一种成熟脂肪细胞去分化培养的装置及方法与流程

本发明涉及细胞生物学技术领域，具体涉及一种成熟脂肪细胞去分化培养的装置及方法。

背景技术：

脂肪细胞的数量和体积不仅直接影响家畜的肉品质，更与人类的健康密切相关，由肥胖引起的糖尿病、高血压、动脉粥样硬化等疾病已成为危害人类健康的主要杀手，对人类的生存和发展造成巨大威胁，因此研究脂肪细胞的增殖和分化的分子机理具有重要意义。众所周知，脂肪细胞的分化起始于中胚层多潜能干细胞，经过前体脂肪细胞(脂肪母细胞、前脂肪细胞和不成熟脂肪细胞3个阶段)逐渐发育为成熟脂肪细胞。一直以来，人们认为成熟脂肪细胞是一种终末分化的细胞，不具有分裂增殖能力和利用价值。然而，近年来的研究发现，当成熟脂肪细胞用天花板方法培养时，其表型会发生逆转，自发去分化为具有增殖能力的dfat细胞，并且这种细胞体外可向多个方向分化，包括成脂、成软骨、成骨、成肌、成神经和成血管等。同时，由于去分化脂肪(dfat)细胞比骨髓来源间充质干细胞更容易获得，比脂肪来源基质细胞纯度更高，dfat细胞已成为组织工程理想的细胞来源，并已在多个动物模型上取得研究成果。因此，将成熟脂肪细胞在体外更好的培养到去分化状态的dfat细胞成为目前研究的新的发展方向。

针对于此，现已有发明利用成熟脂肪细胞具有浮力，而去分化后的脂肪细胞恢复其贴壁能力的特点在培养瓶中对其进行去分化培养，称为“天花板”法。该法培养成熟脂肪细胞去分化虽然操作简单但是耗费较大，需要将整个培养瓶都充满细胞培养液，容易造成浪费而且不利于细胞培养过程中培养瓶内外的气体交换，不利于细胞的生长，且操作过程中容易出现漏液，加大了细胞污染的危险。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种成熟脂肪细胞去分化培养的装置及方法。本发明提供的装置培养成本低、细胞污染率低、操作方便，细胞生长好，有利于后期实验的开展。

本发明提供了一种成熟脂肪细胞去分化培养的装置，包括培养皿(1)、皿盖(2)和离体设置的敞口小室(3)；所述小室在脂肪细胞贴壁培养阶段使用时倒置于培养皿中且能够完全没入培养皿中，在脂肪细胞贴壁增殖培养阶段使用时，与培养皿离体正置放置。

本发明还提供了一种基于上述技术方案所述装置的成熟脂肪细胞去分化培养方法，包括以下步骤：

将成熟脂肪细胞液加入到培养皿中，再将小室倒置于培养皿中，使小室中充满成熟脂肪细胞液，倒置进行脂肪细胞贴壁培养6～7天，待50～60％的细胞贴于小室上壁，将小室正置，去掉培养皿，皿盖盖于小室上进行贴壁增殖培养3～7天，得到去分化脂肪细胞。

优选的是，所述成熟脂肪细胞液的制备方法包括以下步骤：

将脂肪细胞剪碎，加入质量浓度为0.25％的胰蛋白酶消化液进行消化，所述消化后用含体积浓度为20％胎牛血清的dmem培养基终止消化，得到消化细胞液；

用孔径为250μm的尼龙网筛过滤所述消化细胞液，将过滤得到的细胞液在1200r/min转速下离心10min，弃沉淀，离心得到的顶层悬浮液为成熟脂肪细胞液。

优选的是，所述质量浓度为0.25％的胰蛋白消化液的体积与脂肪细胞的质量比为(0.5～1)ml：1g。

优选的是，所述脂肪细胞贴壁增殖培养过程中每2d换液一次。

优选的是，换液用培养基为含体积浓度20％胎牛血清的dmem培养基。

优选的是，所述整个培养过程的条件为：37℃，5％co2。

本发明提供了一种成熟脂肪细胞去分化培养的装置。本发明所述装置将小室倒置于培养皿中，小室的顶部代替了培养瓶的“天花板”，有效地减少了利用“天花板”法培养成熟脂肪细胞去分化时培养液的使用量，既达到了诱导成熟脂肪去分化的效果又避免了不必要的浪费。同时，由于培养过程中培养皿内培养液不会充满整个细胞培养皿，因此也就避免了阻碍装置内外气体的交换；整个装置为半封闭装置，细胞在培养的过程中不会直接与空气接触，操作过程中也不会出现漏液等现象，有效的防止了细胞污染；且倒置的小室能够置于培养皿中，当细胞贴壁后，取出再正置培养，这样便解决了换液和传代过程中的操作不便的问题。

