本发明涉及一种基于单分子测序的同卵双胞胎法医检测试剂盒及其检测方法，属于基因测序领域。
背景技术：
：法医dna分析技术随着基因研究领域的高速发展，越来越多的为涉及个体识别的案件提供客观依据。其主要原理为通过检测个体之间基因层面存在的差别，对不同个体进行识别。现在已经成为法庭科学中的一项重要组成部分。但是在涉及同卵双胞胎的案件中，由于其二者由同一受精卵发育而成，基因极为相似，虽然在同卵双胞胎的基因并非100％一致，但由于二者间差异非常细小，传统dna分析手段无法确认嫌疑人究竟是同卵双胞胎的哪一位，故亟待找到一种可以检测到同卵双胞胎个体间在基因层面上区别的方法，以对这种“基因相同”的不同个体进行区别。寻找解决方案的其中一个方向就是找到一个标记基因，根据其在双胞胎之间的差异为个体识别提供依据。近年来大量文献表明dyz1这一人类y染色体中的基因，可以在同卵双胞胎间作为标记基因对其进行区分【1】，基因名为dyz1的卫星序列约占人类y染色体总量的20％【2】，男性y染色体中中dyz1被鉴定为一个3.4kb大小的条带【3】，其主要包含一5核苷酸重复模组，如“ttcaa”“atcca”“ttaca”等，一个正常男性y染色体包含3000-3400个dyz1序列的拷贝，虽然dyz1基因不参与重组【4】，但其也被推测其在基因组中中具有重要性，大量重复的序列片段会承载不适当的突变负荷。dyz1现在报告在染色质折叠和维护中起着至关重要的作用。由于dyz1处于人类y染色体异染色体区域，理论上同卵双胞胎的受精卵在分裂早期阶段，各自的y染色体会发生缠绕而发生变异，在发育为个体后便能偶以这些突变作为标记予以区分。sahu等人利用限制性内切酶酶谱分析和sanger测序的方法证明dyz1基因在同卵双胞胎中具有多态性【1】。此研究结果为dyz1作为一种用于同卵双胞胎个体识别基因标记提供理论基础。但在这sahu的研究中，他们采用sanger法对dyz1基因进行测序，这种方法不但工作量大，用时长，更重要的是在对dyz1拷贝进行测序时，由于其主要由多种重复单元组成，一代和读长(800bp)无法跨越重复区，加之dyz1序列本身拷贝量庞大，测序得出的相似的碎片化的序列信息就无法拼接。【1】sahu,monalisha,andjosyulag.prasuna."twinstudies:auniqueepidemiologicaltool."indianjournalofcommunitymedicine:officialpublicationofindianassociationofpreventive&socialmedicine41.3(2016):177.【2】yadavsk,kumaria,alis:fateofthehumanychromosomelinkedgenesandlociinprostatecancercelllinesdu145andlncap.bmcgenomics2013,14:323.}【3】nakahoriy,mitanik,yamadam,nakgomey:ahumanychromosomespecificrepeateddnafamily(dyz1)consistsofatandemarrayofpentanucleotides.nucleicacidres1986,14:7569–7580.【4】lahnbt,pearsonnm,jegaliank:thehumanychromosomeinthelightofevolution.natrevgenet2001,2:207–216技术实现要素：本发明的目的之一是提供一种同卵双胞胎法医检测试剂盒，其基于单分子实时dna测序技术对人体y染色体dyz1片段进行测序，具体包括：pcr扩增引物、ampurexpbeads纯化磁珠以及单分子测序相关试剂。在一个实施方案中，所述pcr扩增引物序列如下：正向：3’-cctttcctttcgcttgcattccat-5’反向：3’-cattgactggaaaggctgggtg-5’。在又一个实施方案中，所述pcr扩增引物序列如下：正向：3’-nnnnnnnnnnnnnnnncctttcctttcgcttgcattccat-5’反向：3’-nnnnnnnnnnnnnnnncattgactggaaaggctgggtg-5’；其中，所述引物序列中的nnnnnnnnnnnnnnnn为barcode序列，共16个碱基。其是根据pacbio公司公布的“barcode指南”而获得的。在另一个实施方案中，所述ampurexpbeads纯化磁珠用于对pcr扩增产物进行纯化。所述单分子测序相关试剂包括测序引物结合试剂、连接测序酶试剂以及magbeads纯化试剂。本发明的目的之二是提供一种采用所述同卵双胞胎法医检测试剂盒的检测方法，所述检测方法仅用于个体识别，具体步骤如下：1)采用所述pcr扩增引物扩增目的片段dyz1；2)采用ampurexpbeads纯化磁珠用于对pcr扩增产物进行纯化；3)单分子测序建库；4)上样测序比对获得结果。在一个实施方案中，所述单分子测序建库步骤分为：a、结合测序引物；b、结合测序酶；c、magbeads纯化。因此本专利技术通过使用单分子实时dna测序技术平台解决了dyz1在作为标记基因时测序困难的问题。第三代基因测序技术又被为"singlemoleculerealtime(smrttm)dnasequencing"(单分子实时dna测序技术)，该方法基于纳米孔的单分子读取技术，可快速读取序列。