一种低温生长绿藻及其去除污水中氮和磷的应用的制作方法

本发明涉及一种新型的低温生长藻类植物及用其治理环境中有机污染物的生物技术领域，特别是用于猪粪污水等养殖废水中高浓度氮、磷有机污染物的生物降解处理。

背景技术：

近年来，在农业部门的大力扶持下，我国规模化养殖发展迅猛，有效保障了消费者对肉食品日益增长的需求供应，带来了巨大的产业经济效益；但规模化养殖蓄积产生的大量污水和随意排放，对生态环境造成了极大的污染，同时也容易引发疫病传播和蔓延，严重威胁到人类健康和社会和谐稳定。其中猪粪污水属高浓度有机污水，氮、磷含量大，直接排放会诱发水体富营养化发生，给水体及土壤生态环境造成严重污染，是国家环保部门监管的重点也是防控的难点。如何有效降低猪粪污水中高浓度氮、磷的含量，使之达到国家有关规定的排放标准，不仅关乎生态环境安全，同时也是生猪养殖业能否规模化可持续健康发展的重要制约因素，已成为多学科交叉探索研究迫切解决的热点课题。

绿藻是一种光能自养型生物，具有光合效率高、生长周期短、繁殖快、适应性强、培养简单等特点，其在生长过程中需要吸收环境中的氮、磷等营养物质，用以合成体内复杂的大分子有机质，从而降低水体中氮、磷等有机物质的含量，达到净化水体的效果。

但是，目前绿藻应用于污水中氮和磷的降解还存在一些缺陷，如现有技术中的绿藻都是在常温甚至夏季的高温环境下降解污水中的氮磷，而在低温环境下，这些绿藻生长受阻，降解氮磷能力变低。

技术方案

发明目的：

针对上述技术问题，本发明提供了一种新型绿藻，通过室内实验，其对猪粪污水中氮、磷有机物具有显著消耗降解功能，该藻及其使用技术具有重要的科研价值和巨大的应用潜力。

技术方案：

为达到上述本发明目的，本发明公开了一种绿藻，经鉴定，其隶属于绿藻门(chlorophyta)，绿球藻纲(chlorophyceae)，绿球藻目(chlorococcales)，栅藻科(scenedesmaceae)，四链藻属(tetradesmus)中的弯尖四链藻(tetradesmusacuminatus)，藻株名为wu4，即分类命名为：tetradesmusacuminatuswu4，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国.武汉.武汉大学，邮编：430072，保藏编号为：cctccm2017335，保藏日期为：2017年6月14日。

所述绿藻的18srdna核苷酸如seqidno.1所示。

所述绿藻的培养条件如下：培养温度15±2摄氏度，培养基质为bg11培养基。

所述绿藻藻株是通过从高氮磷含量生活污水水体中取样，经培养分离筛选所得。

培养分离筛选采用稀释涂布划线法：涂布、划线是微生物中获得纯培养的一种基础的经典方法。将藻液进行合适比例稀释，采用0.45μm滤膜孔径的滤膜进行过滤，结合无菌液体培养基反复洗涤滤过藻液，同时采用平板培养和挑取单菌落技术，从而获得无菌藻株。

本发明还提供了所述绿藻去除污水中氮的应用，应用的温度为6-15摄氏度，所述污水为含有高浓度氮、磷有机污染物的养殖废水，例如猪粪污水等。

本发明还提供了所述绿藻去除污水中磷的应用，应用的温度为6-15摄氏度，所述污水为含有高浓度氮、磷有机污染物的养殖废水，例如猪粪污水等。

现有技术中的绿藻都是在常温甚至夏季的高温环境下降解污水中的氮磷，那在低温环境下，这些绿藻生长受阻，降解氮磷能力变低。为此，本发明筛选到一种低温绿藻，能很好的在低温环境下生长，并能在低温条件下去除猪粪污水中氮磷含量，取得的效果显著。

技术效果

相对于现有技术，本发明所述新型绿藻具有以下技术优势：

本发明所述新型绿藻，应用于低温条件下猪粪污水中氮和磷的去除，应用方法简单，氮磷去除率高，效果显著。

附图说明

图1为总磷测定方法中，总磷的标准曲线；

图2为本发明wu4藻株在猪粪污水总磷的去除率

图3为总氮测定方法中，总氮的标准曲线；

图4为本发明wu4藻株在猪粪污水总氮的去除率。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。

实施例中所涉及的试剂和培养基配方：

(1)bg11培养基配方：

其组成成分为：1l去离子水中含有30gnano3、0.8gk2hpo4、1.5gmgso4·7h2o、2.86gh3bo3、1.81gmncl2·4h2o、0.22gznso4·7h2o、0.39gna2moo·2h2o、0.08gcuso4·2h2o、0.05gco(no3)2·6h2o、1.36gcacl2、2gna2co3、0.3g柠檬酸铁铵、0.3g柠檬酸、0.05gedtana2。

