本发明属于分子生物学领域，涉及一种采用分子生物学手段鉴定中药的方法，具体为一种用于鉴定中药当归的引物对及其应用。
背景技术：
：当归为伞形科当归属植物当归的干燥根，性温，味甘、辛。有和血之效，具有补血、活血、调经止痛、润燥滑肠的功能。由于临床上对当归的使用较多，使得当归需求量极大，因此，市场上当归的混伪品层出不穷。市场上常见的当归混伪品有欧当归、日本当归、阿坝当归、重齿毛当归等，这些植物在根茎形态上与正品当归十分类似，但在药效方面相差甚远，严重影响用药安全。目前市售药材多为加工品，当归与其混伪品的表面性状、纤维特征甚至化学成分都及其相似，在实际应用中药进行准确鉴别难度极大，且存在主观性大，通用性差，且对观察者经验要求高等缺陷，不利于标准化、规范化方法的建立及普及。dna分子遗传标记具有快速、微量、准确且特异性强等特征，为解决药材的鉴别问题提供了客观而有效的手段。前人对当归的分子鉴别主要采用nrdna-its序列。现有技术中对于当归鉴定多是基于当归的核基因片段或叶绿体基因片段。其中叶绿体基因片段多为单拷贝，在大多数被子植物中是母系遗传，与核基因序列相比，不受网状进化的影响。但是在中药材鉴别中，通常用到药材加工品或饮片，其基因组dna已遭到不同程度的破坏，而叶绿体基因组则相对于核基因组易于保留，其基因片段更容易扩增。技术实现要素：本发明的目的是：为了克服现有技术的缺陷，获得一种稳定性好，能够以痕迹量或破碎片段为检材的引物对，本发明提供了一种用于鉴定中药当归的引物对及其应用。技术方案：一种用于鉴定中药当归的引物对，所述引物对及其序列为：p1，seqidno.1～2；p2，seqidno.3～4；p3，seqidno.5～6。优选的，所述引物对p1、p2和p3的上游引物的5’端加上特异性的gc发卡结构，所述发卡结构的长度为40bp，序列为seqidno.7。表1引物对及发卡结构序列名称序列(5’-3’)seqidno.p1-fgcatgcgatacttggtgtgaat1p1-rcgacgcttctccagactacaat2p2-fggcgaaatcggtagacgctacg3p2-rggatttgaactggtgacacgag4p3-fggcaaagagggaagatttcg5p3-rgccataagcatatcttgagttg6发卡结构cgcccgccgcgcgcggcgggcggggcgggggcacgggggg7所述引物对在制备鉴定中药当归试剂盒中的应用。优选的，所述试剂盒的组分包括：引物对、dntp、dna聚合酶、lcgreen、反应缓冲液。优选的，所述试剂盒鉴定中药当归的步骤包括：(1)提取当归样品的基因组dna；(2)以步骤(1)提取的基因组dna为模板，以p1为特异性引物，进行第一轮pcr扩增；(3)取步骤(2)的扩增产物，稀释20～200倍后作为第二轮pcr的模板，以p2作为特异性引物，进行第二轮pcr扩增；(4)取第二轮pcr扩增的产物，稀释10～100倍后作为第三轮pcr的模板，以p3作为特异性引物，进行第三轮pcr扩增；(5)收集第三轮pcr扩增的产物，并采用琼脂糖凝胶电泳检测。优选的，所述当归样品的基因组dna的提取方法是试剂盒法或改良ctab法。优选的，所述pcr扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35个循环；72℃，7min。有益效果：(1)本发明所述引物对稳定性好，能够以痕迹量或破碎片段为检材；(2)本发明所述引物对特异性好，灵敏度高。附图说明图1是实施例1～3pcr鉴定结果电泳图；其中m为分子量为2000的maker；1为实施例1pcr产物鉴定结果；2为实施例2pcr产物鉴定结果；3为实施例3pcr产物鉴定结果。具体实施方式实施例1一种用于鉴定中药当归的引物对，所述引物对及其序列为：p1，seqidno.1～2；p2，seqidno.3～4；p3，seqidno.5～6。所述引物对p1、p2和p3的上游引物的5’端加上特异性的gc发卡结构，所述发卡结构的长度为40bp，序列为seqidno.7。所述引物对在制备鉴定中药当归试剂盒中的应用。所述试剂盒的组分包括：引物对、dntp、dna聚合酶、lcgreen、反应缓冲液。