一种表达猪干扰素-γ基因的重组短短芽孢杆菌及构建方法与流程

本发明涉及一种表达猪干扰素-γ基因的重组短短芽孢杆菌及构建方法。
背景技术：
短短芽孢杆菌是一种安全、无毒性的益生菌，同时具有蛋白分泌能力强和胞外蛋白酶活性低的特点，因此特别适合做为胞外分泌蛋白表达系统。短短芽孢杆菌质粒pny326是一种不能在大肠杆菌中复制的非穿梭质粒，该质粒的弱启动子p5，虽然没有其它芽孢杆菌的启动子强，但较强启动子相比表达更加稳定，适合表达有细胞毒性的蛋白和激素类蛋白，质粒的信号肽切割位点下游第一个酶切位点是psti，使用该酶切位点可最大限度的减少重组蛋白n端无意义序列的存在，但该酶切位点后需要添加2个碱基再连接目的序列，以防止目的序列移码突变。干扰素是在特定的诱生剂作用下，由细胞分泌的抗病毒、抗肿瘤、影响免疫调节和细胞分化的细胞因子。干扰素分为i型和ii型，其中ii型又名干扰素-γ，是由激活的t细胞和nk细胞产生，具有抗病毒和免疫调节功能，干扰素-γ抗病毒活性较i型干扰素低，但它的免疫调节功能较强，因此可做为免疫增强剂使用，具有广阔的应用前景。猪干扰素-γ全长501bp，编码166个氨基酸，其中后146个组成成熟肽。猪干扰素-γ能抑制猪繁殖与呼吸综合症病毒的增殖，在可参与机体的抗猪瘟病毒细胞免疫，在抗沙门氏菌感染中也发挥作用，同时猪干扰素-γ还可以增强仔猪对痢疾抗原的免疫应答。技术实现要素：本发明其目的就在于提供一种表达猪干扰素-γ基因的重组短短芽孢杆菌及构建方法，本发明对短短芽孢杆菌表达的猪干扰素-γ进行了纯化和活性测定。为实现上述目的而采取的技术方案是，一种表达猪干扰素-γ基因的重组短短芽孢杆菌，重组质粒的短短芽孢杆菌为sp3。一种表达猪干扰素-γ基因的重组短短芽孢杆菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）按短短芽孢杆菌密码子偏好性优化并合成猪干扰素-γ基因与短短芽孢杆菌质粒pny326；（2）将合成的猪干扰素-γ基因与短短芽孢杆菌质粒pny326同时用限制性内切酶psti和ecori双酶切；（3）回收双酶切产物进行连接反应，连接产物直接电转化短短芽孢杆菌sp3，使用新霉素抗性筛选转化子，获得重组短短芽孢杆菌。所述双酶切上游酶切位点psti之后，包含两个碱基“aa”,以防止移码突变；所述下游酶切位点之前包含6个组氨酸的核苷酸序列和终止密码子。有益效果与现有技术相比本发明具有以下优点。本发明对短短芽孢杆菌表达的猪干扰素-γ进行了纯化和活性测定，其中猪干扰素-γ能抑制猪繁殖与呼吸综合症病毒的增殖，在可参与机体的抗猪瘟病毒细胞免疫，在抗沙门氏菌感染中也发挥作用，同时猪干扰素-γ还可以增强仔猪对痢疾抗原的免疫应答。附图说明以下结合附图对本发明作进一步详述。图1为poifn-γ-pny326重组质粒的pcr鉴定图（引物poifn-γ-f和poifn-γ-r，产物约473bp）；图2为短短芽孢杆菌为sp3表达猪干扰素-γ蛋白的sds-page图（蛋白大小为16kda）；图3为pny326质粒图谱；图4为pny326质粒的多克隆位点图谱。具体实施方式一种表达猪干扰素-γ基因的重组短短芽孢杆菌，重组质粒的短短芽孢杆菌为sp3。所述的质粒为pny326。一种表达猪干扰素-γ基因的重组短短芽孢杆菌的构建方法，如图1-4所示，包括以下步骤：（1）按短短芽孢杆菌密码子偏好性优化并合成猪干扰素-γ基因与短短芽孢杆菌质粒pny326；（2）将合成的猪干扰素-γ基因与短短芽孢杆菌质粒pny326同时用限制性内切酶psti和ecori双酶切；（3）回收双酶切产物进行连接反应，连接产物直接电转化短短芽孢杆菌sp3，使用新霉素抗性筛选转化子，获得重组短短芽孢杆菌。所述双酶切上游酶切位点psti之后，包含两个碱基“aa”,以防止移码突变；所述下游酶切位点之前包含6个组氨酸的核苷酸序列和终止密码子。实施例1获得猪干扰素-γ基因猪干扰素-γ（np_999113）前体蛋白序列去掉上游20个氨基酸信号肽序列，得到成熟肽序列，见序列表中序列1所示，根据短短芽孢杆菌密码子偏好性进行优化合成，并在上下游添加一些序列，具体依次为：psti保护性碱基（aa)—psti（ctgcag）—防移码序列（aa）—6个组氨酸序列（catcatcatcatcatcat）—猪干扰素γ基因成熟肽基因序列—终止密码子（taa）—ecori（gaattc）—ecori保护性碱基（gc），见序列表中序列2所示。