雷公藤红素的两种热分解产物的制备方法及其应用与流程

本发明涉及医药技术领域，尤其涉及雷公藤红素的两种热分解产物的制备方法及其在制备抗炎药物中的应用。

背景技术

雷公藤(tripteryginumwilfordiihook.f)为卫矛科雷公藤属植物，临床上常用于治疗类风湿性关节炎、慢性肾炎、红斑狼疮等难治性免疫功能亢进疾病。目前有雷公藤片和雷公藤多苷片等药品应用于临床，疗效显著。雷公藤红素为雷公藤的抗炎有效成分之一，作为一个天然药物,雷公藤红素在抗肿瘤、抗炎与免疫抑制、抗病毒、抗神经退行性疾病以及减肥等领域显示了良好的药理活性,具有非常好的开发价值与前景。但是，雷公藤红素毒性较大，据文献报道，雷公藤红素具有细胞毒、肝毒性和心脏毒性等毒性，其急性毒性小鼠静脉注射半数致死量为3.157mg/kg（95%可信区间为3.1~5.5mg/kg），属于剧毒级药物。因此，如何降低雷公藤红素的毒性已成为目前重要的研究课题。发明人对雷公藤红素进行了热分解反应研究，结合抗炎药效活性筛选，分离鉴定了两种毒性小、具有很好抗炎活性的雷公藤红素热分解产物。本发明公开了雷公藤红素的这两种热分解产物的制备方法及其在制备抗炎药物中的应用。

技术实现要素：

本发明所涉及的雷公藤红素的两种热分解产物分别为化合物1（1-hydroxy-2,5,8-trimethyl-9-fluorenone，结构如下式ⅰ）和化合物2（25(9→8),26(13→14)abeo-24-nor-8,14-seco-friedelan-2,3-dihydroxy-1,3,5(10),6,8-pentaen-29(13)-olide，结构如下式ⅱ）。

式ⅰ：化合物1的结构式。

式ⅱ：化合物2的结构式。

本发明的目的是提供化合物1-hydroxy-2,5,8-trimethyl-9-fluorenone和25(9→8),26(13→14)abeo-24-nor-8,14-seco-friedelan-2,3-dihydroxy-1,3,5(10),6,8-pentaen-29(13)-olide的制备方法及其在制备抗炎药物中的应用。本发明是通过下述技术方案来实现的。

一、雷公藤红素的热分解产物的制备

1．将雷公藤红素用铝箔纸包严实，再用黄泥均匀包裹，形成黄泥包层，包层厚度为0.2~0.5厘米，黄泥用黄土与10%食盐水按毎4克黄土中加入1毫升食盐水的比例和匀制得，自然晾干后，置烘箱内于200℃加热0.5~5小时，自然冷却至室温，剥离黄泥与铝箔纸，得雷公藤红素热分解混合物。

2．将雷公藤红素热分解混合物用乙腈溶解，经制备高效液相色谱分离，得化合物1和化合物2。

雷公藤红素热分解反应式见式ⅲ。

式ⅲ：雷公藤红素热分解反应式。

二、结构鉴定

化合物1：棕红色粉末，熔点168-170℃；根据hr-tof-ms确定分子式为c16h14o2([m+h]⁺，实测值：m/z239.1063，理论计算值：m/z239.1067；[m-h]^-，实测值：m/z237.0920，理论计算值：m/z237.0921)。根据¹³c-nmr谱中12个芳香碳及1个酮羰基信号(δc180.58，c-9)确定化合物1为9-芴酮类化合物。综合解析¹h-nmr谱和¹³c-nmr谱，对所有的碳信号和质子信号进行了归属。¹h-nmr(600mhz,cd3cl3)δh:7.57(1h,d,j=8.5hz,h-3),8.30(1h,d,j=8.5hz,h-4),7.39(1h,d,j=7.4hz,h-6),7.78(1h,d,j=7.4hz,h-7),3.02(3h,s,me-2),2.78(3h,s,me-5),2.48(3h,s,me-8)。¹³c-nmr(150mhz,cd3cl3)δc:147.73(c-1),124.56(c-2),131.41(c-3),131.90(c-4),137.30(c-5),127.06(c-6),127.37(c-7),146.86(c-8),180.58(c-9),128.06(c-1a),125.68(c-4a),130.38(c-5a),120.42(c-8a),24.80(me-2),19.81(me-5),11.56(me-8)。经查文献比较，以上波谱数据与文献（wuxy,qingw,fandj,etal.1-hydroxy-2,5,8-trimethyl-9-fluorenonefromtripterygiumwilfordii[j].phytochemistry,1994,36(2):477-479.）报道的1-hydroxy-2,5,8-trimethyl-9-fluorenone一致，因此确定化合物1为1-hydroxy-2,5,8-trimethyl-9-fluorenone(结构见式ⅰ)。

