杂交瘤细胞株A4-1B1及其产生的降钙素原单克隆抗体和应用的制作方法

本发明涉及单克隆抗体领域，尤其涉及杂交瘤细胞株a4-1b1及其产生的降钙素原单克隆抗体和应用。
背景技术：
降钙素原pct是一种蛋白质，当机体发生严重的细菌、真菌、寄生虫或脓毒症及多脏器功能衰竭时，pct在血浆中的水平显著升高，pct目前已成为临床全身性细菌感染诊治过程中必不可少的检测项目之一。正常情况下，主要局限于甲状腺和肺的神经内分泌细胞表达并裂解成降钙素ct，脓毒血症及促炎症细胞因子可诱导全身各种组织多种类型细胞表达和释放pct并进入血液循环系统。pct在细胞内毒素的诱导下，2-6小时即可迅速增加，12-48小时达到峰值，对细菌感染具有高度特异性和灵敏性，而且不受免疫系统疾病和化疗或免疫抑制剂的使用的影响，可以说是目前最好的“脓毒症指标”。pct在血清、全血和血浆中非常稳定，对脓毒症的诊断、预后评估及治疗监测，pct都体现出最优异的性能。pct与传统的crp、il-6等炎性指标相比体现出更具优势的诊断灵敏度和特异性。目前精准的pct临床诊断方法有罗氏的化学发光法，灵敏度高、特异性强，但其成本高，仅在三甲医院得到较多应用，中小医院目前难以普及。研究表明荧光免疫层析法比酶联免疫法检测pct具有更高的特异性和灵敏度，分析性能基本能满足临床检测需求，且其操作简单，无需昂贵的仪器设备，无需专业人员，耗时短，是临床pct检测的理想选择。本发明提供的有效的、特异性结合pct的抗体可用于荧光免疫层析平台中，对实现pct快速检测和床边检测具有重要意义。降钙素原pct已成为败血症检测的有效及可靠的标志物，且目前pct检测应用越来越广泛。pct抗原含116个氨基酸，编码三个蛋白：氨基降钙素原(n-proct)，降钙素(calcitonin，ct)及钙抑肽。正常情况下，人体血清中pct水平很低，大多低于0.1ng/ml，健康人体中也存在一定水平的ct。但目前市面上检测试剂盒中的pct抗体针对的是整个pct抗原，得到的pct抗体可能会结合血清中的ct从而导致假阳性的发生，且现有抗体检测灵敏度低，这些均影响临床检测水平。技术实现要素：为解决上述技术问题，本发明提供了杂交瘤细胞株a4-1b1，以及由该细胞株产生的降钙素原单克隆抗体和应用。本发明提供的抗体特异性高，反应灵敏，成本低，适合大规模应用于临床检测试剂盒中。本发明提供的杂交瘤细胞株a4-1b1，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctccno:c2017144，保藏时间为2017年9月21日，保藏地点为湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学。本发明还提供了一种鼠源性抗降钙素原单克隆抗体，所述抗体由保藏编号为cctccno:c2017144的杂交瘤细胞株a4-1b1分泌产生，识别抗原为pct抗原。本发明还提供了降钙素原单克隆抗体在免疫测定方法中的应用，包括在流式细胞技术、elisa免疫测定法、免疫层析测定法、免疫细胞化学染色测定法和免疫组化染色测定法等方面的应用。本发明还提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括上述降钙素原单克隆抗体。本发明还提供了一组配对抗体，所述配对抗体由上述杂交瘤细胞株a4-1b1所产生的抗体和杂交瘤细胞株a4-6a2所产生的抗体组成，所述杂交瘤细胞株a4-6a2保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctccno:c2017143，保藏时间为2017年9月21日，保藏地点为湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学。上述配对抗体可以应用在免疫测定方法中，所述免疫测定方法包括流式细胞技术、elisa免疫测定法、免疫层析测定法、免疫细胞化学染色测定法和免疫组化染色测定法。本发明还提供一种试剂盒，所述试剂盒包含上述配对抗体。