其优势非常明显，其测序读长很长：平均测序读长能达到3000至5000碱基，最长的序列能达到20000碱基。而且其准确率高：对基因组变异检测，可以最高达到99.999％的准确率；选用特殊测序模式，测序准确率可以在达到单个分子99％准确率的条件下，读长超过经典的sanger测序法。与sanger测序相比，pacbio的超长读长，可以跨越dyz1的重复区，测量出真实的dyz1序列，实现对dyz1准确度高，操作简便快捷的测序需要。附图说明图1：实施例2中不同引物序列的扩增结果，泳道1-10分别对应组1-10引物序列所扩增的引物片段具体实施方式还可进一步通过实施例来理解本发明，其中所述实施例说明了一些制备或使用方法。然而，要理解的是，这些实施例不限制本发明。现在已知的或进一步开发的本发明的变化被认为落入本文中描述的和以下要求保护的本发明范围之内。实施例1(一)扩增目的片段dyz1首先将3对同卵双胞胎的基因组样本进行编号：六个样品分别来自三对同卵双胞胎，样品1、2为一对，样品3、4为一对，样品5、6为一对。以其为模板对其进行pcr扩增。引物序列：正向：nnnnnnnnnnnnnnnn(pacbioindex16nt)cctttcctttcgcttgcattccat反向：nnnnnnnnnnnnnnnn(pacbioindex16nt)cattgactggaaaggctgggtgpcr体系(50ul)templatedna10nglataq(takara)0.5ul(2u)forwardprimer2ulreverseprimer2ul10xbuffer(含mg+)5uldntps5ulddh2o补齐50ul体系(二)磁珠法纯化dyz1扩增产物使用ampurexpbeads纯化磁珠。1、结合：将pcr扩增产物加入振荡混匀的磁珠结合液，颠倒混匀。将ep管置于磁力架上进行磁分离，弃废液(吸净管盖及管底残液)。2、洗涤：⑴加入洗涤液(75％乙醇溶液)，点振数次(若有团状或丝状物可增加点振次数及力度)，然后磁分离，将混合物放置于磁力架上，吸净管盖及管底的残液；⑵再次加入洗涤，点振数次(若有团状或丝状物可增加点振次数及力度)，然后磁分离，吸净管盖及管底的残液；⑶重复步骤⑵一次；⑷室温下开盖干燥。3、洗脱：加入洗脱液，室温孵育5分钟后，放置于磁力架上使溶液与磁珠分离，小心吸取上清液至新的ep管中，进行下游实验。(三)pacbio建库并进行单分子测序使用pacbio公司smrtbell模板制备试剂盒。由于使用约3000bp的扩增片段进行测序，既略过dna打断、修复、补平末端等步骤。文库构建流程1)平末端连接1、首先按照下表配置连接反应体系：成分体积(ul)dna(纯化后)31annealbluntadapter(20um)2templateprepbuffer4atplow2ligase1h2o补齐40ul总体积402.混匀后25℃孵育过夜。3.65℃孵育10分钟使连接酶失活,混合体系命名为ligateddna，4℃保存.2)去掉连接失败产物按下表各组分轻柔混合体系37℃孵育1小时,4℃储存.在此步骤完成后需要纯化dna。成分体积(ul)ligateddna40exoiii0.5exovii0.5总体积413)磁珠纯化1.加入18.9ul清洗后的ampurexpbeads(即42ul的0.45x)置于振荡器上2000r/min震荡10min。2.离心后磁力架上静置5min，弃上清后加200ul70％乙醇清洗两次，不要吹打。3.晾干30s，加入50uleb，置于振荡器上2000r/min振荡1min，回收上清。4.加入22.5ul清洗后的ampurexpbeads(50ul的0.45x)，置于振荡器上2000r/min振荡10min。5.离心后磁力架上静置5min，弃上清后加入200ul70％乙醇清洗两次不要吹打6.晾干30s,加入10uleb，置于振荡器上2000r/min振荡1min，回收上清。7.利用q-bit测定文库浓度，计算测序引物用量。8.利用agilentbioanalyzer2100检测文库片段大小，也可以用bluepippin切胶回收片段。上机测试准备1)测序引物结合稀释测序引物成分体积(ul)sequenceprimerv21elutionbuffer32.3总体积33.3置于pcr仪上，80℃反应2min，之后冰上放置。在200ul低吸附管内混合文库与测序引物，此步骤需要通过软件calculator计算。体系混合好后置于pcr仪上，20℃反应30min。成分体积(ul)h2o0.9910xprimerbuffer0.89文库6稀释后引物0.98总体积(产物-1)8.662)结合测序酶1、首先对测序酶按下表进行稀释。成分体积(ul)sa-dnapolymerasep6(500nmol/l)1.5bindingbuffer13.5总体积152、取新1.5mlep管，然后按下表依次加入以下试剂混匀。置于pcr仪上，30℃，30min；4℃保持。(不需设置热盖)成分体积(ul)dntp1.5dtt13.5bindingbuffer15混合制备好的文库(产物-1)8.86稀释后的酶1.5补水至总体积(产物-2)14.863)magbeads纯化1、取新1.5ml离心管，加入下表组分，混合备用成分体积(ul)magbeadbindingbuffer8.5产物-20.5总体积92、取新的1.5ml离心管加入35ulmagbeads，磁力架上静置5min，弃上清。