所述试剂盒鉴定中药当归的步骤包括：(1)提取当归样品的基因组dna；(2)以步骤(1)提取的基因组dna为模板，以p1为特异性引物，进行第一轮pcr扩增；(3)取步骤(2)的扩增产物，稀释20倍后作为第二轮pcr的模板，以p2作为特异性引物，进行第二轮pcr扩增；(4)取第二轮pcr扩增的产物，稀释100倍后作为第三轮pcr的模板，以p3作为特异性引物，进行第三轮pcr扩增；(5)收集第三轮pcr扩增的产物，并采用琼脂糖凝胶电泳检测。所述当归样品的基因组dna的提取方法是试剂盒法或改良ctab法。所述pcr扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35个循环；72℃，7min。实施例2一种用于鉴定中药当归的引物对，所述引物对及其序列为：p1，seqidno.1～2；p2，seqidno.3～4；p3，seqidno.5～6。所述引物对p1、p2和p3的上游引物的5，端加上特异性的gc发卡结构，所述发卡结构的长度为40bp，序列为seqidno.7。所述引物对在制备鉴定中药当归试剂盒中的应用。所述试剂盒的组分包括：引物对、dntp、dna聚合酶、lcgreen、反应缓冲液。所述试剂盒鉴定中药当归的步骤包括：(1)提取当归样品的基因组dna；(2)以步骤(1)提取的基因组dna为模板，以p1为特异性引物，进行第一轮pcr扩增；(3)取步骤(2)的扩增产物，稀释200倍后作为第二轮pcr的模板，以p2作为特异性引物，进行第二轮pcr扩增；(4)取第二轮pcr扩增的产物，稀释10倍后作为第三轮pcr的模板，以p3作为特异性引物，进行第三轮pcr扩增；(5)收集第三轮pcr扩增的产物，并采用琼脂糖凝胶电泳检测。所述当归样品的基因组dna的提取方法是试剂盒法或改良ctab法。所述pcr扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35个循环；72℃，7min。实施例3一种用于鉴定中药当归的引物对，所述引物对及其序列为：p1，seqidno.1～2；p2，seqidno.3～4；p3，seqidno.5～6。所述引物对p1、p2和p3的上游引物的5’端加上特异性的gc发卡结构，所述发卡结构的长度为40bp，序列为seqidno.7。所述引物对在制备鉴定中药当归试剂盒中的应用。所述试剂盒的组分包括：引物对、dntp、dna聚合酶、lcgreen、反应缓冲液。所述试剂盒鉴定中药当归的步骤包括：(1)提取当归样品的基因组dna；(2)以步骤(1)提取的基因组dna为模板，以p1为特异性引物，进行第一轮pcr扩增；(3)取步骤(2)的扩增产物，稀释180倍后作为第二轮pcr的模板，以p2作为特异性引物，进行第二轮pcr扩增；(4)取第二轮pcr扩增的产物，稀释30倍后作为第三轮pcr的模板，以p3作为特异性引物，进行第三轮pcr扩增；(5)收集第三轮pcr扩增的产物，并采用琼脂糖凝胶电泳检测。所述当归样品的基因组dna的提取方法是试剂盒法或改良ctab法。所述pcr扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35个循环；72℃，7min。如图1所示，将实施例1～3的扩增产物进行电泳检测，条带清晰可见，产物单一。sequencelisting<110>苏州市李良济健康产业有限公司<120>一种用于鉴定中药当归的引物对及其应用<130><160>7<170>patentinversion3.3<210>1<211>22<212>dna<213>人工序列<400>1gcatgcgatacttggtgtgaat22<210>2<211>22<212>dna<213>人工序列<400>2cgacgcttctccagactacaat22<210>3<211>22<212>dna<213>人工序列<400>3ggcgaaatcggtagacgctacg22<210>4<211>22<212>dna<213>人工序列<400>4ggatttgaactggtgacacgag22<210>5<211>20<212>dna<213>人工序列<400>5ggcaaagagggaagatttcg20<210>6<211>22<212>dna<213>人工序列<400>6gccataagcatatcttgagttg22<210>7<211>40<212>dna<213>人工序列<400>7cgcccgccgcgcgcggcgggcggggcgggggcacgggggg40当前第1页12