本发明涉及基因工程技术和诊断试剂领域，具体涉及一种用于检测风疹病毒抗体的融合蛋白及其制备方法。
背景技术：
风疹病毒(rubellavirus，rv)是披膜病毒科风疹病毒属的唯一成员，唯一的自然宿主是人，但实验室可以感染猴、鼠等野生和实验动物。风疹是一种非常温和的疾病，通常只引起皮疹、颌下淋巴结肿大和其他轻微的体征。但对儿童和孕妇，风疹的后果很严重。孕期前12周感染可导致胎儿先天风疹感染和80-90％的患者孕妇流产。胎儿的先天性感染会导致先天性风疹综合征，累及多器官多系统，并存在长期的活性感染。
风疹病毒基因组为单股正链rna，风疹病毒有3中结构蛋白，分别是胞膜糖蛋白e1、e2和核壳蛋白c。c蛋白富含脯氨酸和精氨酸，与病毒rna结合构成核衣壳，在病毒从一个宿主细胞感染另一个宿主细胞的过程中对病毒基因组起保护作用。e1和e2存在于病毒包膜表面，含有能刺激宿主产生相应免疫应答的抗原表位。e1是风疹病毒的重要抗原，虽然整个氨基酸序列在不同毒株之间存在一定差异，但是在抗原决定簇集中区域却是保守一致的。e2蛋白的生物学性至今尚未明确，在e1-e2复合物中，e2表位可能被e1遮盖，所以在风疹病毒感染中诱导低水平的免疫反应。
风疹病毒感染临床症状和其他病毒感染症状有一定的相似性，所以临床诊断准确性增加了一些难度。风疹病毒感染诊断主要以血清学诊断为主，细胞培养抗原的纯化难以排除细胞蛋白成分，抗原纯度不高导致诊断灵敏度和特异性较差，所以筛选高敏感性和特异性的重组抗原是研制风疹病毒诊断的关键。
技术实现要素：
本发明的目的在于是：针对现有技术存在的不足，提供一种高敏感性、高特异性、可提高检测率的检测风疹病毒抗体的融合蛋白。
为了实现上述目的，本发明的技术方案是：
一种检测风疹病毒抗体的融合蛋白，所述融合蛋白为包含风疹病毒e1蛋白片段i、风疹病毒e1蛋白片段ii和风疹病毒c蛋白片段的融合蛋白，所述e1蛋白片段i分布在融合蛋白的n端，所述e1蛋白片段ii分布在中间，所述c蛋白片段分布在融合蛋白的c端，且所述e1蛋白片段i、e1蛋白片段ii和c蛋白片段之间通过甘氨酸-甘氨酸-丝氨酸连接。
作为一种改进的技术方案，所述e1蛋白片段i为e1蛋白片段中第9个氨基酸至第116个氨基酸，所述e1蛋白片段ii为e1蛋白片段中第208个氨基酸至第293个氨基酸，所述c蛋白片段为c蛋白片段中第212个氨基酸至第243个氨基酸。
作为一种改进的技术方案，所述e1蛋白片段i具有seqidno:1所示的氨基酸序列，所述e1蛋白片段ii具有seqidno:2所示的氨基酸序列，所述c蛋白片段具有seqidno:3所示的氨基酸序列。
作为一种改进的技术方案，所述融合蛋白具有seqidno:4所示的氨基酸序列。
作为一种改进的技术方案，所述融合蛋白的基因序列如seqidno:5所示，所述基因序列前后两端分别有ncoi和ndei两种限制性内切酶。
本发明的另一个目的在于是：针对现有技术存在的不足，提供一种检测风疹病毒抗体的融合蛋白的制备方法。
为了实现上述目的，本发明的技术方案是：
一种检测风疹病毒抗体的融合蛋白的制备方法，其特征在于所述制备方法包括下列步骤：
(1)抗原表位的筛选及基因片段的化学合成
利用在线分析工具分析，筛选出风疹病毒e1蛋白的第9个氨基酸至第116个氨基酸、e1蛋白的第208个氨基酸至293个氨基酸及风疹病毒c蛋白的第212个氨基酸至第243个氨基酸；化学合成风疹病毒e1蛋白片段i、e1蛋白片段ii和c蛋白片段串联的基因序列；
(2)表达e1蛋白片段i、e1蛋白片段ii和c蛋白片段的融合蛋白重组质粒的构建
提取pgem-5zf，用ncol和ndel双酶切，电泳后胶回收双酶切的质粒片段；用ncol和ndel双酶切化学合成的风疹病毒融合蛋白基因片段，电泳回收双酶切的基因片段，-20℃备用；将双酶切的质粒片段和双酶切的基因片段按1:3-10比例，用t4连接酶16℃过夜连接，连接后的重组质粒为pgem-5zf-e1+eii+c；
