一株吡哆醇单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用的制作方法

本发明涉及一株吡哆醇单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用，属于食品安全免疫检测领域。

背景技术

吡哆醇属于b族维生素，是具有维生素b6作用的物质之一，也称为抗皮炎素或维生素b6，广泛存在于食品中并且可作为膳食补充剂。吡哆醇在生物体内容易变成作为辅酶的吡哆醛-5-磷酸参与机体新陈代谢。缺少吡哆醇的动物，蛋白质转变为碳水化合物和脂肪将受到阻抑，亦会出现鼻炎、口炎和皮炎。此外缺乏维生素b6还会引起各种脏器的动脉硬化症。由于吡哆醇在中枢神经系统中起着重要的作用，因此缺乏吡哆醇会引起痉挛，给予吡哆醇便可很快恢复。吡哆醇用于治疗和预防吡哆醇缺乏、铁粒幼细胞性贫血、吡哆醇依赖性癫痫及某些代谢紊乱，因此食品中吡哆醇的控制尤为重要。

目前吡哆醇含量分析方法有气相色谱法(gc)、高效液相色谱法(hplc)、气质联用(gc-ms)、液质联用(lc-ms)等仪器方法，但这些方法需要昂贵的仪器、专业的操作人员，且样品前处理复杂，成本高，时间长，不能实现大量样品的快速检测，因此建立快速简便的吡哆醇检测方法具有重要意义。酶联免疫法（elisa）是一种极为高效、敏感、快速的检测方法，检测时对样本的纯度要求不高而且操作简便，适用于大量样本的现场快速检测。建立高效的免疫学检测方法，筛选高特异性的单克隆抗体是重要前提。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一株吡哆醇单克隆抗体杂交瘤细胞株ss0708及其应用，由该细胞株制备的抗体对吡哆醇具有较好的特异性和检测灵敏度，可以用来建立吡哆醇的免疫学检测方法。

本发明的技术方案，一株吡哆醇单克隆抗体杂交瘤细胞株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno.14687，保藏日期为2017年9月5日。

吡哆醇单克隆抗体，由所述保藏编号为cgmccno.14687，吡哆醇单克隆抗体杂交瘤细胞株ss0708分泌产生。

所述吡哆醇单克隆抗体的应用，用于建立吡哆醇含量的免疫检测方法，将其应用于残留吡哆醇的检测中。

所述检测领域为婴幼儿食品、乳品或特殊医学用途食品中。

所述吡哆醇免疫原pyr-klh的制备方法，主要包括以下步骤：

（1）半抗原pyr的制备：将吡哆醇（20g，118mmol）溶解于200ml丙酮中，加入200ml2，2-二甲氧基丙烷和对甲苯磺酸（81.4g，473mmol），130℃搅拌过夜。将反应混合物倒入冰水中冷却并用dcm提取水相。混合有机相并用盐水洗涤，na2so4干燥浓缩。用乙醚重结晶所得产物。将混合物过滤，得到白色固体化合物2；

0℃氮气下，将nah（6.88g，287mmol，60%有机相）的溶液加入到70mlthf中。加入溶解在200mlthf中的化合物2（15g，71.7mmol）。回流30min，冷却至室温后，加入苄基溴（24.5g，143mmol），再次回流4h，然后用二氯甲烷萃取。收集有机提取物，用盐水洗涤，干燥浓缩，得到深棕色油状物。用硅胶柱纯化残留物，得到棕色油状物3；

化合物3（12g，40.1mmol）的水溶液中加入24ml98%甲酸。50℃搅拌24h，然后用饱和nahco3溶液将其调节至ph7。中和后，用二氯甲烷多次萃取反应混合物。将有机萃取物干燥浓缩，得到深棕色固体，用快速色谱法纯化粗产物，得到化合物4；

0℃氮气下，将苄基二甲基苯基氯化铵（7.60g，26.6mmol）溶解于30ml无水甲醇中，将该溶液加入到甲醇钠（1.80g，34mmol）溶液中。然后向混合物中加入60ml化合物4（4.50g，17.4mmol）的甲醇溶液中。室温下搅拌20min，蒸发浓缩混合物并将其加入到含有500毫升热甲苯的圆底烧瓶中。反应30min后，将混合物浓缩。反应后，油残渣溶解在饱和氯化铵溶液中，然后用二氯甲烷萃取。将有机提取物干燥浓缩。将有机萃取物经硅胶柱纯化，得到化合物5；

含化合物5（2.60g，169mmol）的60ml甲苯溶液加入cs2co3（3.70g·114mmol）和丙烯酸乙酯（2.80g，22.6mmol），85℃搅拌过夜。将反应混合物冷却并倒入水中，然后用hcl将溶液调至ph7，用ea萃取水相。混合有机相用盐水洗涤，用na2so4干燥并浓缩。用硅胶柱纯化残留物，得到化合物6；

