多能干细胞诱导剂及其应用的制作方法

本发明涉及到细胞培养，具体涉及人工ipsc的诱导剂及其应用。

背景技术

ipsc(诱导性多能干细胞)，全称为inducedpluripotentstemcells，是通过人工诱导非多能性细胞表达某种特定基因得到的。ipscs和天然多功能干细胞在很多方面具有相似性，比如某种干细胞基因和蛋白的表达，染色质甲基化模式，倍增之间，胚体形成，畸胎瘤形成，不同嵌合体的形成，以及分化潜能。

micrornas(mirnas)是一种小的，类似于sirna的分子，由高等真核生物基因组编码，mirna通过和靶基因mrna碱基配对引导沉默复合体(risc)降解mrna或阻碍其翻译。mirnas在物种进化中相当保守，在植物、动物和真菌中发现的mirnas只在特定的组织和发育阶段表达，mirna组织特异性和时序性，决定组织和细胞的功能特异性，表明mirna在细胞生长和发育过程的调节过程中起多种作用。除了多能转录因子(oct，klf4，sox2，cmyc等)，内源特异性micrornas(mirs)在胚胎干细胞中高度表达已被报道，被称为胚胎干细胞特异性mirnas。它们已被证明可以发挥在控制多能相关基因中起关键作用，例如介导自我更新，分化和去分化。mir是小的进化保守非编码rna，通常作为内源抑制因子控制基因转录后修饰，通过诱导mrna降解或阻止翻译。每个mir都可以靶向并抑制数百种mrna，或者一种基因可以被各种mirs作为靶标，从而大大改变了基因表达谱和细胞表型。我们希望通过引入多能性特异的microrna(例如mir-290家系成员)，将成体细胞重编程成e胚胎干细胞样状态(ipsc)。

尽管多个小分子化合物已被发现能诱导ipsc产生(hou,p.,etal.(2013).science341(6146):651-654.)，但重编程效率并不理想，而且比较耗时，难以满足临床要求。

因此，我们将在mir-291研究基础上，加入valproicacid(vpa2-丙基戊酸)(histonedeacetylaseinhibitor，组蛋白去乙酰化酶抑制剂)、repsox(616452-transforminggrowthfactor-βreceptor1(tgfbr1)inhibitors转化生长因子β信号通路抑制剂和组蛋白去甲基化酶抑制剂)、chir99021(glycogensynthasekinase-3inhibitor，糖原合成酶激酶3抑制剂)、pd0325901(mitogen-activatedextracellularsignal-regulatedkinaseinhibitor，丝裂原激活的细胞外信号调节激酶抑制剂)、tranylcypromine(反苯环丙胺)(inhibitoroflsd1histonedemethylaseandmonoamineoxidases(mao)组蛋白去甲基化酶lsd1抑制剂)。

技术实现要素：

本发明的目的之一在于提供一种用于人工ipsc的制备的诱导剂，该诱导剂可以较好的实现对人体细胞诱导并产生ipsc。

实现上述目的的技术方案如下。

用于ipsc制备的诱导剂，其包括microrna和小分子化合物组合；所述小分子化合物组合为选自组蛋白去乙酰化酶抑制剂、丝裂原活化的细胞外信号调节激酶抑制剂、糖原合成酶激酶3抑制剂、转化生长因子β信号通路抑制剂和组蛋白去甲基化酶抑制剂中的每种抑制剂类型中至少一种。

本发明的另一目的是提供一种ipsc的制备方法，方案如下。

一种ipsc的制备方法，包括以下步骤：成体细胞重编程中加入上述述诱导剂中的microrna进行转染，同步或随后加入权利要求1-9任一项所述诱导剂中的小分子化合物组合进行培养，诱生ipsc。

本发明建立了一种新的用于产生人工ipsc的诱导方法以及诱导剂，所述方法包括利用多能性microrna(微小核糖核酸或小分子核糖核酸)和所述的小分子化合物组合构成的诱导剂，可用于对人体细胞诱导并产生ipsc。该诱导方法方便、快捷、高效。而且本发明避免了使用或病毒导入外源性转率因子所导致的整合突变的风险，并进一步提高ipsc制备和应用的安全性，从而为细胞重编程因子的应用前景广阔。

本发明通过非病毒导入mir和优选的小分子组合共同诱导的方法生成新的ipsc，该过程不需导入经典的重编程转录因子，而且其重编程效率与传统方法的效率相当，并具有更高的安全性。

