵的降解基因/酶在消除该类除草剂药害及生物转化领域中具有非常重要的理论和应用价值。

技术实现要素：

本发明的目的是针对现有研究的不足，提供一种降解二甲戊灵、仲丁灵、氨磺灵和氟乐灵硝基还原酶基因。

本发明的另一目的是提供该基因编码的蛋白。

本发明的又一目的是提供该基因的应用。

一种硝基还原酶基因lnr，核苷酸序列为seqidno.1。

本发明所述的硝基还原酶基因lnr编码的硝基还原酶lnr，氨基酸序列为：seqidno.2。

含有本发明所述的硝基还原酶基因lnr的重组表达载体。

含有本发明所述的硝基还原酶基因lnr的基因工程菌。

本发明所述硝基还原酶基因lnr在构建降解二甲戊灵、仲丁灵、氨磺灵和氟乐灵的转基因作物中的应用。

本发明所述硝基还原酶基因lnr在降解二甲戊灵、仲丁灵、氨磺灵和氟乐灵中的应用。

本发明所述硝基还原酶lnr在降解二甲戊灵、仲丁灵、氨磺灵和氟乐灵中的应用。

本发明所述硝基还原酶lnr在去除土壤、水体中二甲戊灵、仲丁灵、氨磺灵和氟乐灵的应用。

本发明所述的重组表达载体在降解二甲戊灵、仲丁灵、氨磺灵和氟乐灵中的应用。

本发明所述的重组表达载体在构建降解二甲戊灵、仲丁灵、氨磺灵和氟乐灵的转基因作物中的应用。

有益效果：

本发明硝基还原酶基因lnr是继硝基还原酶基因pnr后再次公开的能降解二甲戊灵、仲丁灵、氨磺灵和氟乐灵的降解基因。本发明提供的硝基还原酶lnr能在10min内降解100mg/l的二甲戊灵、仲丁灵、氨磺灵或氟乐灵。与pnr相同，lnr能催化还原二甲戊灵苯环c-6位上的硝基基团，也能催化还原仲丁灵、氨磺灵和氟乐灵苯环上两个对称的硝基基团，但它的催化效率明显高于pnr。此外，lnr还能催化转化二苯醚类除草剂乙羧氟草醚，而pnr不能催化还原该除草剂，且lnr与pnr的蛋白氨基酸序列相似性仅为40％，这说明lnr是不同于pnr的又一新的催化效率更高的催化还原二甲戊灵、仲丁灵、氨磺灵和氟乐灵的硝基还原酶。因此，硝基还原酶基因lnr在构建降解二甲戊灵、仲丁灵、氨磺灵和氟乐灵转基因作物中有潜在应用价值，硝基还原酶蛋白lnr在降解二甲戊灵、仲丁灵、氨磺灵和氟乐灵中应用前景良好。且lnr具有更广谱的底物谱，在消除硝基芳烃除草剂残留引起的环境污染修复方面具有更广阔的应用前景。

附图说明

图1表达产物pnr的native-page凝胶电泳检测。箭头指处为透明条带的位置。

图2蛋白质肽指纹图谱分析结果，下划线字体的肽段序列表示分析结果得到的肽段与lnr氨基酸序列的吻合部分。肽指纹图谱分析所得的肽段氨基酸序列在lnr氨基酸序列中的覆盖率为5％。

图3lnr与催化功能已鉴定报道的硝基还原酶的蛋白氨基酸序列系统发育进化分析。

图4ni²⁺-ntaresin纯化异源表达蛋白lnr。1为蛋白电泳marker，2为pnr，3为lnr。

图5lnr催化还原二甲戊灵的产物uhplc-ms鉴定。a，二甲戊灵的uhplc-ms分析图谱，rt＝9.06min；b，lnr还原二甲戊灵的产物2-硝基-6-氨基-n-(1-乙基丙基)-3,4-二甲苯胺的uhplc-ms分析图谱，rt＝8.50min。