含化合物6（1.60g，3.50mmol）的thf/h2o（16.0/4.00ml）溶液加入liohh2o（34.7mg，890mmol），室温下搅拌过夜。然后用hcl将溶液调整到ph7，用ea提取水层。混合有机层用盐水洗涤，经na2so4干燥浓缩，得到化合物7；

化合物7（1g，2.30mmol）的20mlmeoh溶液中加入100mgpd/c，室温下搅拌过夜。将混合物过滤并浓缩，得到白色固体化合物8即pyr。

（2）完全抗原的制备：

免疫原pyr-klh的制备：称取半抗原pyr，1-乙基碳二亚胺盐酸盐，以及n-羟基琥珀酰亚胺，用无水n,n-二甲基甲酰胺溶解得到a液；取钥孔血蓝蛋白klh，用硼酸缓冲溶液溶解得到b液；在室温条件，逐滴将a液加入到b液中，室温反应过夜，即得偶联物pyr-klh混合液，通过透析分离完全抗原和未偶联的小分子半抗原得到免疫原pyr-klh。

提供制备所述吡哆醇单克隆抗体杂交瘤细胞株的筛选方法，主要包括以下步骤：

（1）小鼠的免疫：将免疫原pyr-klh与等量弗氏佐剂混合乳化后，通过背部皮下注射免疫balb/c小鼠；首次免疫用完全弗氏佐剂，多次加强免疫用不完全弗氏佐剂，首次免疫与第二次加强免疫之间间隔28天，多次加强免疫之间间隔21天，最后一次用pyr-klh完全抗原（不含佐剂）冲刺免疫；通过间接竞争酶联免疫法（ic-elisa）检测血清效价和抑制；

（2）细胞融合与细胞株建立：通过聚乙二醇（peg4000）法将小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞融合，通过hat培养基培养，利用间接竞争酶联免疫法（ic-elisa）检测阳性细胞孔，并进一步利用ic-elisa测定阳性细胞孔的抑制效果，通过有限稀释法对有最好抑制效果的阳性细胞孔进行三次亚克隆，最终筛选获得吡哆醇单克隆抗体杂交瘤细胞株；

（3）杂交瘤细胞株性质的鉴定：通过ic-elisa测定灵敏度和特异性。

本发明的有益效果：本发明提供的吡哆醇单克隆抗体杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体，对吡哆醇具有较好的特异性和检测灵敏度（ic50值为250ng/ml），为检测婴幼儿食品、乳品和特殊医学用途食品中吡哆醇含量提供了免疫学方法。本发明提供的吡哆醇单克隆抗体杂交瘤细胞株及其分泌的单克隆抗体可制成用于检测吡哆醇的试剂盒，具有实际应用价值。

生物材料样品保藏：一株吡哆醇单克隆抗体杂交瘤细胞株ss0708，所述杂交瘤细胞株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为cgmccno.14687，分类命名单克隆细胞株，保藏日期为2017年9月5日。

附图说明

图1是吡哆醇单克隆抗体对吡哆醇的抑制标准曲线。

具体实施方式

本发明下面的实施例仅作为本发明内容的进一步说明，不能作为本发明的限定内容或范围。下面通过实施例对本发明作进一步说明。

本发明通过将吡哆醇完全抗原免疫小鼠，通过细胞融合，hat选择性培养基培养，通过ic-elisa筛选细胞上清，最终得到了对吡哆醇有较好特异性和灵敏度的单克隆抗体杂交瘤细胞株。

实施例1杂交瘤细胞株ss0708的制备

（1）完全抗原的制备：

a、半抗原合成路线如下：

将吡哆醇（20g，118mmol）溶解于200ml丙酮中，加入200ml2，2-二甲氧基丙烷和对甲苯磺酸（81.4g，473mmol），130℃搅拌过夜。将反应混合物倒入冰水中冷却并用dcm提取水相。混合有机相并用盐水洗涤，na2so4干燥浓缩。用乙醚重结晶所需产物。将混合物过滤，得到白色固体化合物2；

0℃氮气下，将nah（6.88g，287mmol，60%油）的溶液加入到70mlthf中。加入溶解在200mlthf中的化合物2（15g，71.7mmol）。回流30min，冷却至室温后，加入苄基溴（24.5g，143mmol），再次回流4h，然后用二氯甲烷萃取。收集有机提取物，用盐水洗涤，干燥,浓缩，得到深棕色油状物。用硅胶柱纯化残留物，得到棕色油状物3；

