本发明属于分子生物学领域，涉及一种采用分子生物学手段检测微生物耐药基因的方法，具体为一种用于检测巴氏杆菌氯霉素类药物耐药基因的分子标记及其应用。
背景技术：
：氯霉素类抗生素主要是通过抑制细菌70s核糖体与50s亚基结合，干扰细菌蛋白质的合成，对g+和g-菌均有抑制作用，是一种广谱抗生素，包括氯霉素、甲砜霉素和弗苯尼考。氯霉素是第一代氯霉素类抗生素，由于此药会导致再生障碍性贫血，美国及欧盟于1996年，我国于2002年3月，已经禁止使用于食用动物。现主要作为外用药使用，如氯霉素滴眼液、氯霉素搽剂等。甲砜霉素抗菌作用比氯霉素强2～5倍，从上世纪90年代开始在我国大量用于畜禽养殖业，但随着应用的广泛，耐药菌逐渐增多，治疗效果较差。目前在养殖业中已经很少使用，仅与其他药物配合使用治疗人支原体、衣原体和淋球菌感染。取而代之的是氯霉素类新一代抗生素弗苯尼考，其抗菌谱与抗菌活性均优于氯霉素与甲砜霉素，对多种革兰氏阳性菌和格兰仕阴性菌及支原体等均有作用，且毒副作用小，是一种新型兽用抗生素。主要用于治疗畜禽的细菌性疾病和霉形体病和鱼类的细菌性疾病，尤以对呼吸系统感染和消化道感染疗效显著，在畜牧业及水产养殖业上有着广阔的应用前景。细菌耐药性已经对全世界人类和动物的健康造成了巨大的威胁，引起了各国的高度关注。目前虽然检测细菌耐药性方法很多，但还没有能够快速、敏感、特异的检测细菌耐药基因的试剂盒。技术实现要素：本发明的目的是：为了克服现有技术的缺陷，为氯霉素耐药性检测提供快速、敏感、特异性强的手段，弥补国内外在细菌氯霉素类药物耐药基因pcr快速检测的空缺，本发明提供了一种用于检测巴氏杆菌氯霉素类药物耐药基因的分子标记及其应用。技术方案：一种用于检测巴氏杆菌氯霉素类药物耐药基因的分子标记，所述分子标记及其序列为：p1，seqidno.1～2；p2，seqidno.3～4；p3，seqidno.5～6。优选的，所述分子标记p1、p2和p3的上游引物5’端进行氨基化修饰并附加10个碱基t。表1分子标记序列名称序列(5’-3’)seqidno.p1-fnh2-t(10)tgccagcagtgccgtccat1p1-rcaccgcccaagcagaagta2p2-fnh2-t(10)ggctttcgtcattgcgtctc3p2-ratcggtaggatgaaggtgagga4p3-fnh2-t(10)gaccagaccgttcagctggat5p3-rcctgccactcatcgcagtac6所述分子标记在制备检测巴氏杆菌氯霉素类药物耐药基因试剂盒中的应用。优选的，所述试剂盒的组分包括：分子标记、dntp、lataq、pcr反应缓冲液、mgcl2、双蒸水。优选的，所述试剂盒检测巴氏杆菌氯霉素类药物耐药基因的步骤包括：(1)取样：选取纯化后的巴氏杆菌，划线接种培养基，形成单个菌落，向无菌ep管中加入10～60μl60％的甘油，用接种针挑取单菌落于甘油中洗涤数次，-20℃保存；(2)以步骤(1)收集的菌体作为pcr模板，以p1为特异性引物，进行第一轮pcr扩增；(3)取步骤(2)的扩增产物，稀释100～500倍后作为第二轮pcr的模板，以p2作为特异性引物，进行第二轮pcr扩增；(4)取第二轮pcr扩增的产物，稀释20～100倍后作为第三轮pcr的模板，以p3作为特异性引物，进行第三轮pcr扩增；(5)收集第三轮pcr扩增的产物，并采用琼脂糖凝胶电泳检测。优选的，所述pcr扩增的体系为25μl：模板2μl、pcr反应缓冲液2.5μl、dntp2μl、lataq2μl、分子标记1μl、双蒸水15.5μl。优选的，所述第一轮pcr扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35个循环；72℃，7min。优选的，所述第二轮pcr扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，45s，35个循环；72℃，5min。优选的，所述第三轮pcr扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，35s，35个循环；72℃，4min。有益效果：(1)本发明所述分子标记为氯霉素耐药性检测提供快速、敏感、特异性强的手段；(2)所述分子标记弥补国内外在细菌氯霉素类药物耐药基因pcr快速检测的空缺，为调查我国氯霉素类耐药基因的流行情况提供参考数据。附图说明图1是实施例1～3检测结果图；其中，m为分子量为1500bp的maker；1为实施例1pcr产物电泳结果；2为实施例2pcr产物电泳结果；3为实施例3pcr产物电泳结果。具体实施方式实施例1一种用于检测巴氏杆菌氯霉素类药物耐药基因的分子标记，所述分子标记及其序列为：p1，seqidno.1～2；p2，seqidno.3～4；p3，seqidno.5～6。所述分子标记p1、p2和p3的上游引物5’端进行氨基化修饰并附加10个碱基t。所述分子标记在制备检测巴氏杆菌氯霉素类药物耐药基因试剂盒中的应用。所述试剂盒的组分包括：分子标记、dntp、lataq、pcr反应缓冲液、mgcl2、双蒸水。所述试剂盒检测巴氏杆菌氯霉素类药物耐药基因的步骤包括：(1)取样：选取纯化后的巴氏杆菌，划线接种培养基，形成单个菌落，向无菌ep管中加入10μl60％的甘油，用接种针挑取单菌落于甘油中洗涤数次，-20℃保存；(2)以步骤(1)收集的菌体作为pcr模板，以p1为特异性引物，进行第一轮pcr扩增；(3)取步骤(2)的扩增产物，稀释100倍后作为第二轮pcr的模板，以p2作为特异性引物，进行第二轮pcr扩增；(4)取第二轮pcr扩增的产物，稀释100倍后作为第三轮pcr的模板，以p3作为特异性引物，进行第三轮pcr扩增；(5)收集第三轮pcr扩增的产物，并采用琼脂糖凝胶电泳检测。