一种促进植物提前开花的草莓转录因子及其应用的制作方法

技术领域：
：本发明属于分子生物学、基因工程
技术领域：
，具体涉及一种促进植物提前开花的草莓转录因子及其应用。
背景技术：
：：草莓是蔷薇科草莓属植物，草莓果实鲜美红嫩，果肉多汁，酸甜可口，且有特殊的浓郁水果芳香。草莓具有很高的营养价值，色、香、味俱佳。由于其独特的风味及营养物质丰富，是最为广泛的栽培浆果之一，并有‘水果皇后’美誉。开花是植物由营养生长转变为生殖生长的重要过程，是一个重要的农艺性状，它决定着植物是否适应于特定的栽培地区及生长季节。植物开花是植物从营养生长到生殖生长变化的关键。在外界环境和内在因子的影响下，植物会在适当的时机开花进而生殖生长。通过调节开花期，使植物延迟或提前开花，可以控制植物的营养生长或生殖生长，避免逆境对作物的伤害。在最适合的时期开花可以达到最大的效益，促进资源的积累、分配及有效利用，对提高作物产量意义重大。在长期的进化过程中，植物形成了一套完整的机制，用于调节自身的生长发育以适应或抵御外界生物和非生物胁迫，这一调控过程在分子层面上受到多基因形成的复杂网络的调控，由许多转录因子单独或协同调控实现。转录因子也称反式作用因子，其主要功能是激活或抑制基因的转录效应(arceetal.2008；jainm2008)。wrky转录因子家族是近十几年来发现的一类植物特有的转录因子，由于其n-末端含有高度保守的wrkygqk氨基酸序列而得名，在调控植物的生长、发育、代谢和胁迫反应中起着重要作用(rushtonetal.2010；苏琦2007)。对wrky转录因子研究最多的是其与抗病相关的机制，主要参与生物与非生物胁迫应答和植物衰老，有关对植物发育调控的研究报道很少，仅见参与调控了种子和表皮毛的发育(余迪求等2006；于延冲等2010)。迄今为止，关于它们参与植物开花调控的研究鲜有报道。技术实现要素：：(1)本发明提供了一种调控植物开花的草莓wrky转录因子fvwrky46，所述基因核苷酸序列如seqidno.1所示。所述的调控植物早花的草莓fvwrky46基因编码的蛋白质，具有序列表中seqidno.2所述的氨基酸序列。(2)本发明提供了含有上述草莓wrky转录因子fvwrky46的植物表达载体pri101-gfp。将fvwrky46基因克隆到pri101-gfp，获得pri101-gfp-camv35s-fvwrky46。(3)本发明所述基因fvwrky46在培育早花植物中的应用。具体是将fvwrky46基因通过表达载体转入目的植物内。所述植物优选是模式植物拟南芥。(4)本发明的有益效果：利用现有的植物基因工程技术，利用基因表达分析、基因克隆及序列分析技术，分离鉴定了草莓开花相关基因序列信息，并通过农杆菌介导的转化法将该基因转入拟南芥，鉴定证明转基因植株的抽薹及开花时间明显早于野生型(图5)，说明fvwrky46参与调节植物的开花过程。附图说明：图1fvwrky46基因编码区序列的扩增结果。图2荧光定量pcr分析不同组织器官中fvwrky46基因的表达情况。图3重组载体pri101-gfp-camv35s-fvwrky46的构建。(a)大肠杆菌wrky46-pmd18-tpcr检测电泳结果。(b)大肠杆菌pri101-gfp-camv35s-fvwrky46pcr检测电泳结果。(c)pri101-gfp-camv35s-fvwrky46的测序结果。图4转基因拟南芥抗性鉴定图5转基因拟南芥及野生型对照开花时期比较，转基因植株比野生型提早开花。具体实施方式：实施例1草莓wrky46基因的克隆(1)以二倍体森林草莓‘ruegen’为试材，材料在温室大棚中生长。(2)rna提取：用ctab法进行试验材料的总rna提取，整个操作过程按照ctab法rna提取流程，然后再以该总rna为模板反转录得到cdna第一链。(3)基因的克隆：以反转录的果实cdna第一链为模板，利用引物wrky46-f和wrky46-r进行pcr扩增，回收pcr产物，获得1107bp的目的片段。wrky46-f：gcaggtaccatgtcaaatgaaaagaaaagcccwrky46-r：gcagaattctggctcctccagcttgtgac注：wrky46-f和wrky46-r引物序列中前九个碱基，即gcaggtacc和gcagaattc，是构建载体需要，人为加入的不属于fvwrky46基因序列的酶切位点与保护碱基。wrky46-r引物由于构建gfp融合表达载体需要，去掉了终止密码子。实施例2植物表达载体的构建(1)胶回收目的片段之后，将其连接到pmd18-t载体(购自takara公司)，后转化大肠杆菌感受态细胞trans5α(购自北京全式金生物技术有限公司)，筛选阳性单菌落，提取质粒，测序。(2)选用ecorⅰ和kpnⅰ分别对测序正确的wrky46-pmd18-t重组质粒和pri101-gfp质粒双酶切，回收载体大片段和目的基因片段，用t4连接酶连接后转化大肠杆菌trans5α感受态细胞(购自北京全式金生物技术有限公司)，鉴定重组子后，得到带有目的基因的植物表达载体。实施例3转化拟南芥进行功能验证(1)浸花法侵染拟南芥。挑取一个含有目的基因wrky46的农杆菌gv3101阳性克隆，接种于lb+kan(卡那霉素)50mg/l+rif(利福平)25mg/l的液体yep培养基中，28℃200rpm振荡培养24h，取1ml培养好的菌液，加入50ml液体yep培养基活化，使od600＝0.8左右。将菌液转入无菌的50ml离心管中，5000rpm，10min离心收集菌种，再用同等体积的ms重悬液(1/2ms+0.5g/lmes+5％sucrose，ph5.7)重悬农杆菌，并加入表面活性剂silwet，使其终浓度达到0.03％(300μl/l)。将刚开花的拟南芥植株花序在此溶液中浸泡30s。将浸染菌液的拟南芥花序盖膜保湿，黑暗培养24小时左右，再揭膜置于光照下正常管理成熟收获种子。(2)转基因植株的抗性鉴定收集当代转基因植株种子(t0代)，播种于含有30mg/l卡那霉素的1/2ms固体培养基上筛选。