3、加入35ulmagbeadswashbuffer，震荡混匀，磁力架上静置5min，弃上清。4、重复步骤35、加入9ul步骤2稀释的样品，4℃旋转混匀20min6、加入18ulmagbeadsbindingbuffer，磁力架上静置5分钟，弃上清7、重复步骤68、加入45ulmagbeadsbindingbuffer，磁力架上静置5min，转上清至样品板，准备上机上机前添加p6intercontrol到样品中，监测器pipette吸样，p6加样方式式扩散。4)上样顺序上机前30min从-20℃冰箱取出试剂板，在4℃避光融化；融化后1000r/min，离心1min，撕膜加垫，将试剂板、mix板、样品板、酶和油放入测序仪。放置枪头smrtcell，点击“close”，关闭机器舱盖。点击“scan”，仪器自动检测放入的加样板，识别后点击“start”，机器开始运行。(四)数据分析-分析同卵双胞胎之间测序结果的差异。六个样品分别来自三对同卵双胞胎，样品1、2为一对，样品3、4为一对，样品5、6为一对。其六个样品之间的测序所得结果互相比较，所有测出序列中不存在完全一样的两条序列，样品间两两比较得出互相之间的一致性，分别在表中列出已执行最低的结果和一致性最高的结果。样品1样品2样品3样品4样品5样品6一致性最低97.21％97.05％96.64％97.02％97.12％97.54％一致性最高99.64％99.58％99.73％99.67％99.58％99.64％我们发现，同卵双胞胎之间y染色体的dyz1区域是存在明显差异的，这与其常染色体的情况不同，证实了可以根据这一位点的序列差异对其进行区分。以样品1为例：1.ccs>3单分子测序循环数在3以上的数据：共21,120条能在序列两端检索到扩增引物的序列15,067条,且不存在序列完全相同的两条序列。测序结果与y染色体参考序列比对后，14905条序列完全可以比对上，一致率为81.93～99.61％与y染色体参考序列比对到28个位置，一致率在93.92-99.61％。2.ccs>6单分子测序循环数在6以上的数据：共12,902条能在序列两端检索到扩增引物的序列10,327条,且不存在序列完全相同的两条序列。测序结果与y染色体参考序列比对后，10,254条序列完全可以比对上，一致率为81.93～99.61％与y染色体参考序列比对到27个位置。实施例2引物设计选择按照实施例1的步骤一的技术方案，设计不同的引物对进行扩增，以评价引物特异性，具体引物如下：组1f：ctatacatgactctgccctttcctttcgcttgcattccat组1r：gcgcacgcactacagacattgactggaaaggctgggtg组2f：tactagagtagcactccctttcctttcgcttgcattccat组2r：acactgacgtcgcgaccattgactggaaaggctgggtg组3f：tgtgtatcagtacatgcctttcctttcgcttgcattccat组3r：cgtctatatacgtatacattgactggaaaggctgggtg组4f：acacgcatgacacactcctttcctttcgcttgcattccat组4r：atagagactcagagctcattgactggaaaggctgggtg组5f：gatctctactatatgccttctactgcatacaatttcactcc组5r：tagatgcgagagtagagaataaagtggaatgctacggtctc组6f：acagtctatactgctgcttctactgcatacaatttcactcc组6r：catagcgactatcgtggaataaagtggaatgctacggtctc组7f：atgatgtgctacatctcttctactgcatacaatttcactcc组7r：catcactacgctagatgaataaagtggaatgctacggtctc组8f：ctgcgtgctctacgaccttctactgcatacaatttcactcc组8r：cgcatctgtgcatgcagaataaagtggaatgctacggtctc组9f：gcgcgatacgatgactcttctactgcatacaatttcactcc组9r：tatgtgatcgtctctcgaataaagtggaatgctacggtctc组10f：tcagacgatgcgtcatcttctactgcatacaatttcactcc组10r：cgcgctcagctgatcggaataaagtggaatgctacggtctc上述引物序列中，下划线部分为barcode序列，除barcode序列外，组1-4序列相同，组5-10序列相同，具体扩增结果参见图1，从图1可以看出，组1-4的引物序列条带大小比较均一，经后续测序证明所扩增片段为dyz1基因位点，引物特异性好。而组5-10引物序列条带均一性差，扩增效果不佳。本
发明内容仅仅举例说明了要求保护的一些具体实施方案，其中一个或更多个技术方案中所记载的技术特征可以与任意的一个或多个技术方案相组合，这些经组合而得到的技术方案也在本申请保护范围内，就像这些经组合而得到的技术方案已经在本发明公开内容中具体记载一样。当前第1页12