图6lnr催化还原仲丁灵的产物uhplc-ms鉴定。a，仲丁灵的uhplc-ms分析图谱，rt＝9.20min；b，lnr还原仲丁灵一个硝基基团的产物4-(1,1-二甲基乙基)-n-(1-甲基丙基)-6-硝基-1,2-苯二胺的uhplc-ms分析图谱，rt＝8.84min；c，lnr还原仲丁灵两个硝基基团的产物4-(1,1-二甲基乙基)-n-(1-甲基丙基)-1,2,6-苯三胺的uhplc-ms分析图谱，rt＝5.30min。

图7lnr催化还原氨磺灵的产物uhplc-ms鉴定。a，氨磺灵的uhplc-ms分析图谱，rt＝7.95min；b，lnr还原氨磺灵一个硝基基团的产物3-硝基-5-氨基-n’,n’-二丙基磺胺的uhplc-ms分析图谱，rt＝7.59min；c，lnr还原氨磺灵两个硝基基团的产物3,5-二氨基-n’,n’-二丙基磺胺的uhplc-ms分析图谱，rt＝6.07min。

图8lnr催化还原氟乐灵的产物uhplc-ms鉴定。a，氟乐灵的uhplc-ms分析图谱，rt＝9.16min；b，lnr还原氟乐灵一个硝基基团的产物α,α,α-三氟-2-氨基-6-硝基-n,n-二丙基对甲苯胺的uhplc-ms分析图谱，rt＝9.05min；c，lnr还原氟乐灵两个硝基基团的产物α,α,α-三氟-2,6-二氨基-n,n-二丙基对甲苯胺的uhplc-ms分析图谱，rt＝8.30min。

图9硝基还原酶lnr催化还原二甲戊灵、仲丁灵、氨磺灵和氟乐灵。

图10lnr催化转化乙羧氟草醚的hplc检测图谱。a，乙羧氟草醚的hplc检测图谱，rt＝7.28min；b，lnr催化还原乙羧氟草醚的hplc检测图谱，催化产物rt＝6.23min。

生物材料保藏信息

y3，分类命名为bacillussp.y3，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏时间2015年10月28号，保藏编号cctccno：m2015647。

具体实施方式

实施例1硝基还原酶基因lnr的克隆

1.1orf01036的获取

通过对菌株y3粗酶液进行蛋白纯化与纯化蛋白的肽指纹图谱分析，并结合菌株基因组信息分析的方法成功地在菌株y3中克隆到二甲戊灵硝基还原酶基因pnr。对pnr进行了功能验证和酶学特性分析，其中就包括使用含有二甲戊灵的native-page凝胶电泳对经ni²⁺-ntaresin纯化的pnr进行活性检测，观察凝胶上是否会出现透明条带。具体实施如下：

1.将纯化后pnr用超滤管(截留量10kda)浓缩，取30μl浓缩后的蛋白酶液加入等体积的2×native-page上样缓冲液混匀待用。

2.native-page凝胶的制备过程中加入终浓度为50mg/l的二甲戊灵，作为酶活检测的标记。因为二甲戊灵自身呈明黄色，蛋白酶作用反应过后胶块上能出现无色透明条带，因此胶块中加入二甲戊灵可作为酶活检测标记。

(酸性)蛋白native-page胶工作液的配制：

4×分离胶缓冲液(1.5mtris-hcl，ph8.8)：18.2gtrisbase溶于80ml水，用浓hcl调ph8.8，加水定容到100ml，4℃贮存；

4×堆积胶缓冲液(0.5mtris-hcl，ph6.8)：6.0gtrisbase溶于80ml水，用浓hcl调ph6.8，加水定容到100ml，4℃贮存；

10×电泳缓冲液(ph8.8tris-gly):30.3gtrisbase，144g甘氨酸，加水定容到1l，4℃贮存；

2×溴酚蓝上样缓冲液:1.25mlph6.8,0.5mtris-hcl，3.0ml甘油，0.2ml0.5％溴酚蓝，5.5mldh2o；-20℃贮存；

10％aps。

3.蛋白非变性胶在4℃环境中上样电泳。

4.电泳结束后，取下蛋白非变性胶放入100mmtris-hcl缓冲液(ph7.5)中，加入0.5mmnadh，30℃放置30min。观察蛋白非变性胶上是否出现透明条带。