附图说明

图1为本发明提供的成熟脂肪细胞去分化培养的装置结构图；

图2为本发明提供的成熟脂肪细胞去分化培养装置培养细胞示意图；

图3为本发明提供的成熟脂肪细胞去分化培养原理图；

图4为本发明实施例1提供的成熟脂肪细胞去分化培养流程图。

具体实施方式

本发明提供了本发明提供了一种成熟脂肪细胞去分化培养的装置，包括培养皿(1)、皿盖(2)和离体设置的敞口小室(3)；所述小室在脂肪细胞贴壁培养阶段使用时倒置于培养皿中且能够完全没入培养皿中，在脂肪细胞贴壁增殖培养阶段使用时，与培养皿离体正置放置。

本发明对所述培养皿的大小没有特殊的限定，根据细胞培养需求进行选择即可，所述皿盖的大小与培养皿配套；且在使用过程中，皿盖也能够用于小室作为皿盖。

在本发明的实施例中，所述小室的高度小于培养皿的高度，优选的，所述小室的高度为培养皿高度的1/3～1/2。

本发明提供的成熟脂肪细胞去分化培养的装置结构图如图1所示，其中1为培养皿，2为皿盖，3为小室；在图1中，上图为装置俯视图，下图为装置正视图。小室在使用时，放置于培养皿和皿盖内部，或者小室与皿盖结合使用。

成熟脂肪细胞去分化培养装置培养细胞的示意图如图2所示，成熟脂肪细胞贴于小室上壁生长。

本发明还提供了基于上述技术方案所述装置的成熟脂肪细胞去分化培养方法，包括以下步骤：

将成熟脂肪细胞液加入到培养皿中，再将小室倒置于培养皿中，使小室中充满成熟脂肪细胞液，倒置进行脂肪细胞贴壁培养6～7天，待50～60％的细胞贴于小室上壁，将小室正置，去掉培养皿，皿盖盖于小室上进行贴壁增殖培养3～7天，得到去分化脂肪细胞。

成熟脂肪细胞去分化培养原理图如图3所示，成熟的脂肪细胞内含一个大的圆形脂肪滴，附着能力弱，常漂浮于培养液中。在去分化培养过程中，成熟脂肪细胞中的脂滴会逐渐裂解成多个小脂滴，且细胞的贴壁能力逐渐变强，随着去分化培养的进行细胞中的脂滴会逐渐减小直至消失，当细胞完全去分化时将再次具有增殖分化的能力，细胞贴壁生长。

在本发明中，所述成熟脂肪细胞液的制备方法包括以下步骤：

将脂肪细胞剪碎，加入质量浓度为0.25％的胰蛋白酶消化液进行消化，所述消化后用含体积浓度为20％胎牛血清的dmem培养基终止消化，得到消化细胞液；

用孔径为250μm的尼龙网筛过滤所述消化细胞液，将过滤得到的细胞液在1200r/min转速下离心10min，弃沉淀，离心得到的顶层悬浮液为成熟脂肪细胞液。

本发明对所述脂肪细胞的来源没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的市售脂肪细胞即可，或采用本领域技术人员熟知的市售脂肪组织，进行处理得到。本发明所述脂肪组织的处理方法优选为：除去可见的结缔组织和血管，pbs缓冲液冲洗后进行上述的剪碎操作等。本发明所述脂肪细胞优选为动物脂肪细胞。

将脂肪细胞剪碎，加入质量浓度为0.25％的胰蛋白酶消化液进行消化，所述消化后用含体积浓度为20％胎牛血清的dmem培养基终止消化，得到消化细胞悬液。在本发明中，所述消化的时间优选为4～5min。在本发明中，所述质量浓度为0.25％的胰蛋白消化液的体积与脂肪细胞的质量比为(0.5～1)ml：1g，更优选为1ml：1g。

在本发明中，终止消化用培养基为含20％胎牛血清的dmem培养基，本发明对所述胎牛血清和dmem培养基的来源没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的常规市售胎牛血清和dmem培养基即可。在本发明实施例中所述dmem培养基优选包括表1所示组分：