本发明提供的高特异性识别降钙素原单克隆抗体，应用在免疫荧光和流式细胞技术方面，能够对感染细胞进行检测，并可反映感染的活跃状态。本发明中pct单克隆抗体的获得为荧光免疫诊断方法提供了重要的特异性原材料，对pct荧光免疫层析试剂盒的开发具有重要的意义。本发明提供的抗pct单克隆抗体1b1和6a2是经双抗体夹心法筛选出的最优配对抗体，与购买的商品化单抗比较，具有更高的灵敏度。有望在elisa、化学发光、免疫层析技术平台得到应用，为临床诊断试剂盒的开发打下良好的基础。附图说明图1是westernblot鉴定杂交瘤细胞株1b1分泌的pct抗体的抗原识别位点图；图2是以6a2抗体做包被抗体、以1b1抗体做标记抗体、制备而成的荧光免疫层析定量检测试剂盒的检测数据的线性回归方程图；图3是6a2抗体和1b1抗体制备的pct定量检测试剂盒与万孚试剂盒的相关性分析图；图4是单链抗体重链和轻链可变区基因电泳图。具体实施方式下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。本说明书实施例中所涉及病毒、细胞株等术语及试剂说明如下：实施例1：pct单克隆抗体的获得制备抗pct单克隆抗体按如下步骤进行：1.免疫原的制备：从ncbi中得到pct的蛋白序列，经原核表达密码子优化后合成基因序列，连接至原核表达载体pet41a中，经iptg诱导表达。菌体经超声破碎后离心取上清，过镍亲和柱、gst柱，纯化得到的蛋白作为免疫原免疫小鼠。2.抗原免疫小鼠，制备抗pct单克隆抗体，具体实施方式如下：用上述纯化的蛋白pct免疫小鼠，制备单克隆抗体。具体步骤如下：用纯化后的免疫原对小鼠进行初次免疫及两次加强免疫，制备小鼠脾脏细胞，并将其与处于生长对数期的小鼠骨髓瘤细胞sp2/0进行融合，获得杂交瘤细胞。上述所得杂交瘤细胞经过有限稀释法进行单克隆，再通过间接elisa筛选出阳性单克隆细胞株。单克隆后的细胞注射入弗氏不完全佐剂预处理小鼠腹腔，诱导产生腹水。共获得127株单克隆抗体细胞株。3.间接elisa测所得腹水效价3.1效价测定抗原pct用碳酸盐包被液稀释后包被96孔板，100ng/孔，37℃热孵2h，孵育完毕后pbs-t洗板1次。加入单克隆抗体，37℃孵育30min，设置阴性对照孔、阳性对照孔(3a2)及空白对照(抗体稀释液)。孵育完毕后，pbs-t洗板5次。酶标稀释液将hrp标记抗体(羊抗鼠igg-hrp)稀释1000倍，每孔100μl。37℃孵育30min。孵育完毕后，pbs-t洗板5次。显色a液：显色b液＝1:1，现配现用。每孔100μl，37℃孵育15min；加入终止液，50μl/孔，终止显色反应，检测吸光度，筛选出来的12株腹水效价测定结果如下，所得腹水效价均约46，结果见表1，表1为筛选出来的12株腹水效价测定结果。由表1中数据可以看出，腹水经400万倍稀释后已经基本消除非特异性反应，结果显示1：400万倍稀释后所述抗体1b1与抗原pct反应依然呈现较高的吸光度值，表明该抗体具有较高的灵敏度和特异性，具体数值详见表1。表1a4腹水稀释度1∶1万1∶5万1∶10万1∶50万1∶100万1∶200万1∶400万空白1b12.2772.0671.9011.7341.5131.210.9080.0099c22.1951.9811.8181.6381.4251.1680.8010.0041a21.2761.1850.7990.6090.4060.2480.1560.0053a21.3231.1430.9140.6640.4630.2820.1550.0068c31.4141.2971.1931.1180.8370.6680.4210.0086a22.2932.0331.9291.8431.6941.481.2110.0041a31.3831.2861.231.080.9290.7240.5030.0083a61.211.0360.830.5280.3540.2540.1790.0079b11.0130.7830.5380.3360.1910.1030.0750.0023.2灵敏度测定将筛选的12株腹水浓度调整至1mg/ml，与商品化抗体(均为lmg/m1)a(重庆艾令达)/b(hytestltd)/c(上海生工)同时对不同稀释浓度抗原做间接elisa检测灵敏度。