序列1sycqapffkeitilkdyfnastsdvpnggplfleilknwkeesdkkiiqsqivsfyfkffeifkdnqaiqrsmdvikqdmfqrflngssgklndfeklikipvdnlqiqrkaiselikvmndlsprsnlrkrkrsqtmfqgqrask序列2aactgcagaacatcatcatcatcatcatagctattgccaggcgccgttctttaaagaaatcacgattctgaaagactacttcaacgcgagcacgagcgacgtgccgaacggcggaccgctgtttctggaaattctgaaaaactggaaagaagaaagcgataaaaagattatccagagccagatcgtgagcttctactttaaattcttcgaaattttcaaggacaaccaagcgattcaacgcagcatggatgtcattaaacaggacatgtttcaacgcttcctgaacggcagcagcggcaaactgaacgatttcgaaaaactgatcaaaatcccggtcgataacctgcagattcagcgcaaagcgatcagcgagctgatcaaagtcatgaacgatctgagcccgcgcagcaacctgcgcaaacgcaaacgcagccagacgatgttccaaggccaacgcgcgagcaaataagaattcgc实施例2poifn-γ基因和pny326质粒的双酶切反应和连接反应用psti和ecori分别对poifn-γ基因和pny326质粒双酶切，双酶切反应体系为：psti2ul，ecori2ul，poifn-γ基因/pny326质粒20ul，ddh2o12ul，10×mbuffer4ul，共40ul。于37℃温箱反应3h后，使用1.2%琼脂糖凝胶电泳回收poifn-γ基因和pny326质粒的酶切产物，将回收的酶切产物进行连接反应，连接体系为：基因8ul，质粒8ul，t4dna连接酶2ul，10×buffer2ul，总体积为20ul，4℃过夜连接。实施例3构建重组短短芽孢杆菌1、连接产物电转短短芽孢杆菌sp3将连接poifn-γ基因和pny326质粒连接产物直接电转短短芽孢杆菌sp3，其步骤为：90ul短短芽孢杆菌sp3感受态细胞中加入10ul连接产物，轻轻混匀；将连接产物和感受态混合物缓慢加入2mm电转杯底部，冰浴10min；设置参数电压2000v、电容50uf、电阻200ω，电转完成后后转移至1.5mlep管中，30℃摇床80rpm缓慢复苏1h；复苏好的转化产物通过涂布新霉素（30ug/ml）平板筛选，37℃培养15-18h。2、转化子鉴定单菌落在新霉素（30ug/ml）抗性液体培养基中扩大培养，菌涂提质粒前加适量溶菌酶以破坏短短芽孢杆菌细胞壁，提取质粒做为pcr扩增模板，通过扩增poifn-γ序列并测序来鉴定重组短短芽孢杆菌。pcr扩增引物为：poifn-γ-fctgcagaacatcatcatcatcatcpoifn-γ-r：gaattcttatttgctcgcgcgttggcpcr体系为：poifn-γ-f5ul，poifn-γ-r5ul，dntp5ul，10×buffer5ul，transt-taq酶1ul，转化子菌液1ul，ddh2o28ul，总体积50ulpcr扩增程序为：预变性，95℃，5min；变性，95℃，30sec；退火，55℃，30sec；延伸，72℃，1min；总延伸，72℃，5min。其中，变性，退火，延伸，30cycle。pcr扩增完成后，pcr原液进行琼脂糖凝胶电泳，于473bp处有清晰条带，pcr原液同时测序，测序结果与合成基因一致。实施例4重组短短芽孢杆菌sp3的表达平板上挑取重组短短芽孢杆菌单菌落接种于含新霉素30ug/ml的3mlt2液体培养基（葡萄糖1.0%，蛋白胨1.0%，牛肉膏0.5%，酵母提取物0.2%），30℃120rpm摇床培养48-64h，表达的猪干扰素-γ被分泌至培养基上清。实施例5重组短短芽孢杆菌表达猪干扰素-γ的纯化1、饱和硫酸铵沉淀培养基上清中的猪干扰素-γ培养完成的菌液最大转速离心30min，弃菌体沉淀，将等体积的饱和硫酸铵溶液（4.1mol/l，25℃）边搅拌边慢慢加入，加完放磁力搅拌器上4℃搅拌过夜，使蛋白充分沉淀。10000rpm4℃离心30min，弃上清保留沉淀，将沉淀溶于少量（10-20ml）pbs-0.2g/l叠氮钠中，使沉淀溶解，再使用透析袋4℃透析48h，每隔6小时更换透析缓冲液，以彻底去除硫酸铵。