结果显示明黄色的native-page凝胶上出现了透明条带(图1)，将此透明条带切下，送去上海博苑生物科技有限公司进行肽指纹图谱分析。分析结果得到的肽段氨基酸序列在菌株y3全基因组中注释的蛋白数据库中进行比对分析，得到2个蛋白，一个为pnr，另一个蛋白为orf01036，该orf在基因组信息中也注释为硝基还原酶，肽指纹图谱分析结果得到的肽段氨基酸序列在orf01036氨基酸序列中的覆盖率仅达5％(图2)。对orf01036进行碱基序列分析该基因总长609bp，编码202个氨基酸，将此硝基还原酶基因命名为lnr，核苷酸序列见seqidno.1，其编码氨基酸序列见seqidno.2。

在ncbi蛋白数据库(theuniprotknowledgebase/swissprotdatabases)中进行blastp在线比对分析，在催化功能已鉴定报道的硝基还原酶中，与本发明lnr氨基酸序列相似性最高(仅40％)的是来源于同一菌株y3中的二甲戊灵硝基还原酶pnr；此外，lnr与来源于lactobacillusplantarumwcfs1的硝基苯甲酸硝基还原酶pnba(genbank登录号为yp004888132)和来源于synechocystissp.的醌还原酶drga(genbank登录号为q55233)的氨基酸序列相似性均为29％，与vibriofischeri的nad(p)h-flavin氧化还原酶frasei(genbank登录号为p46072)氨基酸序列相似性达到28％，与pseudomonasputida的nad(p)h依赖型的氧化还原酶pnra(genbank登录号为wp010953425)和helicobacterpylori的nad(p)h依赖型硝基还原酶rdxa(genbank登录号为np207746)有25％的氨基酸序列性。以lnr为研究对象对其进行功能验证。在线下载与lnr有氨基酸序列相似性且催化功能已鉴定报道的硝基还原酶蛋白氨基酸序列，使用clustalx(version2.1)对蛋白氨基酸序列进行比对分析，导入megaversion5.0中，采用neighbor-joining法构建lnr的氨基酸序列系统发育进化树，结果见图3。

1.2细菌基因组总dna的提取

菌株y3基因组总dna采用高盐结合ctab法进行提取，基因组总dna溶于te缓冲液(ph8.0)，-20℃保存。

1.3pet29a(+)-lnr细菌表达载体的构建

1.3.1pcr扩增lnr基因

根据lnr的核苷酸序列，设计正向引物：5′-ggaattccatatgacgaatactctggatgtttta-3′(seqidno.3，下划线为ndei酶切位点)；反向引物5′-ccgctcgagttacagccaagttgatacttttgaa-3′(seqidno.4，下划线为xhoi酶切位点)。以菌株y3基因组dna为模板扩增lnr基因。

扩增体系为：

pcr扩增程序：

98℃变性3min；98℃变性10s，58℃退火10s，72℃延伸15s，进行30个循环；冷却到室温。

1.3.2lnr片段和pet29a(+)的双酶切

酶切体系：ndei4μl，xhoi4μl，10×hloadingbuffer10μl，dna≤2μg，灭菌的mili-q水加至100μl。混匀后37℃水浴酶切反应12h，加入ndei和xhoi各1μl，继续酶切2-6h。产物用0.75％的琼脂糖凝胶电泳进行切胶回收。