附图说明

图1.mir-290家系诱导ipsc生成示意图。skmc:骨骼肌细胞；mef:小鼠胚胎成纤维细胞；alp:碱性磷酸酶；gfp:绿色荧光蛋白；oksm:oct4、klf4、sox2和c-myc组合；ksm:klf4、sox2和c-myc组合。

图2.mir-290家系促进oksm重编程效率。(a):ipsc克隆集落形成通过oct4-gfp报告基因和alp染色展示。(b和c):细胞在转导oskm的基础加入各个mir-290家系microrna拟似物(b)或者抑制剂(c)，然后通过alp染色分析ipsc生成效率。

图3.mir-291a能取代oct4与ksm组合生成ipsc。(a和b):alp染色统计mir-291a与各种重编程因子组合生成ipsc的克隆数量。(c):alp阳性ipsc克隆代表图。

图4.mir-291a+skm生成的ipsc具有多能性。(a):免疫荧光染色展现ipsc体外条件下能分化成三胚层类细胞。(b)he染色展现ipsc在体内条件下形成畸胎瘤的分化能力。

图5.mir-291a+skm生成的ipsc可分化为心肌细胞。免疫荧光染色展现ipsc体外条件下能分化ctnt或α-actinin阳性的心肌细胞。

图6.移植mir-291a+skm诱导的ipsc心肌细胞能改善心肌梗死小鼠心肌功能。

图7.mir-291a/b与各种小分子化合物组合诱导ipsc生成示意图。其中，vc6tp为各小分子化合物组合：v:vpa、c:chir99021、6:616452、t:tranylcypromine、p:pd0325901。

图8.mir-291与各种小分子化合物组合vpa、chir99021、616452、tranylcypromine和pd0325901(缩略为vc6tp)诱导ipsc的生成。(a)mir-291a与vc6tp联合诱导10天后，生成gfp或alp阳性ipsc克隆。挑选ipsc进行克隆化培养，能维持gfp或alp分子标记。(b)各种诱导组合生成alp阳性ipsc数量统计。

图9.免疫荧光染色展现mir-291a+vc6tpipsc表达其它多能分子标记。

图10.mir-291a+vc6tp生成的ipsc具有多能性。(a):免疫荧光染色展现ipsc体外条件下能分化成三胚层类细胞。(b)he染色展现ipsc在体内条件下形成畸胎瘤的分化能力。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“及/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

所述microrna为微小核糖核酸或小分子核糖核酸。

在其中一个实施例中，所述microrna包括mir-290家簇成员或与所述mir-290家簇成员之一的序列具有至少90％同源性的microrna序列。

进一步，在其中一些实施例中，所述microrna是mmu-mir-290a、mmu-mir-291a、mmu-mir-291b、mmu-mir-292a、mmu-mir-293、mmu-mir-294、mmu-mir-295、bta-mir-371、cfa-mir-371、eca-mir-371、eca-mir-372、ggo-mir-371b、hsa-mir-371a、hsa-mir-371b、hsa-mir-372、mml-mir-371、mml-mir-371-2、mml-mir-372、ocu-mir-371、ocu-mir-373、ppy-mir-371、ppy-mir-372、ptr-mir-371、ptr-mir-372、rno-mir-290、rno-mir-291a、rno-mir-291b、rno-mir-292、rno-mir-293、rno-mir-294、rno-mir-295-1、rno-mir-295-2、ssc-mir-371中的至少一种。

在其中一个实施例中，所述的组蛋白去乙酰化酶抑制剂为降低或抑制组蛋白去乙酰化酶(histonedeacetylase，hdac)活性的化合物，可选

2-丙基戊酸(valproicacid)、曲古霉素(trichostatina,tsa)、m344、苯基丁酸钠、恩替司他(entinostat,ms-275)、贝利司他(belinostat,pxd101)、艾贝司他(abexinostat,pci-24781)、达西司他(dacinostat,laq824)、奎司司他(quisinostat,jnj-26481585)2hcl、莫西司他(mocetinostat,mgcd0103)、卓西司他(droxinostat)、mc1568、普西司他(pracinostat,sb939)、丙戊酸钠(divalproexsodium)、pci-34051、吉维司他(givinostat,itf2357)、ar-42、图拔他汀盐酸盐(tubastatinahcl)、瑞米司他(resminostat)、泰克地那林(tacedinaline,ci994)、rgfp966、hpob、rg2833(rgfp109)、tmp269、尼土拉司他(nexturastat)、4sc-202、lmk-235分子中的一种或多种化合物