具体操作如下：抗原pct用碳酸盐包被液稀释后包被96孔板，100ng/孔，做5个梯度稀释，37℃热孵2h，孵育完毕后pbs-t洗板1次。加入单克隆抗体，37℃孵育30min，设置空白对照(抗体稀释液)。孵育完毕后，pbs-t洗板5次。酶标稀释液将hrp标记抗体(羊抗鼠igg-hrp)稀释1000倍，每孔100μl。37℃孵育30min。孵育完毕后，pbs-t洗板5次。显色a液：显色b液＝1：1，现配现用。每孔100μl，37℃孵育15min；加入终止液，50μl/孔，终止显色反应，检测吸光度，结果见表2，表2为显色反应后吸光度的结果表，从结果可以看出1b1和6a2的腹水灵敏度高于购买的商品化单抗。表2抗原信比稀释100ng/孔50ng/孔25ng/孔12.5ng/孔6.25ng/孔3.125ng/孔空白a(1mg/ml)1.1120.8480.5710.4280.3210.1780.005b(1mg/ml)1.261.1020.8520.6170.4220.2580.005c(1mg/ml)1.0580.8830.4840.3410.2060.1410.0021811.5691.4041.2771.2171.1441.0030.0059c21.5581.4011.2941.1040.9650.7480.0051a21.2380.9460.6740.4040.2240.10603a21.2051.0390.8360.5390.3540.2540.0098c31.491.3441.2821.0370.9010.6370.0216a21.6351.5161.371.2411.1620.9310.0081a31.2761.1780.7950.6040.4040.2430.0063a61.3191.1430.9180.6690.4680.280.0069b11.4151.2931.1871.1160.8440.6690.0043.3特异性检测分别包被pct和ct抗原，采用竞争elisa法检测1b1和6a2抗体对ct的交叉反应，以此检测抗体特异性。具体操作如下：抗原用碳酸盐包被液稀释后包被96孔板，100/50ng每孔，37℃热孵2h，孵育完毕后pbs-t洗板1次。加入单克隆抗体，37℃孵育30min，空白对照(抗体稀释液)。孵育完毕后，pbs-t洗板5次。酶标稀释液将hrp标记抗体(羊抗鼠igg-hrp)稀释1000倍，每孔100μl。37℃孵育30min。孵育完毕后，pbs-t洗板5次。显色a液：显色b液＝1:1，现配现用。每孔100μl，37℃孵育15min；加入终止液，50μl/孔，终止显色反应，检测吸光度，结果见表3，表3为竞争elisa法检测1b1抗体特异性的结果。结果表明1b1和6a2等三株抗体与ct不发生交叉反应，只特异性针对pct的两端抗原序列。因此，在临床应用中可以避免抗体与ct反应，减少假阳性结果。表3实施例2：双抗夹心法筛选最优pct配对抗体并与进口抗体进行对比我们将我们得到的127株单克隆抗体细胞株进行复苏，制备单克隆抗体，辛酸法纯化，hrp标记，用棋盘交叉法筛选配对抗体，以临床pct阳性混合血清为检测抗原，筛选出最佳配对抗体对。具体操作如下：包被抗体6a2及标记抗体1b1。与商品化抗体对16b3(包被)/42(标记)(购自hytestltd)，grl1-2(购自格瑞林)，nem1-2(购自诺尔曼)比较：包被抗体100μl/孔，包被量100ng，37℃孵育2h，pbs-t洗板一次；临床pct阳性混合血清倍比稀释后按100ul/孔加入，设置空白对照孔，37℃孵育30min，孵育完毕后pbs-t洗板5次。加入经酶标稀释液稀释1000倍的hrp标记抗体1b1-hrp及42-hrp，100ul/孔，37℃孵育30min，洗板5次。显色：显色液a:b按1:1现配现用，100μl/孔加入，37℃孵育30min，孵育完毕后按50μl/孔加入终止液。置于酶标仪上检测吸光度，检测结果见表4，表4为双抗夹心法筛选最优pct配对抗体并与商品化抗体的对比结果。