2、猪干扰素-γ蛋白镍柱纯化相关试剂如下：母液1：29.22g氯化钠，2.42gtris-base，ddh2o定溶至1l，调节ph=8.0。母液2：6.06gtris-base，ddh2o定溶至1l，调节ph=8.0。bindingbuffer：0.1702g咪唑，溶于500ml母液1。elutionbuffer：17.02g咪唑，溶于500ml母液1。washingbuffer:2.3828g咪唑，溶于500ml母液2。先用bindingbuffer平衡镍离子亲和层析柱，然后将待纯化的样品上样于镍柱，结合30min左右，收集留出液flowthrough，用washingbuffer洗3个柱体积，收集washthrongh，最后用elutionbuffer洗脱蛋白，收集eluent.将bindingbuffer，washthrongh，eluent。将镍柱收集的蛋白用milipore压力超滤浓缩装置通过30kda超滤膜截留浓缩至10ml左右，将样品通过gelfiltrationbuffer平衡过的superdex200分子筛进行分离。实施例6猪干扰素-γ的sds-page验证1、相关试剂的配制1.1、tris-hcl缓冲液(1mol/l,ph8.8)、tris-hcl缓冲液(0.5mol/l,ph6.8)购于北京诺博莱德科技有限公司1.2sds-page分离胶（15%）成分体积（ml）ddh2o4.630%丙烯酰胺101.5mtris-hcl（ph=8.8）510%sds0.210%过硫酸铵0.2temed0.008总体积201.3、sds-page浓缩胶成分体积（ml）ddh2o4.130%丙烯酰胺1.01.0mtris-hcl（ph=6.8）0.7510%sds0.0610%过硫酸铵0.06temed0.006总体积61.4、sds-page电泳缓冲液（tris-glycine）：9.4g甘氨酸、1.51gtris-base、0.5gsds，ddh2o定容至500ml；1.5、考马斯亮蓝染色液：称取1.0g考马斯亮蓝r-250，加入50ml冰醋酸、25ml无水乙醇和425mlddh2o，搅拌溶解后过滤；1.6、考马斯亮蓝脱色液：50ml冰醋酸、25ml无水乙醇，用ddh2o定容至500ml；1.51×tris-glycine电泳缓冲液（0.5l）：1.51gtris粉末、9.4g甘氨酸、0.5gsds、ddh2o定容至0.5l；2、纯化猪干扰素-γ的sds-page验证将纯化的猪干扰素-γ中添加sds-pageloadingbuffer，沸水浴15min，以蛋白质标准分子量为参考，在分离胶为15%的sds-page蛋白胶上电泳；按以下步骤操作：2.1、清洗bio-rad玻璃板，干燥后安装，按上配方配制分离胶，1mm胶板中加入2ml分离胶液体，至梳齿下1.5cm，覆盖少量ddh2o，待凝固后倒掉覆盖的ddh2o，用滤纸吸净残留的ddh2o；2.2、同样的方法按上配方配制浓缩胶，灌制于分离胶之上，立即插入1mm胶梳，室温下凝固；2.3、待浓缩胶制备完成，拔下胶梳，立即将胶板固定于电泳装置上，电泳槽内加入电泳缓冲液，排尽凝胶底部玻璃板间的气泡；2.4、每孔加样20μl,接通电源，设定电压80v/cm，待染料进入浓缩胶后，调节电压至120v/cm，至溴酚兰染料距胶底部2cm处停止电泳；2.5、取下凝胶，考马斯亮蓝染色液中染色过夜；2.6、过夜染色完成后，使用考马斯亮蓝脱色液进行脱色，每30分钟换脱色液，直到看到清晰的条带为止。结果如图2所示。实施例7重组猪干扰素-γ及活性测定使用细胞病变抑制法测定重组短短芽孢杆菌表达的猪干扰素-γ生物活性，具体操作为：将纯化的猪干扰素-γ稀释2倍，做为细胞维持液，作10个稀释度，接至细胞长满单层的96也细胞板，每个稀释度加0.1ml,放37℃co2培养箱孵育16小时以上，孵育完毕后倒掉上清，上述10个稀释度孔中分别加0.1ml水泡性口炎病毒（100tcid50）,设3个对照：只加干扰素，不加病毒；不加干扰素，只加病毒；不加干扰素，不加病毒。放37℃co2培养箱孵育24h后弃上清，加入50ul结晶紫染色液，30min后弃上清，单蒸水冲洗后置于酶标仪测波长570nm处吸收值，用是反应平行线法计算样品的效价iu值。结果显示，重组短短芽孢杆菌表达猪干扰素-γ的效价约为1000iu/毫升。当前第1页12