在其中一个实施例中，所述的丝裂原活化的细胞外信号调节激酶抑制剂为降低或抑制细胞外信号调节激酶(mitogen-activatedextracellularsignal-regulatedkinase，mek)活性的化合物，可选pd0325901、司美替尼b(selumetini,azd6244)、pd184352(ci-1040)、sl-327、雷莫替尼(refametinib,rdea119,bay86-9766)、pd98059、pimasertib(as-703026)、bix02188、bix02189、pd318088、azd8330、杨梅黄酮(myricetin)、tak-733、曲美替尼(trametinib,gsk1120212)、贝美替尼(binimetinib,mek162,arry-162,arry-438162)、gdc-0623、考比替尼(cobimetinib,gdc-0973,rg7420)、aps-2-79hcl等分子中的一种或多种化合物或其衍生物。

在其中一个实施例中，所述糖原合成酶激酶3抑制剂为降低或抑制糖原合成酶激酶3(glycogensynthasekinase-3，gsk3)活性的化合物，可选chir-99021(ct99021)、sb216763、tws119、靛玉红(indirubin)、sb415286、chir-98014、tideglusib、tdzd-8、ly2090314、azd1080、1-azakenpaullone(1-氮杂坎帕罗酮)、bio、azd2858、ar-a014418、im-12、拟南芥施加(bikinin)、bio-acetoxim(丙酮肟)分子中的一种或多种化合物。

在其中一个实施例中，所述的转化生长因子β信号通路抑制剂为降低或抑制转化生长因子β受体1(transforminggrowthfactor-βreceptor，tgf-βr1)活性及其阻滞tgf-β信号转导通路活化的化合物，可选repsox(e-616452)、sb431542、sb525334、茶碱(theophylline)、sb505124、galunisertib(ly2157299)、gw788388、吡非尼酮(pirfenidone)、dmh1、ldn-212854、k02288、vactosertib(tew-7197)、sd-208、ldn-214117、sis3hcl、ldn-1931892hcl分子中的一种或多种化合物。

在其中一个实施例中，所述的组蛋白去甲基化酶抑制剂为降低或抑制组蛋白去甲基化酶(histonedemethylase)活性的化合物，可选tranylcypromine(苯环丙胺)、gskj4hcl、iox1、og-l002、jib-04、ml324、gsk-lsd12hcl、gskj1、sp2509、ory-1001(rg-6016)2hcl、gsk28795522hcl、cpi-455hcl分子中的一种或多种化合物。

在其中一个实施例中，所述小分子化合物组合为2-丙基戊酸、chir99021、616452、tranylcypromine和pd0325901的组合，进一步地，各小分子化合物的用量优选如下：10±1nmvpa、1±0.1nmchir99021、1±0.1nm616452、5±0.5nmtranylcypromine和1±0.1nmpd0325901。

在其中一个实施例中，所述成体细胞，包括人体皮肤成纤维细胞、血液细胞、骨骼肌细胞、骨髓单核细胞，以及间充质干细胞等，可优选骨骼肌细胞。

在其中一个实施例中，还提供了ipsc的制备方法，其包括以下步骤：成体细胞重编程中加入上述诱导剂中的microrna进行转染，同步或随后加入上述所述诱导剂中的小分子化合物组合进行培养，诱生ipsc。

以下通过具体的例子对本发明做进一步的阐述，但不用于限制本发明的保护范围。

实施例1：本实施例主要以microrna为例说明如何诱导成体细胞生产ipsc。

1.成体细胞分离和培养：从oct-4-gfp转基因小鼠(购自thejacksonlab，8-10周龄)四肢肌肉中分离骨骼肌细胞(skeletalmusclecells,skmc)。将小鼠肌肉组织(～100mg)洗涤并剪碎，用含0.1％胶原酶ii的dmem在37℃水浴中解离2小时，然后用0.125％胰蛋白酶消化组织浆液45分钟。细胞消化后，加入10％fbs以灭活胶原酶/胰蛋白酶。浆液通过70μm细胞过滤器并以2000转离心5分钟，所得细胞沉淀用磷酸盐缓冲盐水(pbs)洗涤并重悬于10mlskmc生长培养基(高糖dmem含有0.1mm非必需氨基酸，10ng/mlbmp-4，10％fbs和2.5％青霉素/链霉素)。五代以内的原代培养细胞用于所有实验。