由表4可以看出同样条件下6a2/1b1比现有的三种商品化配对pct抗体(对照)均具有更高的灵敏度。表4实施例3：westernblot鉴定所述抗体的抗原识别位点将pct分成3段pct-1/2/3，对应的氨基酸序列如下所示：pct-1：apfrsalesspadpatlsedearlllaalvqdyvqmkaseleqeqeregssldsprskrpct-2，cgnlstcmlgtytqdfnkfhtfpqtaigvgappct-3：gkkrdmssdlerdhrphvsmpqnan杂交瘤细胞株6a2分泌抗体识别pct-1段抗原识别序列，杂交瘤细胞株1b1分泌抗体识别pct-3段抗原识别序列。将pct3段pct-1/2/3分别连接至pet41a，筛选出重组质粒pet41a/pct-1、pet41a/pct-2、pet41a/pct-3，并分别转化bl21(de3)gold进行原核表达；3ml表达菌用600μl裂解液(20mmpb，ph7.8-8.0)重悬，冰浴10min；0.3cm探头超声波破菌，循环8次(超声2s+停2s)，上述循环重复4次；最大速度10000rpm离心10min，转移上清至一干净的离心管中，分别取样(每种点样2孔)跑sds-page电泳，转膜；37℃封闭半小时，将膜剪成条，分别用将单抗1b1在37℃下孵育2小时，tbs-t洗涤15分钟，期间换液3次，羊抗鼠igg-hrp于37℃孵育1.5小时，tbs-t洗涤15分钟，期间换液2-3次；显影：膜置于凝胶成像仪上，再将化学发光显色剂a+b混合液加在膜表面，拍照，wb结果见图1，图1是westernblot鉴定杂交瘤细胞株1b1分泌的pct抗体的抗原识别位点图。从图1可以看出单抗6a2特异性识别抗原片段pct-1，单抗1b1特异性识别抗原片段pct-3。此实验进一步证明所述抗体与ct不发生交叉反应，只特异性针对pct的两端抗原序列，在临床应用中可以避免抗体与ct反应，减少假阳性结果。实施例4：用6a2和1b1抗体制成的试剂盒对临床样本测试试验用上述6a2抗体做包被抗体，1b1抗体做标记抗体，制备成荧光免疫层析定量检测试剂盒，在最低检出限、准确度、线性、重复性和批间差这几个方面对临床样本检测；同时与万孚检测的同类型荧光免疫层析定量检测试剂盒进行平行对比，结果表明用本发明两种单抗制备的降钙素原荧光免疫层析法定量检测试剂盒与万孚同类型产品检测结果一致性好；并且检测结果显示其灵敏度高，最低检出限≤0.05ng/ml；准确度较好，相对偏差都在±15％内；线性效果结果显示，在试剂盒标示的检测范围内具有良好的线性梯度关系(r＝0.999)；重复性好，三种浓度参考品变异系数分别为6.73％，12.5％和9.38％，都≤15％。由此可看出自制的降钙素原荧光免疫层析定量检测试剂盒性能符合相关技术要求。具体如下：1.最低检出限取同一批号的试剂20份及参考品基质(不含降钙素原的人血清)，各取20μl，加到样品处理液中，吹打混匀，静置1min，吸取75μl混合液，上样，反应15min，上机检测。收集并判定结果，计算参考品测定结果均值和标准偏差sd，其中(+2sd)的结果对应的浓度为最低检出限。表5为本发明配对抗体制备的试剂盒最低检出限结果，根据表5中检测数据计算出信号均值为0.110，标准偏差为0.0110，得出(x+2sd)＝0.132，将其代入拟合曲线进行回归，算出浓度值为0.01ng/ml，满足降钙素原荧光试剂盒灵敏度的技术要求；表6为其他三个厂家配对抗体制备的试剂盒最低检出限结果，由表5和表6的结果，可以看出且同样条件下其检出限比三对商品化配对抗体制备的试剂盒(medixbiochemica、菲鹏生物、杭州华葵生物)的检出限均高。表5表62.准确度检测取0.5ng/ml、10.0ng/ml、50.0ng/ml，3个浓度的参考品，移液枪吸取待检测的参考品20μl，加到样品处理液中，吹打混匀，静置1min，吸取75ul混合液，上样，反应15min，上机检测，每个样品重复测定3次，测试结果记为(xi)，分别计算相对偏差(bi)，结果见表7，表7为试剂盒准确度的详细检测数据。