(3)重组质粒的筛选和鉴定
将重组质粒转化大肠杆菌bl21(de3),涂布含氨苄青霉素的lb平板上，37℃恒温培养箱过夜；次日随机挑取转化菌落和对照菌落，分别提取质粒，分别用ndel和ncol双酶切，酶切后跑电泳，均能看见相应的目的片段和载体，构建表达载体成功，即为阳性表达菌；
作为一种改进的技术方案，所述制备方法还包括下列步骤：
重组蛋白工程菌高效表达：
将阳性表达菌接种至含氨苄青霉素的lb培养基中，37℃恒温摇床振荡4h，加终浓度为0.5-1.5mmol/liptg，37℃条件下继续诱导3-4h，离心收集沉淀菌体，将沉淀菌体进行破碎，取上清和沉淀分别进行sds-page检测，上清中得到表达的目的蛋白；
表达蛋白的纯化：
将重组蛋白工程菌在4℃条件下以8000-12000rpm的转速离心8-12min，将沉淀的菌体重悬于原离心体积的1/10裂解液内，冰浴超声菌体，在4℃条件下以10000-13000rpm的转速离心25-35min，收集菌液上清；用平衡液冲洗平衡镍离子亲和层析柱后，将超声收集的菌液上清直接上柱，上样结束后用平衡液洗涤柱子，依次用洗脱液洗脱蛋白，收集各洗脱峰蛋白，sds-page电泳检测各峰蛋白。
作为一种改进的技术方案，表达蛋白的纯化步骤中的裂解液由50mmtris-hcl、10mmedta、15mmnacl、10mmdtt组成。
作为一种改进的技术方案，表达蛋白的纯化步骤中的洗脱液为浓度20-500mm的咪唑洗脱液。
本发明采用以上技术方案，与现有技术相比，具有以下优点：
(1)分析e1蛋白和c蛋白氨基酸序列，挑选抗原性比较强的部分片断，大大提高了表达的产量和特异性，大大提高了临床漏检率；
(2)表达e1蛋白片段i、e1蛋白片段ii和c蛋白片段的融合蛋白用作检测抗原，有效解决了现有技术中分别重组e1部分蛋白和c蛋白的检测用抗原，生产时要同时制备几个表达蛋白所存在的耗费时间和成本的问题；
(3)表达风疹病毒e1蛋白片段i、e1蛋白片段ii和c蛋白片段的融合蛋白以可溶形式存在，易于纯化。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
一种检测风疹病毒抗体的融合蛋白，融合蛋白为包含风疹病毒e1蛋白片段i、风疹病毒e1蛋白片段ii和风疹病毒c蛋白片段的融合蛋白。其中e1蛋白片段i分布在融合蛋白的氨基端，e1蛋白片段ii分布在中间，c蛋白片段分布在融合蛋白的c端，且e1蛋白片段i、e1蛋白片段ii和c蛋白片段之间通过甘氨酸-甘氨酸-丝氨酸连接。其中e1蛋白片段i为e1蛋白片段中第9个氨基酸至第116个氨基酸，e1蛋白片段ii为e1蛋白片段中第208个氨基酸至第293个氨基酸，c蛋白片段为c蛋白片段中第212个氨基酸至第243个氨基酸。
实施例2
一种检测风疹病毒抗体的融合蛋白的制备方法，包括以下步骤：
(1)抗原表位的筛选及基因片段的化学合成
利用expasy、tmhmm、signalip4.1等在线分析工具分析，筛选出风疹病毒e1蛋白和c蛋白氨基酸序列全长，筛选出风疹病毒e1蛋白片段i(e1蛋白中含有较强抗原决定簇的第9个氨基酸至第116个氨基酸)、e1蛋白片段ii(e1蛋白中含有较强抗原决定簇的第208个氨基酸至293个氨基酸)及风疹病毒c蛋白片段(c蛋白中含有较强抗原决定簇的第212个氨基酸至第243个氨基酸)；化学合成风疹病毒e1蛋白片段i、e1蛋白片段ii和c蛋白片段串联的基因序列；
(2)表达e1蛋白片段i、e1蛋白片段ii和c蛋白片段的融合蛋白重组质粒的构建
提取pgem-5zf，用ncol和ndel双酶切，电泳后胶回收双酶切的质粒片段；用ncol和ndel双酶切化学合成的风疹病毒融合蛋白基因片段，电泳回收双酶切的基因片段，-20℃备用；将双酶切的质粒片段和双酶切的基因片段按1:3-10比例，用t4连接酶16℃过夜连接，连接后的重组质粒为pgem-5zf-e1+eii+c；