2.细胞重编程：按yamanaka报道方法(cell,2007,131(5):861-872.)，将hek293t转导亲嗜性包装质粒pcl-eco(41μg)和oksm重编程因子逆转录病毒构建体(41μg)包括：pmxs-klf4，pmxs-sox2，pmxs-oct4或pmxs-c-myc(均购自addgene)。两天后从hek293t细胞收集逆转录病毒上清液细胞培养物并以0.45微米的过滤器去取细胞杂质，-80℃保存。小鼠mir-291a及其拟似物(mimic)购自dharmacon,inc。将skmc(每孔1×10⁵个细胞，第3-5代)种入六孔板中(第0天)，并加入上述oksm重编程因子的逆转录病毒(addgene)感染(病毒上清：培养基比例为1:2)，24小时后换成skmc培养基并进行mir-291a及其拟似物转染。其中，100nm小鼠mir-291a及其拟似物与4μldharmacon转染试剂混合，然后加入skmc培养基中，孵育细胞2天。在第3天，将细胞(1×10⁴)转移到已铺有小鼠胚胎成纤维细胞饲养层的6cm培养皿中，换成含有15％fbs、0.1mm非必需氨基酸，0.1mmglutamax、0.1mmb-巯基乙醇和lif(1,000u/ml)的knockoutdmemipsc培养基(lifetechnologies)，每两天进行换液，并监测板中的细胞变化。在2-3周后，计数ipsc集落的总数。

3.细胞多能性鉴定：(1)碱性磷酸酶(alkalinephosphatase,alp)染色：用alp活细胞染色试剂盒(thermofisherscientific)对形成ipsc克隆集落进行染色鉴定，按照制造商的说明进行操作，显微镜下观察并计算ipsc集落的数量。(2)免疫荧光染色：将玻片上的培养细胞用4％多聚甲醛固定10-20分钟，加入含有1％牛血清白蛋白的封闭缓冲液(含0.1％tritonx-100)透化10至30分钟。用pbs洗涤后，在玻片上加入抗体溶液(均购自abcam公司)并在4℃温育过夜，去除第一抗体后，加入荧光素标记的第二抗体并在室温下温育1小时，细胞核用dapi染色，最后在显微镜下观察免疫染色。(3)畸胎瘤试验：收集未分化的ipsc并重新悬浮于冷汉克平衡盐溶液，使用27-g针的预冷注射器皮下注射nu/j小鼠(购自thejacksonlab)，移植4周后，处死小鼠进行免疫染色分析。

4.细胞分化：收集ipsc克隆，用dispase在37℃消化3-5分钟并种入超低附着板悬浮培养7天。分化培养基由0.1mm组成非必需氨基酸，1mml-谷氨酰胺，0.1mm二巯基乙醇，20％fbs和高糖dmem组成。拟胚体(embryoidbody)形成后移入0.1％明胶包被的培养皿中继续培养一周。

5.心肌梗死模型验证：我们对10-12周龄小鼠左前降冠状动脉进行结扎手术建立心肌梗死模型(ma,r.,etal.(2018).antioxidredoxsignal28(5):371-384.)，将30μl的细胞悬液分三次注入梗死心脏的边界区不同的地区。四周后，用超声心动图(ie33ultrasoundsystem；phillips)检查小鼠术后心肌功能变化。

6.统计分析：利用spss13.0软件统计进行数据分析。两组之间的数据比较使用t检验。多组的数据比较使用单向方差分析(anova)。p<0.05表明差异具有统计学意义。

