一种基于鸡胚尿囊膜培养的细胞传代方法与流程

本发明涉及肿瘤细胞
技术领域：
，其具体是一种基于鸡胚尿囊膜培养的细胞传代方法。
背景技术：
鸡胚尿囊膜(cam)技术因取材方便、实验周期短、可定性或半定量检测肿瘤组织或细胞分泌成分，并可在透明膜上直接观察血管生成情况等优点，而用于研究肿瘤生物学特性。其中cam移植瘤模型是肿瘤诱导血管生成的良好模型，但是随着胚胎的不断发育，cam的血管生成会减缓，cam面积也会慢慢减少，因而肿瘤血管生成也会出现减缓，且瘤体生长缓慢，建模后可观察的实验周期比较固定，没有可持续性，也成为cam移植瘤的主要缺陷。cam移植瘤模型瘤体形态较大时，肿瘤细胞致密，已基本上饱和，为使肿瘤细胞能继续生长，同时保持肿瘤细胞的活性，就必须进行传代，常规的悬浮型细胞可直接分瓶，而贴壁细胞需经消化后才能分，两种情况均需对细胞进行体外培养，打破了瘤体的形态，难以持续观察瘤体生长情况的整体性，且贴壁细胞如果消化不当，则会严重影响细胞的活性。采用一定的方法，将cam血管生成即将衰退阶段或形态较大的肿瘤细胞直接在鸡胚尿囊膜上进行传代，不仅可以保持瘤体形态的整体性，还可以持续保持肿瘤细胞的活性，确保cam移植瘤模型生物学研究周期的持续性。技术实现要素：有鉴于此，本发明提供一种基于鸡胚尿囊膜培养的细胞传代方法，本发明无需外界培养基和培养皿，能够维持瘤体形态的整体性，保持肿瘤细胞的活性，其操作简便，成功率高，适用于肿瘤生物学相关的研究。为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：一种基于鸡胚尿囊膜培养的细胞传代方法，其包括：（1）瘤体清洗：将待传代的鸡胚尿囊膜（cam）移植瘤模型瘤体在无菌环境下取出，用缓冲液润洗2~4次；（2）瘤体分割：用手术刀将瘤体组织切为多份小块；（3）接种：选择在温度36~38℃，湿度60~80%的培养箱中孵育3~9天的鸡胚，开窗后用无菌镊子将瘤体小块放置在鸡胚尿囊膜上；（4）培养：立即用无菌透明胶带封闭，放入温度为36~38℃，湿度为60~80%的培养箱中继续孵育。优选地，在步骤1中，所述缓冲液为pbs缓冲液（磷酸缓冲盐溶液）。优选地，在步骤2中，将所述瘤体分为2~5块。优选地，在步骤3中，选择在温度37℃、湿度60%的培养箱中孵育6天的鸡胚接种。优选得，在步骤3中，将瘤体小块放置在鸡胚尿囊膜上相对无血管区或者血管较少区。优选得，在步骤4中，在培养箱孵育时的温度、湿度与接种温度、湿度相同。优选地，在步骤1中，所述pbs缓冲液的ph值为7~7.4。与传统技术相比，本发明的有益效果是：该细胞传代方法步骤简单，操作简便，能够缩短传代周期，成功率高，适合大规模使用；该发明与常规传代方法相比，无需外界培养基培养，节约材料和成本，且无需消化，能够最大程度保持肿瘤细胞的活性和活力；该发明能够维持瘤体的整体形态形，为cam移植瘤模型相关研究的提供持续较长的实验周期。附图说明图1为本发明与传统细胞传代方法用细胞计数仪作细胞计数对比图。具体实施方式下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。