一株表达耐热α-淀粉酶基因的重组乳酸乳球菌及构建方法与应用与流程

本发明涉及一株表达耐热α-淀粉酶基因的重组乳酸乳球菌及构建方法与应用。

背景技术

α-淀粉酶可分解淀粉分子链中的α-1,4-葡萄糖苷键，将淀粉分解成短链糊精、寡糖和麦芽糖和葡萄糖，是工业生产中应用最为广泛的酶制剂之一，淀粉是动物能量的主要来源，饮料中的淀粉为动物提供大部分能量，而淀粉酶是淀粉消化的关键酶，在饲料中添加α-淀粉酶可以提高畜禽对淀粉类饲料的消化与利用，而耐热α-淀粉酶除具有常温淀粉酶的常规活性外，还有耐高温，抗逆性强等特性，因此具有更加广阔的应用前景。乳酸乳球菌是一类长期应用于食品发酵业的有益微生物，具有帮助消化、健康肠道、防止腹泻等诸多优点，并已证明其为安全级微生物，无致病性。

技术实现要素：

本发明其目的就在于提供一株表达耐热α-淀粉酶基因的重组乳酸乳球菌及构建方法与应用，本发明中重组乳酸乳球菌诱导表达产物采用喷雾方式直接喷洒在饲料表面饲喂猪，既可发挥乳酸乳球菌促进增重和降低料重比等益生菌功效，又可发挥耐热α-淀粉酶促进猪肠道消化淀粉类饲料的功效。

为实现上述目的而采取的技术方案是，

一种表达耐热α-淀粉酶基因的重组乳酸乳球菌，重组乳酸乳球菌为nz9000。

一种表达耐热α-淀粉酶基因的重组乳酸乳球菌的构建方法，包括以下步骤：

（1）合成超嗜热古菌(thermococcussp.hj21)菌株产耐热α-淀粉酶基因，在序列上游添加6个组氨酸的基因序列，并在其上下游分别引入ncoi和xbai两个限制性内切酶位点；

（2）构建重组质粒：将耐热α-淀粉酶基因克隆到乳酸乳球菌质粒pnz8148并转化到大肠杆菌mc1061；

（3）重组质粒电转化到乳酸乳球菌nz9000中，得到表达耐热α-淀粉酶的重组乳酸乳球菌。

一种表达耐热α-淀粉酶基因的重组乳酸乳球菌的应用，所述的表达耐热α-淀粉酶基因的重组乳酸乳球菌诱导表达产物采用喷雾方式直接喷洒在饲料表面饲喂猪，既可发挥乳酸乳球菌促进增重和降低料重比等益生菌功效，又可发挥耐热α-淀粉酶促进猪肠道消化淀粉类饲料的功效。

有益效果

与现有技术相比本发明具有以下优点。

本发明表达耐热α-淀粉酶基因的重组乳酸乳球菌诱导表达产物采用喷雾方式直接喷洒在饲料表面饲喂猪，既可发挥乳酸乳球菌促进增重和降低料重比等益生菌功效，又可发挥耐热α-淀粉酶促进猪肠道消化淀粉类饲料的功效。

附图说明

以下结合附图对本发明作进一步详述。

图1为筛选耐热α-淀粉酶基因与pnz8148质粒连接的阳性克隆子电泳图（引物α-amy-f和α-amy-r，产物约945bp）；

图2为乳酸乳球菌nz9000表达α-淀粉酶蛋白的westernblot图（蛋白大小在34kd左右）；

图3为pnz8148质粒图谱。

具体实施方式

一种表达耐热α-淀粉酶基因的重组乳酸乳球菌，重组乳酸乳球菌为nz9000。

所述的质粒为pnz8148。

一种表达耐热α-淀粉酶基因的重组乳酸乳球菌的构建方法，如图1-3所示，包括以下步骤：

（1）合成超嗜热古菌(thermococcussp.hj21)菌株产耐热α-淀粉酶基因，在序列上游添加6个组氨酸的基因序列，并在其上下游分别引入ncoi和xbai两个限制性内切酶位点；