所述pcr扩增的体系为25μl：模板2μl、pcr反应缓冲液2.5μl、dntp2μl、lataq2μl、分子标记1μl、双蒸水15.5μl。所述第一轮pcr扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35个循环；72℃，7min。所述第二轮pcr扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，45s，35个循环；72℃，5min。所述第三轮pcr扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，35s，35个循环；72℃，4min。实施例2一种用于检测巴氏杆菌氯霉素类药物耐药基因的分子标记，所述分子标记及其序列为：p1，seqidno.1～2；p2，seqidno.3～4；p3，seqidno.5～6。所述分子标记p1、p2和p3的上游引物5’端进行氨基化修饰并附加10个碱基t。所述分子标记在制备检测巴氏杆菌氯霉素类药物耐药基因试剂盒中的应用。所述试剂盒的组分包括：分子标记、dntp、lataq、pcr反应缓冲液、mgcl2、双蒸水。所述试剂盒检测巴氏杆菌氯霉素类药物耐药基因的步骤包括：(1)取样：选取纯化后的巴氏杆菌，划线接种培养基，形成单个菌落，向无菌ep管中加入30μl60％的甘油，用接种针挑取单菌落于甘油中洗涤数次，-20℃保存；(2)以步骤(1)收集的菌体作为pcr模板，以p1为特异性引物，进行第一轮pcr扩增；(3)取步骤(2)的扩增产物，稀释300倍后作为第二轮pcr的模板，以p2作为特异性引物，进行第二轮pcr扩增；(4)取第二轮pcr扩增的产物，稀释50倍后作为第三轮pcr的模板，以p3作为特异性引物，进行第三轮pcr扩增；(5)收集第三轮pcr扩增的产物，并采用琼脂糖凝胶电泳检测。所述pcr扩增的体系为25μl：模板2μl、pcr反应缓冲液2.5μl、dntp2μl、lataq2μl、分子标记1μl、双蒸水15.5μl。所述第一轮pcr扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35个循环；72℃，7min。所述第二轮pcr扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，45s，35个循环；72℃，5min。所述第三轮pcr扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，35s，35个循环；72℃，4min。实施例3一种用于检测巴氏杆菌氯霉素类药物耐药基因的分子标记，所述分子标记及其序列为：p1，seqidno.1～2；p2，seqidno.3～4；p3，seqidno.5～6。所述分子标记p1、p2和p3的上游引物5’端进行氨基化修饰并附加10个碱基t。所述分子标记在制备检测巴氏杆菌氯霉素类药物耐药基因试剂盒中的应用。所述试剂盒的组分包括：分子标记、dntp、lataq、pcr反应缓冲液、mgcl2、双蒸水。所述试剂盒检测巴氏杆菌氯霉素类药物耐药基因的步骤包括：(1)取样：选取纯化后的巴氏杆菌，划线接种培养基，形成单个菌落，向无菌ep管中加入60μl60％的甘油，用接种针挑取单菌落于甘油中洗涤数次，-20℃保存；(2)以步骤(1)收集的菌体作为pcr模板，以p1为特异性引物，进行第一轮pcr扩增；(3)取步骤(2)的扩增产物，稀释500倍后作为第二轮pcr的模板，以p2作为特异性引物，进行第二轮pcr扩增；(4)取第二轮pcr扩增的产物，稀释20倍后作为第三轮pcr的模板，以p3作为特异性引物，进行第三轮pcr扩增；(5)收集第三轮pcr扩增的产物，并采用琼脂糖凝胶电泳检测。所述pcr扩增的体系为25μl：模板2μl、pcr反应缓冲液2.5μl、dntp2μl、lataq2μl、分子标记1μl、双蒸水15.5μl。所述第一轮pcr扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35个循环；72℃，7min。所述第二轮pcr扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，45s，35个循环；72℃，5min。所述第三轮pcr扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，35s，35个循环；72℃，4min。sequencelisting<110>苏州乔纳森新材料科技有限公司<120>一种用于检测巴氏杆菌氯霉素类药物耐药基因的分子标记及其应用<130><160>6<170>patentinversion3.3<210>1<211>19<212>dna<213>人工序列<400>1tgccagcagtgccgtccat19<210>2<211>19<212>dna<213>人工序列<400>2caccgcccaagcagaagta19<210>3<211>20<212>dna<213>人工序列<400>3ggctttcgtcattgcgtctc20<210>4<211>22<212>dna<213>人工序列<400>4atcggtaggatgaaggtgagga22<210>5<211>21<212>dna<213>人工序列<400>5gaccagaccgttcagctggat21<210>6<211>20<212>dna<213>人工序列<400>6cctgccactcatcgcagtac20当前第1页12