化合物3（12g，40.1mmol）的水溶液中加入24ml98%甲酸。50℃搅拌24h，然后用饱和nahco3溶液将溶液调节至ph7。中和后，用二氯甲烷多次萃取反应混合物。将有机萃取物干燥浓缩，得到深棕色固体，用快速色谱法纯化粗产物，得到化合物4；

0℃氮气下，将苄基二甲基苯基氯化铵（7.60g，26.6mmol）溶解于30ml无水甲醇中，将该溶液加入到甲醇钠（1.80g，34mmol）溶液中。然后向混合物中加入60ml化合物4（4.50g，17.4mmol）的甲醇溶液中。室温下搅拌20min，蒸发浓缩混合物并将其加入到含有500毫升热甲苯的圆底烧瓶中。反应30min后，将混合物浓缩。反应后，油残渣溶解在饱和氯化铵溶液中，然后用二氯甲烷萃取。将有机提取物干燥浓缩。将有机萃取物经硅胶柱纯化，得到化合物5；

含化合物5（2.60g，169mmol）的60ml甲苯溶液加入cs2co3（3.70g·114mmol）和丙烯酸乙酯（2.80g，22.6mmol），85℃搅拌过夜。将反应混合物冷却并倒入水中，然后用hcl将溶液调至ph7，用ea萃取水相。混合有机相用盐水洗涤，用na2so4干燥并浓缩。用硅胶柱纯化残留物，得到化合物6；

含化合物6（1.60g，3.50mmol）的thf/h2o（16.0/4.00ml）溶液加入liohh2o（34.7mg，890mmol），室温下搅拌过夜。然后用hcl将溶液调整到ph7，用ea提取水层。混合有机层用盐水洗涤，经na2so4干燥浓缩，得到化合物7；

向化合物7（1g，2.30mmol）的20mlmeoh溶液中加入100mgpd/c，室温下搅拌过夜。将混合物过滤并浓缩，得到白色固体化合物8，即半抗原pyr。

b、称取2.7mgpyr，1-乙基碳二亚胺盐酸盐7.6mg，n-羟基琥珀酰亚胺4.6mg，用400μl无水n,n-二甲基甲酰胺溶解，得到a1液，室温搅拌反6-8h。取钥孔血蓝蛋白klh10mg（pyr与klh摩尔比分别为2000:1、4000:1和6000：1)，用6ml硼酸缓冲溶液溶解，得到b1液，在室温条件，逐滴将a1液加入到b1液中，室温反应过夜，即得偶联物pyr-klh（2000:1、4000:1和6000：1）混合液，通过透析分离完全抗原和未偶联的小分子半抗原，得到偶联物pyr-klh（2000:1）、pyr-klh（4000:1）和pyr-klh（6000:1）。

（2）包被原pyr-ova的制备：

称取1.6mgpyr，1-乙基碳二亚胺盐酸盐3.8mg，n-羟基琥珀酰亚胺2.3mg，用300μl无水n,n-二甲基甲酰胺溶解，得到a2液，室温搅拌反6-8h。称取5mg鸡卵清白蛋白ova（pyr与ova摩尔比为60:1），溶解于2ml硼酸缓冲溶液中，得到b2溶液，在室温条件下，逐滴将a2液加入到b2液中，室温反应过夜，即得偶联物pyr-ova混合液，通过透析分离包被原和未偶联的小分子半抗原。包被原用于单抗制备过程中小鼠血清效价和抑制的检测，并不直接用于小鼠，是制备单抗必需的。

（3）动物免疫：选择健康的6～8周龄的balb/c小鼠进行免疫。取三种不同摩尔比的吡哆醇完全抗原与等量弗氏佐剂混合乳化后，通过背部皮下注射分别免疫balb/c小鼠。第一次免疫用完全弗氏佐剂，之后都用不完全弗氏佐剂。首次免疫与第二次加强免疫之间间隔28天，多次加强免疫之间间隔21天。第三次免疫后7天采血（小鼠断尾采血5ul+995ul抗体稀释液=抗血清），使用ic-elisa测定小鼠血清效价和抑制，选择效价高抑制好的小鼠，在第五次免疫后21天冲刺免疫，腹腔注射，要求冲免剂量减半且不含任何佐剂。