（2）构建重组质粒：将耐热α-淀粉酶基因克隆到乳酸乳球菌质粒pnz8148并转化到大肠杆菌mc1061；

（3）重组质粒电转化到乳酸乳球菌nz9000中，得到表达耐热α-淀粉酶的重组乳酸乳球菌。

一种表达耐热α-淀粉酶基因的重组乳酸乳球菌的应用，其特征在于，所述的表达耐热α-淀粉酶基因的重组乳酸乳球菌诱导表达产物采用喷雾方式直接喷洒在饲料表面饲喂猪，既可发挥乳酸乳球菌促进增重和降低料重比等益生菌功效，又可发挥耐热α-淀粉酶促进猪肠道消化淀粉类饲料的功效。

实施例1

耐热α-淀粉酶基因和引物的合成

耐热α-淀粉酶蛋白序列（accession：abu98335）去掉上游信号肽的成熟序列如序列表中序列1所示，通过乳酸乳球菌的密码子偏好性表进行密码子优化，在序列上游添加6个组氨酸，便于后期纯化和验证，并在其上下游分别设计ncoi和xbai两个限制性内切酶位点及保护性碱基，对优化好的序列进行人工合成。序列如序列表中序列2所示。

表1序列1

akaetlenggvimqafywdvpgggiwwdtiaqkipdwasagisaiwippaskgmsggysmgydpydyfdlgeyyqkgtvetrfgskaelvnmintahaynmkviadivinhraggdlewnpfvndytwtdfskvasgkytanyldfhpnelhagdsgtfggypdichdkswdqywlwasqesyaaylrsigvdawrfdyvkgygawvvkdwlswwggwavgeywdtnvdallswaydsgakvfdfplyykmdeafdnnnipalvdalrnggtvvsrdpfkavtfvanhdtdiiwnkypayafilt

表2序列2

catgccatggcatcatcatcatcatcatgcaaaagctgaaacattagaaaatggtggtgttattatgcaagctttttattgggatgttccaggtggaggtatttggtgggatactattgcacaaaaaattccagattgggcatctgctggtatttcagcaatttggattccaccagcatcaaaaggtatgtctggaggttattcaatgggatatgatccatatgattattttgatcttggggaatattatcaaaaaggtacagttgaaaccagatttggttcaaaagcagaattagttaatatgattaataccgcacacgcatataatatgaaagttattgctgatattgtgattaatcacagagcaggtggtgatttagaatggaatccatttgttaatgattatacctggactgatttttcaaaagttgcttctggtaaatataccgctaattatttagattttcacccaaatgaacttcacgctggtgattcaggaacttttggaggttatccagatatttgtcatgataaatcatgggatcaatattggttatgggcttcacaagaatcatatgctgcatatttacgttcaattggtgttgatgcatggcgttttgattatgttaaaggttatggtgcatgggttgttaaagattggttatcatggtggggtggttgggctgttggagaatattgggatactaatgttgatgcattactttcatgggcttatgattctggtgctaaagtttttgattttccattatattataaaatggatgaagcttttgataataataatattccagcccttgtggatgctttacgtaatggaggaactgttgtttctcgtgatccatttaaagcagttacatttgttgcaaatcacgatactgatattatttggaataaatatccagcctatgcttttattcttacttctagagc

实施例2

构建乳酸乳球菌重组质粒

用ncoi和xbai分别对耐热α-淀粉酶基因和pnz8148质粒双酶切，双酶切反应体系为：ncoi2ul，xbai2ul，耐热α-淀粉酶基因/pnz8148质粒40ul，bsa1ul，10×mbuffer5ul，共50ul。于37℃温箱反应3h后，加入10ul的6×loadingbuffer，使用1.2%琼脂糖凝胶电泳分别跑胶，回收耐热α-淀粉酶基因和pnz8148质粒的酶切片段，回收的基因和质粒片段后，进行t4dna连接酶连接反应，连接体系为：基因5ul，质粒12ul，t4dna连接酶1ul，10×buffer2ul，总体积为20ul。将反应体系放入4℃冰箱静置反应18h。将连接产物转化mc1061大肠杆菌感受态细胞中，涂布于含氯霉素50ug/ml的lb固体平板上，每个平板涂200ul,37℃倒置培养16-18h，对疑似的阳性转化子进行菌落pcr扩增鉴定并测序，鉴定引物为α-amy-f和α-amy-r