由表7可以得出，9条试纸条的相对偏差bi都±15％内，满足降钙素原荧光试剂盒的准确度技术要求。表73.线性结果取0.5ng/ml、2.0ng/ml、5.0ng/ml、10.0ng/ml、50.0ng/ml、100.0ng/ml5种浓度的参考品，移液枪吸取待检测的参考品20μl，加到样品处理液中，吹打混匀，静置1min，吸取75ul混合液，上样，反应15min，上机检测，每个浓度水平重复检测3次，取3次结果的均值，做理论浓度值与实际检测值两者的对数散点图，作拟合曲线，计算出直线方程y＝ax+b,以及相关系数r，实验结果见表8，表8为以6a2抗体做包被抗体、以1b1抗体做标记抗体、制备而成的荧光免疫层析定量检测试剂盒的线性检测结果，计算得出相关系数r＝0.9999，满足线性要求。图2为以6a2抗体做包被抗体、以1b1抗体做标记抗体、制备而成的荧光免疫层析定量检测试剂盒的检测数据的线性回归方程图。结果显示本发明的抗体制备的试剂盒具有良好的线性结果，说明所述抗体制备的试剂盒具有良好的稳定性。表84.精密度实验取0.5ng/ml、2.0ng/ml、10.0ng/ml3种浓度的参考品，移液枪吸取待检测的参考品20μl，加到样品处理液中，吹打混匀，静置1min，吸取75μl混合液，上样，反应15min，上机检测，每个浓度水平重复检测10次，取10次结果的均值和标准差sd，计算三种浓度的变异系数cv都≤15％，满足试剂盒精密度的技术要求，详见表9，表9为试剂盒批内重复性的详细检测数据。表95.试剂盒比对结果分别以0.5ng/ml和2.0ng/ml为临界值，整理两组检测数据，如表10和表11，表10为临界值为0.5ng/ml时两种试剂盒的一致性数据，表11为临界值为2ng/ml时两种试剂盒的一致性数据，分析求得p＜0.05，证明自制降钙素原荧光免疫层析定量检测试剂盒与万孚降钙素原荧光免疫层析定量检测试剂盒的相关性良好。同时临界值分别为0.5ng/ml和2.0ng/ml时，两者的检验都计算出kappa＝0.899，证明所述单抗制备的试剂盒与万孚试剂盒一致性好。经统计，两种试剂盒的线性回归方程为y＝1.0669x-0.1264，且r＝0.9953，如图3，图3为由6a2抗体和1b1抗体制备的pct定量检测试剂盒与万孚试剂盒的相关性分析图。结果表明所述两种单抗制备的降钙素原试剂盒与万孚的试剂盒有较高的相关性。表10表11由上述实验，可得出，由6a2抗体和1b1抗体制备的pct定量检测试剂盒的灵敏度、准确度、线性要求、重复性等各方面要求均达到试剂盒制备标准。实施例5:单链抗体可变区基因提取1.杂交瘤细胞rna提取及cdna合成：收集新鲜的15ml生长至对数期的分泌单抗1b1和6a2的杂交瘤细胞，经无血清培养基洗涤后，用trizol法提取细胞总rna；再以总rna为模板，以oligodt和随机引物为引物，经m-mlv逆转录酶形成cdna。2.单链抗体重链和轻链可变区基因的扩增：以上述cdna为模板，分别以本实验室保存的vh-f/r、vl-f/r混合物为引物扩增得到单克隆抗体可变区的重链和轻链基因pcr产物，见图4，图4为单链抗体重链和轻链可变区基因电泳图。反应条件为94℃，预变性5min，94℃变性30s,60℃退火30s,72℃延伸30s，共35个循环，最后72℃10min。将上述pcr产物回收连接至t载体中，测序得到重链和轻链基因序列。测序所得的基因序列通过expasy在线翻译成氨基酸序列，blastp比对结果显示其为鼠源性单链抗体基因，且所述两种单抗的重链与轻链可变区氨基酸序列与本室其他鼠源单抗可变区氨基酸对比结果显示同源性均低于67％，结果表明扩增得到的所述两种单抗基因不存在污染，为新发现的鼠源单链抗体可变区片段。原则上分泌单克隆抗体的细胞只产生一种类型的抗体分子，严格地说只产生含一种重链可变区和一种轻链可变区的抗体分子，因此所得到的基因应该说就是所述pct抗原对应的两种鼠源抗体。以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和变形，这些改进和变形也视为本发明的保护范围。当前第1页12