表1dmem培养基组成

得到消化后的脂肪细胞后，本发明用孔径为250μm的尼龙网筛过滤所述消化细胞液，将过滤得到的细胞液在1200r/min转速下离心10min，离心得到的顶层悬浮液为成熟脂肪细胞液。本发明对所述尼龙网筛的来源没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的尼龙网筛的常规市售产品即可。在本发明中，所述成熟脂肪细胞的浓度优选为1×10⁵～5×10⁶个/ml。

得到成熟脂肪细胞液后，本发明将成熟脂肪细胞液加入到培养皿中，再将小室倒置于培养皿中，使小室中充满成熟脂肪细胞液，倒置进行脂肪细胞贴壁培养6～7天，在倒置培养阶段不需换液，以免有细胞的丢失，待50～60％的细胞贴于小室上壁，将小室正置，去掉培养皿，皿盖盖于小室上进行贴壁增殖培养3～7天，得到去分化脂肪细胞。在本发明中，在使用时，将小室倒置于培养皿中，小室底部平面与小室外培养皿内的成熟细胞液液面优选齐平，保证小室中充满成熟脂肪细胞液。

在本发明中，所述正置培养过程中，液体体积优选为小室容积的1/4～1/2。本发明将小室置于培养皿内进行培养，所需的培养基用量大大减少，有利于节约实验成本；与常规的“天花板”培养方法相比，培养液使用量低、避免了与空气的直接接触，能够克服操作过程中的漏液，培养过程中与空气直接接触等问题，有效地防止了细胞的污染；利用培养皿替代培养瓶，倒置小室的顶部替代传统培养瓶的“天花板”，避免了培养基充盈瓶口，可以留有更多的气体交换空间，解决了“天花板”法气体交换的问题，更有利于细胞在皿内的生长。本发明对培养皿和小室的形状没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的培养皿即可，小室形状优选与培养皿形状相同，即开口圆柱形。

在本发明中，所述脂肪细胞贴壁增殖培养过程中每2d换液一次。在本发明中，换液用培养基为含20％胎牛血清的dmem培养基。在本发明中，整个培养过程的条件为37℃，5％co2。换液时，小室中培养基的体积优选占小室体积的1/4～1/3。

下面结合具体实施例对本发明所述的一种成熟脂肪细胞去分化培养的装置及方法做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。

实施例1

实施例1中成熟脂肪细胞去分化培养流程图如图4所示。具体操作如下：

取动物脂肪样组织，除去可见的结缔组织和血管，pbs缓冲液冲洗几遍。

超净台内将组织剪成小块，加入0.25％的胰蛋白酶消化液消化4～5min，用含20％胎牛血清的dmem培养基(完全培养基)等体积终止消化，得到成熟脂肪细胞悬浮液。

用孔径为250μm的尼龙网筛过滤细胞悬液，1200r/min离心10min，取顶层悬浮成熟脂肪细胞液，按1×10⁵个/ml的密度加入直径为60mm，高度为100mm的培养皿中，再将小室(小室顶部直径45mm，高度为50mm)倒置于培养皿中，成熟脂肪细胞悬浮液要充满整个小室，盖上培养皿盖，置于37℃、5％co2培养箱中倒置培养；成熟的脂肪细胞由于浮力小将漂浮贴壁到倒置小室的顶部生长，在培养1d时可见单室脂肪细胞已裂解成多室脂肪细胞，3d时少量的成熟脂肪细胞开始出现纤维状尾巴，之后随着培养时间的延长，成熟脂肪细胞脂滴继续减少，成纤维细胞越来越多，7d时细胞已基本都贴于小室的顶部，但细胞内部仍有少量的脂滴存在，此时将小室正置培养(原培养皿的皿盖作为小室的皿盖，原培养皿的皿底舍弃)，每隔2d换液一次，培养液用量可减少，细胞在小室内可继续发生去分化与增殖。

待成熟脂肪细胞培养至第14天(即正置培养第7天)时，成熟脂肪细胞已基本去分化为dfat细胞，生长密度大约在2.5×10⁶个左右，细胞具有增殖分化能力。此时将小室正置于超净台中，pbs清洗两遍，加入0.25％的胰蛋白酶消化液消化，并用含20％胎牛血清的dmem培养基(完全培养基)等体积终止消化，进行正常的传代培养即可。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。