（4）细胞融合：在冲刺免疫三天后，按照常规peg（聚乙二醇，分子量为4000）方法进行细胞融合，具体步骤如下：

a、摘眼球取血，颈椎脱臼法处死小鼠后，立即放入75%酒精中消毒，浸泡5min左右，无菌操作取出小鼠的脾脏，用注射器的胶头适度研磨并通过200目细胞筛网得到脾细胞悬液，收集，离心（1200rpm，8min），用rpmi-1640培养基洗涤脾细胞三次，最后一次离心后，将脾细胞稀释到一定体积，计数，备用；

b、收集sp2/0细胞：融合前7-10天，将sp2/0瘤细胞用含10%fbs（胎牛血清）rpmi-1640培养基在5%co2培养箱中。融合前要求sp2/0瘤细胞数量达到1~4×10⁷，保证融合前sp2/0瘤细胞处于对数生长期。融合时，收集瘤细胞，悬浮于rpmi-1640基础培养液中，进行细胞计数；

c、融合过程7min。第1min，将1ml的peg1500由慢到快滴加到细胞中；第2min，静置。第3min和第4min，在1min内滴加1mlrpmi-1640培养基；第5min和第6min，在1min内滴加2mlrpmi-1640培养基；第7min，每10s滴加1ml的rpmi-1640培养基。然后37℃温浴5min。离心（800rpm，8min），弃上清，重悬入含20%胎牛血清，2%的50×hat的rpmi-1640筛选培养液中，按照200μl/孔加到96孔细胞板，置于37℃，5%co2培养箱中培养。

（5）细胞筛选与细胞株建立：在细胞融合的第3天对融合细胞进行rpmi-1640筛选培养液半换液，第5天进行用含20%胎牛血清，1%的100×ht的rpmi-1640过渡培养液进行全换液，在第7天取细胞上清进行筛选。筛选分两步：第一步先用ic-elisa筛选出阳性细胞孔，第二步选用吡哆醇为标准品，用ic-elisa对阳性细胞进行抑制效果测定。选择对吡哆醇标准品均有较好抑制的细胞孔，采用有限稀释法进行亚克隆，用同样的方法进行检测。重复三次，获得细胞株2f9。

（6）单克隆抗体的制备与鉴定：取8-10周龄balb/c小鼠，每只小鼠腹腔注射无菌石蜡油1ml；7天后每只小鼠腹腔注射1×10⁶杂交瘤细胞，从第七天开始收集腹水，将腹水通过辛酸-硫酸铵法纯化。在偏酸条件下，正辛酸可以沉淀腹水中除igg免疫球蛋白外的其他杂蛋白，然后离心，弃沉淀；再用等量饱和度的硫酸铵溶液沉淀igg型的单克隆抗体，离心，弃上清，用0.01mpbs溶液（ph7.4）溶解后，透析脱盐，最终得到纯化后的单克隆抗体置于-20℃保存。

实施例2吡哆醇单克隆抗体的ic50的测定

碳酸盐缓冲液（cbs）：称取na2co31.59g，nahco32.93g，分别溶于少量双蒸水后混合，加双蒸水至约800ml混匀，调ph值至9.6，加双蒸水定容至1000ml，4℃贮存备用。

磷酸盐缓冲液（pbs）：8.0gnacl，0.2gkcl，0.2gkh2po4，2.9gna2hpo4•12h2o，溶于800ml纯水中，用naoh或hcl调ph到7.2～7.4，定容至1000ml；

洗涤液（pbst）：1000ml的0.01mol/lph7.4的pbs溶液中加入0.5ml的tween–20；

pbst：含0.05%tween–20的pbs；

抗体稀释液：含有0.1%明胶的洗涤缓冲液；

tmb显色液：a液：na2hpo4.12h2o18.43g，柠檬酸9.33g，纯水定容至1000ml；b液：60mgtmb溶于100ml乙二醇中。a、b液按体积比1:5混合即为tmb

显色液，现用现混。

（1）包被：将包被原pyr-ova用0.05mph9.6碳酸盐缓冲液从1µg/ml开始倍比稀释，100μl/孔，37℃反应2h。

（2）洗涤：将板内溶液倾去，并用洗涤液洗涤3次，每次3min.

（3）封闭：拍干后，加入200μl/孔封闭液，37℃反应2h。洗涤后烘干备用。

（4）加样：将抗血清（小鼠断尾采血后，以抗体稀释液稀释相应倍数后即抗血清）从1:1000开始倍比稀释，并加入到各稀释度的包被孔中，100μl/孔，37℃反应30min；充分洗涤后，加入1:3000稀释的hrp-羊抗鼠igg，100μl/孔，37℃反应30min。

（5）显色：将酶标板取出，充分洗涤后，每孔加入100μl的tmb显色液，37℃避光反应15min.

（6）终止和测定：每孔加入50μl终止液以终止反应，然后用酶标仪测定各孔的od450值。

用ic-elisa测定单克隆抗体吡哆醇的ic50为250ng/ml，说明对吡哆醇有很好的灵敏度，可用于吡哆醇免疫分析检测。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。