实施例一种基于鸡胚尿囊膜培养的细胞传代方法，其包括：将待传代的鸡胚尿囊膜（cam）移植瘤模型瘤体在无菌环境下取出，用pbs缓冲液润洗4次；用手术刀将瘤体组织切为4小块；选择在温度36℃，湿度60%的培养箱中孵育6天的鸡胚，开窗后用无菌镊子将瘤体小块放置在无血管区的鸡胚尿囊膜上；立即用无菌透明胶带封闭，放入温度为36℃，湿度为60%的培养箱中继续孵育。孵育湿度的确定将切为4小块的瘤体组织放入温度相同，湿度分别为10~30%、30~50%、50~70%、70~90%的培养箱中孵育的鸡胚尿囊膜上，之后马上用无菌透明胶带封闭，将鸡胚尿囊膜放至对应培养箱中孵育，一定时间后，分别用肉眼和在显微镜下观察瘤体细胞生长情况，重复试验三次以上后，将瘤体细胞生长较高的湿度区间记录，本次试验中瘤体细胞生长较高的湿度区间为50~70%、70~90%，由于湿度上、下跨度较大，再次重复试验进一步缩小湿度区间，将切为5小块的瘤体组织放入温度相同，湿度分别为50%、60%、70%、80%、90%的培养箱中孵育的鸡胚尿囊膜上，之后马上用无菌透明胶带封闭，将鸡胚尿囊膜放至对应培养箱中孵育，一定时间后，分别用肉眼和在显微镜下观察瘤体细胞生长情况，重复试验三次以上后，将瘤体细胞生长较高的湿度区间记录，本次试验中瘤体细胞在湿度为50%和90%的培养箱中细胞生长情况明显不如湿度为60%、70%、80%的培养箱中，其中当湿度为60%时，细胞生长情况为最佳状态，因此确定湿度为60~80%时最适合瘤体细胞生长，当湿度为60%时细胞生长情况最为优秀。孵育温度的确定将切为4小块的瘤体组织放入湿度相同，温度为30~32℃，33~35℃，36~38℃，39~40℃（因为传统孵育温度大多在30多度，因此可确定大概温度区间为30~40℃）的培养箱中孵育的鸡胚尿囊膜上，之后马上用无菌透明胶带封闭，将鸡胚尿囊膜放至对应培养箱中孵育，一定时间后，分别用肉眼和在显微镜下观察瘤体细胞生长情况，重复试验三次以上后，将瘤体细胞生长较高的温度区间记录，本次试验中瘤体细胞生长较好的温度区间为36~38℃，39~40℃，由于此次试验瘤体细胞生长情况在36~38℃，39~40℃这两个范围内区别仍然较大，因此需要进一步确定最适宜的温度，重复上述试验，将切为2小块的瘤体组织放入湿度相同，温度为36~38℃，39~40℃的培养箱中孵育的鸡胚尿囊膜上，之后马上用无菌透明胶带封闭，将鸡胚尿囊膜放至对应培养箱中孵育，一定时间后，分别用肉眼和在显微镜下观察瘤体细胞生长情况，重复试验三次以上后，发现瘤体细胞生长较好的温度区间为36~38℃，在这个区间内瘤体细胞成长情况较为优秀，而且差别不大，因此可以得出孵育最佳温度范围。表1为不同孵育湿度下瘤体细胞生长情况湿度范围10~30%30~50%50~70%70~90%瘤体细胞成长情况细胞大量团聚细胞有轻微团聚团聚现象逐渐减少，生长状态逐渐变好团聚现象减少后逐渐增多，生长状态持续一段时间后下降表2为不同孵育温度下瘤体细胞生长情况温度范围30~32℃33~35℃36~38℃39~40℃瘤体细胞成长情况细胞轻微团聚，不成长细胞轻微团聚，不成长团聚现象逐渐减少，生长状态逐渐变好团聚现象逐渐增加，生长状态逐渐变差用本发明一种基于鸡胚尿囊膜培养的细胞传代方法与传统细胞传代方法用细胞计数仪作细胞计数对比，如图1所示，通过图1可看出，在同一时间下，本发明培育的细胞数量明显优于传统方法。尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。当前第1页12