（α-amy-f：ccatggcatcatcatcatcatcatgcaaaa；α-amy-r：tctagaagtaagaataaaagcataggct），将疑似阳性转化子的pcr原液送北京奥科生物工程有限公司测序，测序结果与目的基因进行序列对比一致。

实施例3

构建重组乳酸乳球菌

将质粒小量提取试剂盒提取的α-淀粉酶基因和pnz8148的重组质粒电转化乳酸乳球菌nz9000，转化产物涂于含氯霉素25ug/ml的gm17培养基平板上，每个平板涂200ul,30℃倒置培养48-72h。对疑似的阳性转化子进行菌落pcr扩增鉴定并测序：疑似阳性重组乳酸乳球菌单菌落先于含氯霉素25ug/ml的gm17液体培养基中进行扩大培养，收集菌体后用溶菌酶对细菌进行破细胞壁处理，再用质粒小量提取试剂盒提质粒，以所提质粒为模板，α-amy-f和α-amy-r为鉴定引物，进行pcr扩增，将pcr原液送北京奥科生物工程有限公司测序，测序引物用pnz8148-f，测序结果与目的基因进行序列对比一致，即获得了重组乳酸乳球菌。

实施例4

重组乳酸乳酸球的表达及酶活性测定

平板上挑取重组乳酸乳球菌单菌落接种于含氯霉素25ug/ml的5mlgm17液体培养基中，30℃静置培养过夜；将过夜培养物分别吸取2ml各加入含氯霉素25ug/ml的50mlgm17液体培养基中，30℃培养到od600=0.4，向其中一瓶加5ul诱导剂nisin母液，继续静置诱导培养24h，常温2500rpm离心10min，所得上清液即为耐热α-淀粉酶酶液，对酶液进行westernblot验证，用tbst1:5000稀释his-tag单抗做为一抗，用羊抗鼠lgg-hrp做为二抗，孵育完成后使用hrp-dab底物显色试剂盒进行显色，结果显示在35kd处可以看到明显条带，而未添加诱导剂的重组乳酸乳球没有可见的蛋白条带（见图2）。

使用商品化的α-淀粉酶活力测定试剂盒测定酶液中耐热α-淀粉酶的活力，结果表明，重组乳酸乳球菌经诱导后产生的耐热α-淀粉酶酶液的酶活（cu/ml）为75.9cu/ml。

实施例5

表达耐热α-淀粉酶基因的重组乳酸乳酸球对断奶仔猪生产性能的影响挑选平均体重6.85kg，30头23日龄断奶仔猪随机分成3组，每组10头，做为试验对象，对三组基础日粮分别使用喷雾器均匀喷洒以下三种培养基：

1、使用gm17液体培养基培养表达耐热α-淀粉酶基因的重组乳酸乳酸球经诱导剂nisin诱导的全培养液（含重组乳酸乳球菌1000亿/l，含耐热α淀粉酶0.5g/l）；

2、使用gm17液体培养基培养表达耐热α-淀粉酶基因的重组乳酸乳酸球菌的全培养液（含重组乳酸乳球菌1000亿/l，不经诱导，不含耐热α-淀粉酶）；

3、gm17液体培养基；

将所有猪只单独饲于不锈钢笼内，饲喂时间为每天8:00、12:00、18:00，三种培养基的喷洒量为每吨饲料1l，每次喂料量根据采食量进行调整，以料槽内有少量余料为宜，自由饮水。猪舍相对温度60%左右，舍温25℃-28℃。于每天19:00收集余料，70℃烘干至恒重。于试验第15日早上8:00空腹称重，计算平均日增重和料重比。饲养结果见下表。

注：同行肩标字母不同者表示差异显著（p<0.05）。

结果显示，经诱导表达耐热α-淀粉酶的重组乳酸乳球菌，与空白培养基对照组和不表达耐热α-淀粉酶的重组乳酸乳球菌相比，可以显著提高23日龄断奶仔猪日增重27.7%和21.5%；降低料重比12.6%和8.4%。