1.3.3酶连与转化

将1.3.2中纯化回收得到的两个片段进行酶连，酶连产物转化至e.coli表达宿主菌bl21(de3)中获得lnr重组表达菌株bl21(de3-petlnr)。

1.4lnr在e.colibl21(de3-petlnr)中的表达及表达产物纯化

重组表达菌株转接到4ml液体lb(含100mg/lkan)试管，待菌株长至对数中期时，再将培养液转接(接种量3％，v/v)至100mllb(含100mg/lkan)培养基中培养至od600为0.6-0.8，加0.3mmiptg，30℃诱导4h。离心，收集菌体，用20ml柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液(20mm，ph6.0)重悬菌体，超声破碎5min，离心，收集上清，用ni²⁺-ntaresin对表达产物进行纯化，sds-page蛋白电泳检测纯化效果，条带大小和理论预测的大小(22.3kda)相一致(图4)。

1.5lnr功能鉴定

酶活反应体系(1.0ml)：20mm柠檬酸钠缓冲液(ph6.0)，100mg/l二甲戊灵(仲丁灵、氨磺灵或氟乐灵)，1.0mmnadh，1.0mmmg²⁺，反应酶量(1.4中纯化所得)200μl，35℃反应10min。每个反应以加入酶开始计时，10min后加入等体积的二氯甲烷震荡混匀静置，终止反应。有机层用无水硫酸钠除去多余的水分，氮气吹干，甲醇重悬，接着用孔径为0.22μm的有机相滤头过滤后进行uhplc-ms检测各底物及其代谢产物。一个酶活力单位(u)定义为：在ph6.0，温度35℃条件下，每分钟催化减少1nmol底物所需的酶量。

降解试验表明lnr能在10min内催化还原100mg/l的二甲戊灵、仲丁灵、氨磺灵或氟乐灵，uhplc-ms检测分析表明lnr能催化还原二甲戊灵苯环c-6位上的硝基基团，同时还能催化还原仲丁灵、氨磺灵和氟乐灵苯环上两个对称的硝基基团(图5-9)。酶学试验表明lnr对二甲戊灵、仲丁灵、氨磺灵和氟乐灵的比酶活分别为42.48u/mgprotein、51.33u/mgprotein、33.59u/mgprotein、25.66u/mgprotein，这说明lnr的催化效率比pnr更高。

1.6lnr对其他硝基芳烃除草剂的催化还原

采用1.5中所述的酶活反应体系，分别加入100mg/l五氯硝基苯、乙羧氟草醚和吡虫啉起始酶活反应，10min后加入等体积的二氯甲烷震荡混匀静置，终止反应。有机层用无水硫酸钠除去多余的水分，氮气吹干，甲醇重悬，使用0.22μm的有机相微孔滤头过滤后进行hplc检测各底物及其代谢产物。

降解试验表明硝基还原酶lnr和pnr均不能催化还原五氯硝基苯和吡虫啉，且pnr不能催化转化二苯醚类除草剂乙羧氟草醚，而lnr能催化转化该除草剂(图10)，这表明lnr在催化功能上也不同于pnr，具有更广谱的底物谱，在消除除草剂残留引起的环境污染修复方面具有更广阔的应用前景。

<110>南京农业大学

<120>硝基还原酶基因及其编码的蛋白和应用

<160>4

<210>1

<211>609

<212>dna

<213>芽孢杆菌y3（bacillussubtilisy3）

<223>硝基还原酶基因lnr

<400>1

atgacgaatactctggatgttttaaaagcacgtgcatctgtaaaggaatatgatacaaat60

gccccgatctctaaggaggagctgactgagctattagaccttgccgctaaagcgccttcc120

gcttggaaccttcagcattggcattttacagtattccacagcgatgaatcaaaagcggag180

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tggctgtaa609

<210>2

<211>202

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<213>芽孢杆菌y3（bacillussubtilisy3）

<223>硝基还原酶lnr

<400>2

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195200

<210>3

<211>34

<212>dna

<213>人工合成

<223>硝基还原酶基因lnr扩增的正向引物

<400>3

ggaattccatatgacgaatactctggatgtttta34

<210>4

<211>34

<212>dna

<213>人工合成

<223>硝基还原酶基因lnr扩增的反向引物

<400>4

ccgctcgagttacagccaagttgatacttttgaa34