化合物2：白色固体；根据hr-tof-ms确定分子式为c29h38o4([m+h]⁺，实测值：m/z451.2829，理论计算值：m/z451.2843；[m-h]^-，实测值：m/z449.2687，理论计算值：m/z449.2697)。综合解析¹h-nmr谱和¹³c-nmr谱，对所有的碳信号和质子信号进行了归属。¹h-nmr(600mhz,cd3cd)δh:7.55(1h,d,j=8.6hz,h-6),7.26(1h,s,h-1),7.07(1h,d,j=8.6hz,h-7),2.96(2h,m,h-11),2.46(3h,s,me-23),2.40(3h,s,me-25),1.25(3h,s,me-26),1.23(3h,s,me-27),1.12(3h,s,me-30),1.08(3h,s,me-28)。¹³c-nmr(150mhz,cd3cd)δc:104.29(c-1),147.16(c-2),143.88(c-3),117.71(c-4),129.49(c-5),122.17(c-6),127.55(c-7),130.82(c-8),135.28(c-9),129.21(c-10),25.16(c-11),32.50(c-12),102.25(c-13),43.33(c-14),38.46(c-15),39.88(c-16),42.31(c-17),45.74(c-18),32.56(c-19),39.88(c-20),36.52(c-21),36.64(c-22),11.21(c-23),20.14(c-25),22.79(c-26),22.86(c-27),24.79(c-28),180.23(c-29),25.96(c-30)。化合物2的关键hmbc相关见式ⅳ。经查文献比较，以上波谱数据与文献(wuj,zhouy,wangl,etal.terpenoidsfromrootbarkofcelastrusorbiculatus[j].phytochemistry,2012,75(5):159–168.)报道的25(9→8),26(13→14)abeo-24-nor-8,14-seco-friedelan-2,3-dihydroxy-1,3,5(10),6,8-pentaen-29(13)-olide一致，因此确定化合物2为25(9→8),26(13→14)abeo-24-nor-8,14-seco-friedelan-2,3-dihydroxy-1,3,5(10),6,8-pentaen-29(13)-olide(结构见式ⅱ)。

式ⅳ：化合物2的关键hmbc相关。

三、抗炎药效学评价

本发明对化合物1和化合物2进行了抗炎药效学评价。

1.化合物1和化合物2对脂多糖（lps）诱导的人脐静脉血管内皮细胞（huvecs）的炎症因子白介素1β（il-1β）和肿瘤坏死因子(tnf-α)过量表达的影响实验。

1.1实验方法

将huvecs细胞以2×10⁶个/ml的浓度接种于6孔板，37℃，5%co2条件下培养至80%的融合状态，pbs洗涤两次。换成无血清培养基，加入药物，0.5h后，加入刺激剂lps（100ng/ml），实验分为5组，正常组，模型组，化合物1组(10μm)；化合物2组(10μm)，阳性药泼尼松龙组(10μm)，每组6个复孔，37℃，5%co2条件下孵育24小时后，提取rna，将rna逆转录为cdna后，利用rt-pcr技术检测il-1β和tnf-α的mrna表达水平。

1.2实验结果

结果表明（见表1），模型组il-1β和tnf-α表达与正常组比较有显著性升高（p<0.05），说明造模成功。化合物1、化合物2、泼尼松龙给药组与模型组比较有显著性差异（p<0.05），说明化合物1和2能显著抑制lps刺激的huvecs中的炎症因子il-1β和tnf-α的过量表达，抑制效果优于阳性药泼尼松龙，说明化合物1和2具有较好的抗炎活性。

表1.化合物1和2对lps诱导的huvecs细胞中的炎症因子il-1β及tnf-α表达的影响（qpcr）(±s，n=6)

#与空白组比较p<0.05；*与模型组比较p<0.05。

2.化合物1和化合物2对二甲苯引起的小鼠耳肿胀模型影响实验

化合物1和化合物2用2%丙二醇水溶液溶解。取昆明种小鼠，雌雄各半，体重18-22g，随机均分成模型组，化合物1给药组、化合物2给药组，阳性对照药吲哚美辛给药组，每组10只。各给药组按10mg/kg剂量灌胃给药，模型组给等体积2%丙二醇水溶液。连续给药3天，末次给药后1小时，将20μl二甲苯涂于小鼠右耳廓两面致炎,左耳不涂为对照。1小时后将小鼠处死，剪下双耳,用直径6mm的打孔器分别在同一部位打下圆耳片,称重。以左右耳片重量差作为肿胀度,计算抑制率。实验结果见表2，各给药组的平均耳肿胀度与模型组相比均有显著性(p<0.01)差异，化合物1和化合物2抑制率分别为54.4%和59.5%，其抑制率高于阳性药吲哚美辛。实验结果表明化合物1和2具有显著的抗炎活性，优于阳性药吲哚美辛。