(2)(1+1)h2so4

(3)钼酸盐溶液：溶解13g钼酸铵(nh4)6mo7o24·4h2o于100ml去离子水中。溶解0.35g酒石酸锑钾ksbc4h4o7·1/2h2o于100ml去离子水中。在不断搅拌下，将钼酸铵溶液慢慢加到300ml(1+1)h2so4中，加酒石酸锑钾溶液并混合均匀。棕色玻璃瓶，4℃保存。

(4)10％抗坏血酸溶液：溶解10g抗坏血酸用去离子水定容至100ml。棕色玻璃瓶，4℃保存。

(5)5％k2s2o8：溶解5gk2s2o8，用去离子水定容至100ml。

(6)磷酸盐贮备液：称取0.2197gkh2po4，加入5ml的(1+1)h2so4，用去离子水定容至1000ml。

(7)磷酸盐标准溶液：取10ml磷酸盐贮备液于250ml容量瓶中，用去离子水稀释至标线。现配。

(8)碱性过硫酸钾溶液：称取40gk2s2o8，15gnaoh，用去离子水定容至1000ml，贮于聚乙烯瓶。

(9)(1+9)盐酸

(10)硝酸钾标准贮备液：称取0.7218gkno3，用去离子水定容至1000ml。加入2ml三氯甲烷为保护剂，4℃保存。

(11)硝酸钾标准使用液：将贮备液用去离子水稀释10倍而得。

具体操作步骤：

(1)wu4从污水水体中分离所得

稀释涂布划线法：涂布、划线是微生物中获得纯培养的一种基础的经典方法，具体步骤如下：从高氮磷含量生活污水水体中用浮游生物网进行采集，将采集的藻放在装有培养基的样品瓶中。从野外采来的水样有时杂质很多，所以需对采集的水样进行初步的过滤处理。由于样品中藻细胞密度比较低，因此容易造成分离培养的失败，为了避免直接对采集样品分离培养的失败，可先对过滤处理的样品进行富集预处理，向其中加入适量的bg11培养基以加速目标藻种的生长，使样品中的藻细胞达到一定密度后有利于目标藻种的分离培养。把待分离的经过富集培养的藻液样品用灭过菌的bg11培养基进行梯度稀释，然后平板涂布分离法进行藻种分离。在培养基中加入含量为1％琼脂进行高压蒸汽灭菌，灭菌结束后待培养液的温度凉至50度左右时将培养基迅速倒入无菌培养皿中，即制成固体培养基备用。将稀释的藻液用涂布棒均匀地涂在灭菌的培养基表面上，然后放在低温光照培养箱中培养，挑取长势最好的单克隆藻种，即完成新藻株的分离。然后将其接种于无菌的bg11培养基中富集生长。

取50ml上述富集藻液，5000r/min，离心8min。去上清，然后加入液氮充分研磨后，置于一干净离心管中。加入400μlplantzol，振荡混匀，使样品完全悬浮。加入7.5μlrnasea到上述裂解液中，充分混匀。55℃孵育15分钟。加入等体积的酚-氯仿-异戊醇(25:24:1)，振荡混匀，12000rpm离心5min。小心吸取上层水相于干净的离心管中，加入等体积酚-氯仿-异戊醇(25:24:1)，充分颠倒混匀。12000rpm离心5min，去上清。加入500μl70％的乙醇，涡旋振荡5秒，12000rpm离心5min，去上清。再次离心1-2min，吸净残留液体。晾干dna沉淀，加入50μlte，65℃孵育10min溶解dna，期间轻弹数次助溶，4℃保存。

用于扩增真核绿藻的18srdna的引物序列为：

上游5”-acctggttgatcctgccagtag-3”(seqidno.2)

下游5”-accttgttacgacttctccttcctcc-3”(seqidno.3)

pcr反应条件：95℃变性3min；95℃30sec，55℃45sec，72℃1min，32个循环；最后72℃延伸10min。扩增产物由南京擎科生物有限公司完成测序。

该藻株(wu4)的18srdna核苷酸序列如seqidno.1所示，通过观察其在显微镜下的形态及在ncbi数据库中进行比对鉴定，其隶属于绿藻门(chlorophyta)，绿球藻纲(chlorophyceae)，绿球藻目(chlorococcales)，栅藻科(scenedesmaceae)，四链藻属(tetradesmus)中的弯尖四链藻(tetradesmusacuminatus)，藻株名为wu4，即分类命名为：tetradesmusacuminatuswu4，保藏在中国典型培养物保藏中心，，保藏地址：中国.武汉.武汉大学，邮编：430072，保藏编号为：cctccm2017335，保藏日期为：2017年6月14日。