(3)重组质粒的筛选和鉴定
将重组质粒转化大肠杆菌bl21(de3),涂布含氨苄青霉素(60ug/ml)的lb平板上，37℃恒温培养箱过夜；次日随机挑取转化菌落和对照菌落(质粒pgem-5zf转化菌)，分别提取质粒，分别用ndel和ncol双酶切，酶切后跑电泳，均能看见相应的目的片段和载体，构建表达载体成功，即为阳性表达菌；
(4)重组蛋白工程菌高效表达
将阳性表达菌接种至2mllb培养基(60ug/ml氨苄青霉素)的试管中，37℃恒温摇床振荡4h，加终浓度为0.5mmol/liptg，37℃继续诱导6h，离心收集沉淀菌体，将沉淀菌体进行破碎，取上清和沉淀分别进行sds-page检测，上清中得到表达的目的蛋白；
(5)表达蛋白的纯化
挑选高效表达的重组蛋白工程菌单菌落，接种到含100mllb液体培养基的三角瓶中，加氨苄青霉素至终浓度60ug/ml，置37℃摇床内过夜。次日按菌液和lb培养基1:10接种至1000mllb(氨苄青霉素60ug/ml)培养液的三角瓶中，培养4h，加iptg(终浓度为0.5mmol/l)，37℃条件下继续诱导6h，将诱导表达融合蛋白的1000ml工程菌离心，高速(10000rpm)低温(4℃)离心10min，将沉淀的菌体重悬于原离心体积的1/10裂解液(50mmtris-hcl、10mmedta、15mmnacl、10mmdtt)内，冰浴超声菌体，高速(12000rpm)低温(4℃)离心30min，收集菌液上清。
用平衡液(20mmpbph7.4)冲洗平衡镍离子亲和层析柱后，将超声收集的菌液上清直接上柱，上样流速1.5ml/min，上样结束后用平衡液洗涤柱子，依次用含20、50、100、200、500mm浓度咪唑的洗脱液洗脱蛋白，收集各洗脱峰蛋白，sds-page电泳检测各峰蛋白。
实施例3
纯化的重组蛋白在检测风疹病毒抗体中的应用
将纯化的重组蛋白，用碳酸盐缓冲液(50mm，ph9.6)稀释后100ul/孔、100ng/孔的蛋白量包被酶联板，4℃过夜。洗涤后加200ul/孔10％小牛血清的pbs37℃水浴封闭2h，洗涤后4℃备用。
间接酶联免疫法检测抗风疹病毒阳性血清及正常人血清，结果显示融合蛋白能与抗风疹病毒阳性血清反应，不与正常人血清反应，说明该融合蛋白有较好的抗原性和特异性。
实施例4
风疹病毒融合蛋白的多抗血清的制备
将纯化的重组风疹病毒融合蛋白作抗原制备多抗血清，用抗原和佐剂联合免疫新西兰大耳白兔的方式，制备并纯化获得的兔抗血清，间接elisa法检测抗风疹病毒抗体滴度。
(1)主要试剂：完全弗氏佐剂和不完全弗氏佐剂为sigma公司产品。其他试剂为国产或进口分析纯试剂。
(2)免疫程序
融合蛋白作为免疫原，免疫5只新西兰大耳兔，每只免疫200ug抗原，免疫方式为背部多点免疫。第一次免疫使用完全弗氏佐剂与融合蛋白混合乳化；两周后第二次免疫，用不完全弗氏佐剂和融合蛋白混合乳化，免疫方式为背部多点免疫；三天后第三次免疫，用100ug的融合蛋白和相同体积的0.01mpbs(ph7.4)混合，免疫方式腹腔免疫；三天后同样免疫程序免疫一次。
(3)间接elisa测兔抗血清效价
最后一次免疫后三天，兔耳缘静脉取血，4000rpm离心10min获取兔抗血清。取融合蛋白用碳酸盐缓冲液(50mm，ph9.6)稀释后100ul/孔、100ng/孔的蛋白量包被酶联板，4℃过夜。次日20％小牛血清封闭，37℃水浴封闭2h，将兔抗血清梯度稀释作为一抗，37℃水浴孵育1h后，加1:5000二抗羊抗兔，加显色液显色。效价高至1:10000以上，说明融合蛋白有较好的抗原性和特异性。
本专利不局限于上述具体的实施方式，本领域的普通技术人员从上述构思出发，不经过创造性的劳动，所作出的种种变换，均落在本专利的保护范围之内。
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