表2.化合物1和2对二甲苯引起的小鼠耳肿胀模型影响实验结果(±s，n=10)

*与模型组比较p<0.01。

四、毒性评价

1、化合物1、化合物2与雷公藤红素对小鼠肝功能的影响对比实验：

昆明种小鼠，雌雄各半，体重18-22g，随机分成空白组、化合物1组、化合物2组和雷公藤红素组，每组10只。化合物1、化合物2与雷公藤红素分别用2％丙二醇配制成混悬液。灌胃给药，化合物1、化合物2与雷公藤红素给药剂量均为3.2mg/kg，空白组给予等体积2％丙二醇。给药24小时后，摘小鼠眼球取血，3000r·min^-1离心制备血清，按试剂盒操作说明检测谷丙转氨酶（alt）和谷草转氨酶（ast）。结果表明（见表3），化合物1和化合物2对小鼠肝损伤很小，而雷公藤红素对小鼠肝损伤严重，说明化合物1和化合物2毒性较低。

表3.对小鼠肝功能的影响对比实验结果(±s，n=10)

*与空白组比较p<0.01；#与雷公藤红素组比较p<0.01。

五、抗炎药物制剂制备

化合物1和化合物2或以其为基本活性的药物组合物可以与药学上合适的辅料或载体结合，采用公知方法制成注射剂、片剂、胶囊剂、滴丸剂、控释制剂、缓释制剂、纳米制剂等制剂抗炎药物。

具体实施方式

下面通过实施例作进一步描述，但本发明并不限于实施例所述范围。

实施例1：

化合物1和化合物2的制备：

1．将雷公藤红素3克用铝箔纸包严实，再用黄泥均匀包裹，形成黄泥包层，包层厚度为0.2~0.5厘米，黄泥用黄土与10%食盐水按毎4克黄土中加入1毫升食盐水的比例和匀制得，自然晾干后，置烘箱内于200℃加热0.5小时，自然冷却至室温，剥离黄泥与铝箔纸，得雷公藤红素热分解混合物。

2．将雷公藤红素热分解混合物用乙腈溶解，经制备高效液相色谱分离(ymc-actusods-ac18色谱柱，流动相：乙腈/水66:34，检测波长210nm)，得化合物1（51mg）和化合物2（46mg）。

实施例2：

化合物1和化合物2的制备：

1．将雷公藤红素3克用铝箔纸包严实，再用黄泥均匀包裹，形成黄泥包层，包层厚度为0.2~0.5厘米，黄泥用黄土与10%食盐水按毎4克黄土中加入1毫升食盐水的比例和匀制得，自然晾干后，置烘箱内于200℃加热1小时，自然冷却至室温，剥离黄泥与铝箔纸，得雷公藤红素热分解混合物。

2．将雷公藤红素热分解混合物用乙腈溶解，经制备高效液相色谱分离(ymc-actusods-ac18色谱柱，流动相：乙腈/水66:34，检测波长210nm)，得化合物1（58mg）和化合物2（42mg）。

实施例3：

化合物1和化合物2的制备：

1．将雷公藤红素3克用铝箔纸包严实，再用黄泥均匀包裹，形成黄泥包层，包层厚度为0.2~0.5厘米，黄泥用黄土与10%食盐水按毎4克黄土中加入1毫升食盐水的比例和匀制得，自然晾干后，置烘箱内于200℃加热3小时，自然冷却至室温，剥离黄泥与铝箔纸，得雷公藤红素热分解混合物。

2．将雷公藤红素热分解混合物用乙腈溶解，经制备高效液相色谱分离(ymc-actusods-ac18色谱柱，流动相：乙腈/水66:34，检测波长210nm)，得化合物1（41mg）和化合物2（30mg）。

实施例4：

化合物1和化合物2的制备：

1．将雷公藤红素3克用铝箔纸包严实，再用黄泥均匀包裹，形成黄泥包层，包层厚度为0.2~0.5厘米，黄泥用黄土与10%食盐水按毎4克黄土中加入1毫升食盐水的比例和匀制得，自然晾干后，置烘箱内于200℃加热5小时，自然冷却至室温，剥离黄泥与铝箔纸，得雷公藤红素热分解混合物。

2．将雷公藤红素热分解混合物用乙腈溶解，经制备hplc分离(ymc-actusods-ac18色谱柱，流动相：乙腈/水66:34，检测波长210nm)，得化合物1（38mg）和化合物2（35mg）。

实施例5：

化合物1和化合物2的片剂制备：取50mg相应化合物与淀粉25mg，糊精25mg混合，用适量30%乙醇湿润，常规制粒，加入适量硬脂酸镁混合，压片，即得。

实施例6：

化合物1和化合物2的胶囊剂制备：取50mg相应化合物与淀粉60mg，糊精10mg，糖粉10mg混合，用适量30%乙醇湿润，常规制粒，装入硬胶囊中，即得。