(2)将上述所分离的藻于南京师范大学藻培室，在15±2摄氏度条件下用bg11培养液培养。

(3)猪场养殖污水取自南京农业科学学院养猪场。猪粪废水用0.45μm滤膜过滤，过滤的猪粪废水用作实验材料。

试验用猪场养殖污水的水质状况

(4)本实验在2017年2月份进行，温度控制在6-15摄氏度。取上述过滤好的猪粪废水40ml于100ml锥形瓶中，取5ml的wu4藻液加入其中，做三个平行。为了wu4更好的适应猪粪废水的环境，进行多次转接。

表1wu4第一次接种的生长密度(a750nm)

表2wu4第二次转接的生长密度(a750nm)

表3wu4第三次转接的生长密度(a750nm)

(5)用第三次转接的藻株测其去除猪粪废水中氮磷的含量。

(6)本实验中猪粪废水总磷的测定方法为钼酸铵分光光度法。

①取7支50ml具塞比色管，分别向其加入0，0.5，1，3，5，10，15ml磷酸盐标准溶液，用去离子水定容至25ml。然后向其加入4ml的5％过硫酸钾溶液，加塞后在管口包一块纱布并用绳将其扎紧。

②将上述比色管放入大烧杯中，置于高压灭菌锅中加热，设置1.1kg/cm²，120℃，30min。待灭菌锅中的压力指针表降到零时，取出比色管放冷。然后稀释至50ml标线。

③分别向步骤②得到的消解液中加入1ml抗坏血酸溶液，混匀。30s后加2ml钼酸盐溶液，充分混匀后室温静置15min后，在700nm波长处测定吸光度。扣除空白试验的吸光度后，和对应的磷含量绘制工作曲线(如附图1所示)。

④取水样2ml，离心5000r/min，3min。取上清1ml于50ml具塞比色管，用去离子水定容至25ml。然后向其加入4ml的5％过硫酸钾溶液，加塞后在管口包一块纱布并用绳将其扎紧。

⑤同步骤②。

⑥因水样含有颜色，向其消解液加入混合两份体积的(1+1)h2so4和一份体积的10％抗坏血酸溶液，混合液要当天配置。充分混匀后室温静置15min后，在700nm波长处测定吸光度。扣除空白试验的吸光度后从标准曲线上查得磷含量。

表4wu4藻株去除猪粪污水中总磷的效率(％)

wu4藻株去除猪粪污水中磷的百分比，结果如附图2所示。

(7)本实验中猪粪废水总氮的测定方法为过硫酸钾氧化紫外分光光度法。

①取8支25ml具塞比色管，分别向其加入0，0.5，1，2，3，5，7，8ml硝酸钾标准使用液，并用去离子水稀释至10ml标线。

②向上述具塞比色管加入5ml的碱性过硫酸钾，加塞后在管口包一块纱布并用绳将其扎紧。将上述比色管放入大烧杯中，置于高压灭菌锅中加热，设置1.1kg/cm²，120℃，30min。待灭菌锅中的压力指针表降到最零时，取出比色管，冷却至室温。

③加入(1+9)盐酸1ml，然后用去离子水稀释至25ml标线。混匀后静置10min，用10mm石英比色皿分别在220nm和275nm处测其吸光度(a＝a220-2×a275)。用校正的吸光度绘制标准曲线(如附图3所示)。

④取水样2ml，离心5000r/min，3min。取上清1ml于25ml具塞比色管，用去离子水定容至10ml。下面操作按照标准曲线绘制步骤②-③。然后按照校准吸光度，在校准曲线上查出响应的总氮量，再用下列公式计算总氮含量。

总氮(mg/l)＝m/v

式中：m是从标准曲线上查得的含氮量(μg)；

v是所取的水样体积(ml)

表5wu4藻株去除猪粪污水中总氮的效率(％)

wu4藻株去除猪粪污水中氮的百分比，结果如附图4所示。

以上所述的实施实例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改或改进等，均应包含在本发明范围之内。

sequencelisting

<110>南京师范大学

<120>一种低温生长绿藻及其去除污水中氮和磷的应用

<130>2017.06

<160>3

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>1668

<212>dna

<213>四链藻属(tetradesmus)

<400>1

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tctggaagggacgtatatattagataaaaggccgaccgagctttgctcgacccgcggtga180

accatgatatcttcacgaagcgcatggccttgagccggcgctgttccattcaaatttctg240

ccctatcaactttcgatggtaggatagaggcctaccatggtggtaacgggtgacggagga300

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<213>人工序列

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