7.研究结果：ipsc诱导过程如图1所示，大约2周后，可观察到形成的ipsc集落。其中，加入mir-291a能促进oksm重编因子产生ipsc的效率，增加oct4-gfp阳性和alp阳性克隆集落数量(图2a)。其它mir-290家系成员亦具有类似作用，例如mir-291b和mir-294均能提高oksm重编因子产生ipsc的效率(图2b)。然而，加入mir-291a或mir-291b的阻断剂能降低oksm的重编程效率(图2c)，表明mir-291a或mir-291b参与了oksm的重编程机制。另外，我们发现在mir-291a与oksm因子不同的组合中，mir-291a能与ksm组织诱导ipsc的产生(图3a和b)，而ksm单独组合不能诱导ipsc的产生，提示了mir-291a可以取代oct4与其他因子进行诱导细胞重编程。ksm结合mir-291a产生ipsc形态如图3c所示。图4a免疫荧光染色表明，ksm+mir-291a产生的ipsc与oksm诱导的ipsc功能类似，具备多向分化潜能，可自发分化为甲胎蛋白(alphafetoprotein,afp)阳性的内胚层类细胞、α-平滑肌肌动蛋白(alpha-smoothmuscleactin,sma)阳性的中胚层类细胞和β-iii微管蛋白(β-iiitubulin,β-iiitu)阳性的外胚层类细胞。注射免疫缺陷小鼠4周后，用苏木精-伊红染色证明ipscs三胚层分化潜能。如图4b所示，我们在ksm+mir-291aipsc产生的畸胎瘤中发现内胚层肠样上皮组织(e)、中胚层肌肉样组织(m)和外胚层神经玫瑰花状结构(n)的形成。我们再进一步探讨该ipsc在心血管再生医学的应用价值。ksm+mir-291a产生的ipsc可分化为心肌样细胞，并表达与心肌细胞收缩功能相关的蛋白例如肌钙蛋白t(ctnt)和辅肌动蛋白(α-actinin)如图5所示。我们建立小鼠心肌梗死模型，将由ipsc分化的心肌细胞注射入梗死区，超声心动图监测表明与对照组和oksm的ipsc相比，ksm+mir-291a产生的ipsc的细胞治疗效果最好，其各项参数包括射血分数(ef)短轴缩短率(fs)得到明显的改善(图6)。

实施例2：本实施例以microrna和化学小分子组合为例说明如何用非病毒诱导方法产生ipsc。

1.成体细胞分离和培养：同案例1所述。

2.细胞重编程：将skmc(每孔1×105个细胞，第3-5代)种入六孔板中(第0天)，24小时后进行mir-291a转染。其中，100nmmir-291a与4μldharmacon转染试剂混合，然后加入skmc培养基中，孵育细胞2天。在第3天，将细胞(1×104)转移到已铺有小鼠胚胎成纤维细胞饲养层的6cm培养皿中，换成含有15％fbs、0.1mm非必需氨基酸，0.1mmglutamax、0.1mmb-巯基乙醇和lif(1,000u/ml)的knockoutdmemipsc培养基(lifetechnologies)，并加入各种优化浓度的小分子化合物(10nmvpa、1nmchir99021、1nm616452、5nmtranylcypromine和1nmpd0325901，分别购于sigma公司)，每两天进行换液，并监测板中的细胞变化。在2-3周后，计数ipsc集落的总数。

3.细胞多能性鉴定：同实施例1所述。

4.统计分析：利用spss13.0软件统计进行数据分析-单向方差分析(anova)。p<0.05认为有统计学差异。

5.研究结果：mir-291a+vc6tp非病毒ipsc诱导过程如图7所示，大约2周后，可观察到形成的ipsc集落。mir-291a和vc6tp小分子化合物组合能诱导skmc生成oct4-gfp阳性和alp阳性的ipsc样克隆集落(图8a)。然而mir-291a或者vc6tp小分子化合物的单独处理不能产生ipsc克隆，唯有它们的组合才能产生ipsc,并且效率与oksm因子相当(图8b)。图9免疫荧光染色表明，mir-291a+vc6tp产生的ipsc同时表达其它多能性分子标记例如nanog和ssea1。mir-291a+vc6tp产生的ipsc与经典的ipsc功能类似，具备多向分化潜能，可自发分化为甲胎蛋白(alphafetoprotein,afp)阳性的内胚层类细胞、α-平滑肌肌动蛋白(alpha-smoothmuscleactin,sma)阳性的中胚层类细胞和β-iii微管蛋白(β-iiitubulin,β-iiitu)阳性的外胚层类细胞。注射免疫缺陷小鼠4周后，用苏木精-伊红染色证明ipscs三胚层分化潜能。如图10b所示，我们在mir-291a+vc6tpipsc产生的畸胎瘤中发现内胚层肠样上皮组织(e)、中胚层肌肉样组织(m)或脂肪样组织(f)、和外胚层神经玫瑰花状结构(n)角化珠结构(k)的形成。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。