将生长2周左右的绿色抗性植株转栽到营养钵里，基质为草炭、蛭石和珍珠岩比为5：3：1(体积比)。收集t1代种子。将该种子播种于含有30mg/l卡那霉素的1/2ms培养基上，选取阳性植株，收集t2代种子，将该种子播种于含有30mg/l卡那霉素的1/2ms培养基上，种子在培养基上全部为绿苗，证明t2代为纯合系。(3)转基因植株进行表型鉴定。将转基因拟南芥t2代植株(转入pri101-gfp-camv35s-fvwrky46表达载体的转基因拟南芥)和野生型拟南芥在短日照(8h光照/16h黑暗)条件下进行培养。每个株系测试15个单株，测试结果如表1所示。表1表型开花时间莲座叶野生型拟南芥3313.3±1.3株系1196.7±0.9株系2196.9±1.1与野生型拟南芥相比，转基因拟南芥抽薹及开花时莲座叶仅有7片叶，不同转基因株系都比野生型拟南芥提前开花，同等短日照培养条件下，野生型拟南芥需要33天开花，而转入fvwrky46基因的转基因拟南芥仅需要19天就能开花。根据结果表明，过量表达fvwrky46能促进拟南芥提前开花。这些结果表明，草莓fvwrky46为有功能的基因，具有促进生殖生长，缩短开花时间的作用。序列表seqidno:1atgtcaaatgaaaagaaaagcccttacctacagtatgaccctttcgattacaacccccacgaaatcgacaggtcaagctttccattcttcaattacagctctagttccatatacaatattccccaaacaccagcagacccccaaactcaaagcctacatggatttgaatctgatccttcgtatttgatgagcttcgccgactgcttaaatgggtcaatggactacaccaccctctcaaaagcctttgatatttcttgttcatcatctgaagtcatttctccgccgctgttagatcaggacgatcattcgaaaaacaaggctgcagctgctgttgtaggagatcaaaatccatccacaccgaactcatcgatatcttgttcatctaatgaagctggtgctgctcgtcatcatgagcatgaaaacaatcaagattcagataagatcagcaagaaagataagcatcagaaggtagtacagtcagctgaagaagctcctggagatcatgaagacgagtcaaagaaagtgaacaaggcaaaaaagaaagagaaacggcagagggaaccgcggttcgcgttcttgaccaagagtgaaattgatcatcttgaagatggctacagatggagaaagtacggacagaaggcagtcaagaatagcccttatcctagaagttattacagatgcactactcagaagtgcaatgtaaagaaacgtgtggagagatcgttccacgatccggcgactgtgatcacaacatatgaagggcagcacaaccatcaatgtccagcgacacttcgaggcagtatgaatgctgttggcatgttgacaccttcctttttgggaggattcgggaccagtaacaacggatccccaagatttccacaccaattattgttaactcaactgcttactccagtcgataacaaccaacttcaactgcaagctcaacatcattatgatccagcaggttctattttctactcaaatctcatgagtactcttcatcagaatcaaccgcagcagcagcagcagcatgtacatgttcctcatgactacaatttgttgcaagatttagctccctcatttagtcacaagctggaggagccatgaseqidno:2msnekkspylqydpfdynpheidrssfpffnyssssiynipqtpadpqtqslhgfesdpsylmsfadclngsmdyttlskafdiscsssevispplldqddhsknkaaaavvgdqnpstpnssiscssneagaarhhehennqdsdkiskkdkhqkvvqsaeeapgdhedeskkvnkakkkekrqreprfafltkseidhledgyrwrkygqkavknspyprsyyrcttqkcnvkkrversfhdpatvittyegqhnhqcpatlrgsmnavgmltpsflggfgtsnngsprfphqllltqlltpvdnnqlqlqaqhhydpagsifysnlmstlhqnqpqqqqqhvhvphdynllqdlapsfshkleepsequencelisting<110>沈阳农业大学<120>一种促进植物提前开花的草莓转录因子及其应用<130>2017-6-30<160>2<170>patentinversion3.3<210>1<211>1107<212>dna<213>人工合成<400>1atgtcaaatgaaaagaaaagcccttacctacagtatgaccctttcgattacaacccccac60gaaatcgacaggtcaagctttccattcttcaattacagctctagttccatatacaatatt120ccccaaacaccagcagacccccaaactcaaagcctacatggatttgaatctgatccttcg180tatttgatgagcttcgccgactgcttaaatgggtcaatggactacaccaccctctcaaaa240gcctttgatatttcttgttcatcatctgaagtcatttctccgccgctgttagatcaggac300gatcattcgaaaaacaaggctgcagctgctgttgtaggagatcaaaatccatccacaccg360aactcatcgatatc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